（食品科学专业论文）葵花籽粕的综合利用.pdf

摘要 摘要 本论文以我国资源丰富而又急待开发的葵花籽粕为研究对象，对葵花籽粕资源的综合利 用进行了较为系统的研究。主要研究了葵花籽粕蛋白的分离和其中富含的活性物质绿原酸的 分离纯化工艺，为综合利用葵花籽粕资源打下了基础。 首先建立了测定葵花籽粕中绿原酸的高效液相色谱方法。采用此方法，绿原酸可以得到 较好的分离。该方法简便、快速、准确、重现性好，适用于葵花籽粕中绿原酸的准确测定。 然后较为系统地研究了从葵花籽粕中提取绿原酸和蛋白质的工艺。考察了乙醇浓度、温 度、料液比、提取时间等因素对绿原酸提取率的影响，得到了绿原酸提取工艺的最佳参数： 乙醇浓度5 0 、温度6 0 、提取2 次、每次的料液比1 ：1 2 ( w v ) 和时间2 h 。在此条件下， 绿原酸的提取率为8 6 9 2 。同时还研究了从提取绿原酸后的葵花籽粕中提取蛋白质的影响 因素，确定了提取蛋白质的最佳工艺条件：n a c l 浓度l m o y l 、温度5 0 c 、料液比1 ：1 0 ( w v ) 、 控制时间1 1 5 h 和p h 7 9 。此时，蛋白质的提取率为3 8 5 8 。 接着采用有机溶剂萃取法对绿原酸进行分离纯化。确定了乙酸乙酯作为绿原酸的萃取剂， 同时考察了影响萃取效果的因素，得到了最佳萃取条件：原料液中绿原酸浓度1 0 0 m g m l 左 右、p h 2 0 、分3 次萃取、每次3 m i n 左右、每次乙酸乙酯与原料液的体积比为2 ：1 。在此条 件下，可得到黄色晶状体绿原酸产品，其纯度为5 5 8 2 ，得率为6 7 1 5 。 在此基础上，研究了大孔吸附树脂对绿原酸的分离纯化效果。从1 4 种大孔吸附树脂中筛 选出对绿原酸分离纯化效果较为理想的d m 3 0 1 树脂，考察了影响其对绿原酸分离纯化效果的 因素，确定了最佳吸附和解吸条件：进样液浓度1 9 2 8 m g m l 左右、p h 2 0 、吸附流速2 m l m i n 、 最佳洗脱剂为4 0 乙醇、洗脱流速2 m l m i n 。在此条件下，可得到乳白色晶状体绿原酸产品， 其纯度为9 0 2 4 ，得率为5 7 2 6 。 最后研究了绿原酸产品的生物活性。绿原酸清除d p p h 自由基的i c 5 0 为1 5 5 8 1 t g m l ，对d p p h 自由基的清除能力优于b h t 和v c 。接着绿原酸抑制亚油酸自氧化研究表明，浓度为1 0 0 i _ t g m l 的绿原酸对亚油酸自氧化作用的抑制率可达至l j 6 0 1 8 ；在浓度均为5 0 i t g m l 条件下，绿原酸 对亚油酸自氧化的抑制效果优于v c 。最后，考察了绿原酸的抗肿瘤活性。通过对黑色素瘤细 胞b 1 6 和乳腺癌细胞m c f - 7 两种细胞培养实验发现，绿原酸抑制这两种细胞增长的作用强弱呈 现剂量依赖性；小鼠模型也表明绿原酸能显著抑* 日l j b l 6 黑色素瘤细胞的增长。 关键词：葵花籽粕；绿原酸；提取：纯化；抗氧化 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ep a p e rf o c u s e do ns u n f l o w e rs e e dm e a l ，w h i c hw a s a m p l ea n dn o tw e l ld e v e l o p e di nc h i n a r e c e n t l y ，c h l o r o g e n i ca c i dt h a ti sac o m p o n e n ti ns u n f l o w e rs e e dm e a lh a sb e e ni n d i c a t e dt ob e b i o a c t i v ei np r e v e n t i n gf r e er a d i c a ld a m a g ea n di n h i b i t i n gc a n c e rg r o w t h t h e r e f o r ec h l o r o g e n i c a c i dw a sm o s t l yi n v e s t i g a t e dw h i l et h ec o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no fs u n l 目o w e rs e e dm e a lw a s s y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d f i r s t ，ah i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e t h o dw a sd e v e l o p e df o r d e t e r m i n a t i o no fe h l o r o g e n i ca c i di ns u n f l o w e rs e e dm e a l b yu s i n gt h i sm e t h o d ，c h l o r o g e n i ca c i d w a se l u t e dw i t hs u f f i c i e n ts e p a r a t i o n r 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em e t h o dw a sr a p i d a c c u r a t ea n d r e p e a t a b l e ，w h i c hi sf e a s i b l et od e t e r m i n ec h l o r o g e n i ca c i di ns u n f l o w e rs e e dm e a l t h e ne x t r a c t i o no fc h l o r o g e n i ca c i da n dp r o t e i nf r o ms u n f l o w e rs e e dm e a lw a ss t u d i e d s y s t e m a t i c a l l y t h ee f f e c to ff a c t o r sw a si n v e s t i g a t e da n dt h eo p t i m a lp a r a m e t e r sw e r ed e t e r m i n e d a sf o l l o w s ：t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lw a s5 0 、t e m p e r a t u r ew a s6 0 、t h er a t i oo fs u n f l o w e r s e e d m e a l t oe t h a n o l w a s l ：1 2 ( w v ) 、t i m e w a s 2 h o u r s a n d t h er a t eo f e x t r a c t i o n w a s8 6 9 2 a f t e r t h ee x t r a c t i o no f c h l o r o g e n i ca c i d ，p r o c e s s e dp a r a m e t e r so fp r o t e i nf r o ms u n f l o w e rs e e dm e a lw e r e i n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w e df l a a te x t r a c t i n gc o n d i t i o n sw e r e1m o l ln a c l 、5 0 、1 1 5 h 、 1 ：1 0 ( w v ) 、p h 7 9 a n d t h ee x t r a c t i n gr a t e o f p r o t e i n w a s3 8 5 8 西ei s o l a t i o no fc h l o r o g e u i ca c i dw a si n v e s t i g a t e db yu s i n gt h em e t h o do fo r g a n i cs o l v e n t e x t r a c t i o nf a r t h e r e t h y la c e t a t e 、 d e t e r m i n e dt ob eaa p p r o p r i a t ee x t r a c t i n gs o l v e n t a n dt h e f a c t o r sw h i c ha f f e c t e dt h ee x t r a c t i o nw e r es e l e c t e da sf o l l o w s ：c h l o r o g e u i ca c i dc o n c e n t r a t i o n 1 0 0 m g m la n dp h 2 0o fs a m p l es o l u t i o n 、3t i m e s 、3 m i ne a c ht i m e 、t h er a t i oo fe t h y la c e t a t et o s a m p l es o l u t i o n2 ：l ( v v ) a n dt h ey e l l o wc r y s t a lp r o d u c tw a so b t a i n e d t h er e c o v e r yr a t i ow a s 6 7 1 5 a n dc h l o r o g e n i ca c i dc o n t e n tw a s5 5 8 2 m a c r o p o r o a sr e s i nw a sa p p l i e di nt h ef a r t h e rp u r i f i c a t i o no fc h l o r o g e n i ca c i db a s e do na b o v e w o r k s t h ea b s o r p t i o na n dd e s o r p t i o nf o rc h l o r o g e n i ca c i do nf o u r t e e nk i n d so fm a c r o p o r o u sr e s i n s w e r ee s t i m a t e d d m 3 0 1r e s i nw a sd e m o n s t r a t e dt ob et h eb e s to n e ，a n di tp o s s e s s e dh i 出a b s o r p t i o n a n dd e s o r p t i o nc a p a c i t y ：a d s o r p t i o nw i t hc h l o r o g e n i ca c i dc o n c e n t r a t i o n1 9 2 8 m g m l 、p h 2 0a n d 2 m l m i n d e s o r p t i o nw i t h4 0 e t h a n o la n d2 m l m i n t h ep u r i t yo fc h l o r o g e u i ca c i dw a s9 0 2 4 a n dt h er e c o v e r yw a s5 7 2 6 i nt h ee n d ，b i o l o g i c a la c t i v i t yo fc h l o r o g e n i ca c i dw a ss t u d i e d i t si c 5 0v a l u ef o rs c a v e n g i n g d p p hf r e er a d i c a lw a s15 5 8 1 x g m la n dt h ec a p a c i t yi sb e t t e rt h a nb h to rv c a n di t si n h i b i t o r y r a t eo fs e l g o x i d a t i o no fl i n o l e i ca c i di s6 0 1 8 w h e n 也ec o n c e n t r a t i o no fc h l o r o g e n i ca c i dw a s 1o o v g m l , a n di tw a sa l s ob e t t e rt h a nv co nt h ec o n d i t i o no f5 0 u g m l f i n a l l y ，t h ei n h i b i t o r y a c t i o no fc h l o r o g e n i ca c i df o rc a n c e rg r o w t hw a se v a l u a t e d i nv i t r o ，c h l o r o g e n i ca c i dc o u l di n h i b i t t h eg r o w t ho fm e l a n o m ac e l lb 1 6a n dh a m a nb r e a s tc a n c e rc e l lm c f 一7 b 1 6m i c em o d e la l s o s h o w e de v i d e n ti n h i b i t o r ye f f e c to f c h l o r o g e u i ca c i d k e yw o r d s ：s u n f l o w e rs e e dm e a l ；c h o r o g e u i ca c i d ；e x t r a c t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；a n t i o x i d a t i o n i i 独创性声明 y9 6 7 3 8 1 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名t 墨i 薹刍 日期：加f 年月朋 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：童垄豳导师签名：二丝 日期：枷年6 月如日 第一章绪论 1 1 葵花籽粕概况 第一章绪论 向日葵( h e l i a n t h u sa n n l , l u sl ) 是菊科向日葵属( h e l i a n t h u s ) - - 年生植物，原产于北美洲南 部、西部以及秘鲁和墨西哥北部的干旱地区，开始只是作为花卉和药用植物，随着向日葵籽 用途的开发，逐渐成为人类栽培的主要油料作物。 我国已有1 8 个省市( 自治区) 种植向1 3 葵，产区主要分布在东北、华北和西北半干早、轻 盐碱地区，其中内蒙古栽培面积最大。经过几十年的发展，向日葵已发展成为仅次于油菜、 大豆、棉籽和花生的第五大油料作物，年总产量位居世界第六位，在我国农业生产中占有重 要的地位。 我国对向日葵精深加工一般仅局限于其油脂，而加工过程中产生的葵花籽粕，则基本作 为低廉的动物饲料，未能得到充分和有效地利用，其中一个主要的原因是由于葵花籽粕中含 有较多的绿原酸等酚类化合物。从葵花籽粕中提取葵花籽蛋白时，绿原酸很容易氧化成绿色 的醌【l 】，使蛋白质产品呈深褐色或棕褐色。醌一旦形成便极易与蛋白质分子极性基团、氨基 酸结合，而不易被非反刍动物和家禽等消化，降低了蛋白质的营养价值。因此，人们一直认 为绿原酸是一种抗营养因子。然而，随着科学研究的逐步深入，人们发现绿原酸不是有毒化 合物：而是与人们生活密切相关，具有利胆、抗菌、降压、增加自血球和兴奋中枢神经系统 等多种药理作用，对人体健康具有独特的保健功能。 一 _ 1 2 缘原酸的研究进展和概况 1 2 1 绿原酸的理化性质和结构 1 9 4 7 年r u d k i n ，g h 和n e l s o n ，j m 两位科学家首次确定了绿原酸的化学结构，即它是由 咖啡酸和奎尼酸形成的一种酯圆。其分子式为c 1 6 h 1 8 0 9 ，分子量为3 5 4 _ 3 ，化学结构式如图1 - 1 所示。 删 图卜l 绿原酸的化学结构式 绿原酸半水化合物为白色或微黄色针状晶体，11 0 c 变为无水化合物，熔点为2 0 8 。c ，比 旋光度m d 为3 5 2 。 ( c = 2 8 ) 。绿原酸在水中的溶解度为4 ( 2 5 。c ) ，随温度升高逐渐增 大。它易溶于甲醇、乙醇、丙酮等溶剂，微溶于乙酸乙酯等极性溶剂，难溶于氯仿、乙醚、 江南大学硕士学位论文 苯等亲脂性溶剂。绿原酸为极性有机酸，不太稳定【3 】。其分子中含有的邻二酚羟基受热、见 光易氧化；在碱性和高温条件下，绿原酸可发生水解。 从植物内提取过程中，绿原酸通过水解和分子内酯基迁移而发生异构化。其异构体分别 为：1 - 咖啡酰奎尼酸、3 一咖啡酰奎尼酸( 绿原酸) 、4 - 咖啡酰奎尼酸( 隐绿原酸) 、5 - 咖啡酰 奎尼酸( 新绿原酸) 、l ，3 二咖啡酰奎尼酸( 莱蓟素) 、l ，5 二咖啡酰奎尼酸、1 , 6 二咖啡酰 奎尼酸、3 , 4 - 二咖啡酰奎尼酸( 异绿原酸b ) 、3 ，5 二咖啡酰奎尼酸( 异绿原酸c ) 、4 ，5 二咖 啡酰奎尼酸( 异绿原酸a ) 。 1 2 2 绿原酸的分布 绿原酸是植物体内有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。它在植物 中分布广泛，从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道，主要存在于忍冬科忍冬属，菊科篙属 植物q h 4 1 ，含量较高的植物不多，但在金银花( 4 2 9 6 0 7 ) 、杜仲( 2 - 5 ) 、向日葵( 1 4 5 ) 、咖啡( 2 8 ) 中含量较高。 向日葵中的酚酸类化合物7 0 是绿原酸，主要分布在葵花籽仁的糊粉层中或细胞中蛋白 质颗粒内【5 】。向日葵中的绿原酸含量与其品种有关。一般情况下，向日葵栽培种的绿原酸含 量( 平均为2 8 ) 明显要比野生种( 平均为2 1 ) 的要高嘲。 1 2 3 绿原酸及其类似物的生物活性 1 2 3 1 清除体内自由基和抗脂质过氧化作用 绿原酸及其衍生物具有比抗坏血酸、咖啡酸和生育酚更强的自由基清除效果，可以有效 清除d p p h 自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基；它还可以抑制低密度脂蛋白的氧化。 绿原酸有抑制前列腺素代谢中脂氧化酶活性、抑制v a 的氧化、保护肾上腺素免受氧化、抗v a 酸5 , 6 - 环氧化的生物活性【_ ”。绿原酸甲酯可抑制由a d p 加抗坏血酸诱发的肝线粒体和微粒体 脂质过氧化作用以及阻止有丝分裂剂c o n a 附加磷脂酰丝氨酸诱导的肥大细胞组胺释放【8 1 。 1 2 3 2 抑制突变和抗肿瘤作用 绿原酸具有较强的抑制突变能力，它可以抑制青霉素b l 引发的突变和亚硝化反应引发的 突变，并能有效降低丫射线引起的骨髓红细胞突变；同时，绿原酸还可通过降低致癌物的利 用率以及在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果 9 1 。绿原酸对大肠癌、肝癌和咽喉癌具有 显著的抑制作用，被认为是癌症的有效化学防护剂。近来，日本学者研究证实了杜仲茶的变 异原性抑制作用与杜仲叶所含的绿原酸等抗变异原性成分有关【1 0 】，揭示杜仲叶对肿瘤的预防 具有重要意义。 1 2 3 3 对心血管的作用 从冬青科植物苦丁茶中分离得到异绿原酸b 和c ，异绿原酸b 对大鼠具有较强促进前列 腺环素的释放、抗血小板聚集作用和对豚鼠肺碎片感应的抗体诱导s r s a 释放抑制率达6 2 3 ( 1 0 0p m o l l ) ；异绿原酸c 也有促进前列腺环素的释放作用，揭示了异绿原酸b 和c 为 苦丁茶的抗心血管病活性成分。此外，异绿原酸b 对血小板血栓素生物合成和氢过氧化物诱 2 第一章绪论 发的内皮素细胞损伤有极强的抑制作用。从林荫千里光s e n e c i on e m o r e n s i sl 中分离得到的莱 蓟素有明显的扩冠和降脂作用1 1 1 o 1 2 3 4 抗菌、抗病毒及解痉作用 有文献报道【l2 ”】，绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用。德国柏林自由 大学e i e h 在研究有些植物次生代谢物作为抗逆转录病毒剂时，认为绿原酸是有希望的抗艾滋 病毒( h i v ) 先导化合物【l “。这与报道的杜仲树皮或叶的碱性提取物治疗和预防h i v 感染很有效 果的结论相一致【8 】，该提取物制剂特别用来防治h i v 的感染，降低该病毒的感染性，通过调 节吸收、增加h i v 的代谢，抑制该病毒对脑的感染。另外，3 , 4 ，5 三咖啡酰奎尼酸能抑制h i v 复制【9 1 。 体外试验表明【14 1 ，绿原酸、新绿原酸、异绿原酸a 和c 为五加科常青藤h e d e r ah e l i x 干 浸膏的解痊成分之一，其活性强度：异绿原酸c 异绿原酸a 绿原酸 新绿原酸。 1 2 3 5 保肝利胆的作用 娄红祥等从金银花水溶性部分经乙酰化后得到绿原酸四乙酰化物，经过药理试验表明， 它对c c h 引起的小鼠肝损伤有明显的保护作用，这为阐明金银花具有保肝利胆之功效提供了 理论依据。此外，莱蓟素也具有利肝保胆的作用【”】。 1 2 3 6 对透明质酸酶及葡萄糖6 磷酸酶和弹性蛋白酶的抑制作用 从狭叶紫锥花e c h i n a c e aa m g u s t i f o l i ad c 根的乙酸乙酯提取物中发现3 ，5 二咖啡酰奎尼 酸和绿原酸，有较强的抑制透明质酸酶激活的作用【1 6 1 。 最近，绿原酸被确认是大鼠肝微粒体中葡萄糖6 磷酸位移酶第一个新型特异性抑制剂 0 7 1 。通过测定正常大鼠肝微粒体中葡萄糖一6 一磷酸水解程度，来评价绿原酸及其合成类似物对 位移酶活性的抑制强度【l 引。葡萄糖一6 一磷酸位移酶抑制剂将有利于降低非胰岛素依赖性糖尿病 患者的肝糖排泄速度，显示绿原酸治疗糖尿病方面的良好情景 1 7 , 1 8 。 赵春贵等【l9 】研究认为绿原酸对弹性蛋白酶具有显著的抑制作用，并且对弹性蛋白酶具有 荧光淬灭作用，这为绿原酸治疗和防治肺气肿提供了理论基础。 1 2 4 绿原酸的提取方法 1 2 4 1 水提法 许东颖等【2 0 1 采用水提法从金银花中提取绿原酸，绿原酸提取率达到3 9 9 ，但是提取物 中绿原酸含量只有6 1 。刘祥兰等【2 1 】运用水煎法，提取率可达8 1 4 5 。刘宗林1 2 2 1 等利用高 温提取杜仲叶中绿原酸，提取率可达1 7 0 2 1 8 2 ，绿原酸含量达到3 3 3 4 4 4 。吴红等 2 3 1 发现绿原酸经水提醇沉工艺处理后，纯度仅为2 2 1 4 。水提工艺简单、成本低、投资少， 但是能耗高，生产周期长且废水量大；而且在提取时，大量的水溶性物质如蛋白质、多糖、 鞣质、粘液等杂质析出，过滤十分困难，因此产品纯度低。 1 2 4 2 有机溶剂提取法 江南大学硕士学位论文 文献【2 4 j 报道利用乙醇提取金银花中绿原酸，提取液经过树脂或醇沉纯化后，提取物得率 为2 0 2 0 4 7 6 2 ，绿原酸含量为2 4 7 7 2 6 8 5 。张伟农【25 】利用乙醇从葵花籽仁中提取绿原 酸，得出在最佳条件下绿原酸得率为4 0 9 。高锦明等【l5 】用混合溶剂提取杜仲叶中绿原酸等 生物活性成分，绿原酸得率达到3 6 9 ，纯度达5 8 7 ，可见混合溶剂是一种理想的方法。 1 2 4 3 酶法 王志华j 利用果胶酶和纤维素酶从葵花籽中提取绿原酸，发现在温度3 0 。c ，时间1 5 h ， 纤维素酶添加1 0 “l ，果胶酶用量为2 m l 的时候，绿原酸含量可以达到1 3 6 ，几乎能够完 全提出葵花籽仁中的绿原酸。刘佳【2 6 】等也利用这两种酶从金银花中提取绿原酸，发现纤维素 酶处理可以显著提高绿原酸得率，最高得率为8 3 2 。酶法提取，绿原酸得率高，反映条件 温和，但采用酶法处理，大大增加生产成本，其经济性尚待研究，目前仅用于实验室研究阶 段。 1 2 4 4 超临界萃取法 周贵新【2 7 】利用超临界二氧化碳从杜仲叶中提取绿原酸等活性成分，其产品纯度达到9 0 以上。超临界二氧化碳将萃取剂和蒸馏合为一体，不需要回收溶剂，无污染，产品纯度高。 但是成本太高，有时还需要大量的夹带剂。 1 2 4 5 其它提取方法 尹波瞄】分别利用水提法和超声波法提取金银花，发现所得的主要成分是相同的，主要差 别是超声波法提取绿原酸的收率较高，而且提取时间短，条件温和。韦藤幼【2 9 1 用微波预处理 法提取金银花中的绿原酸，发现此法与传统方法比较，提取时间缩短6 倍，绿原酸含量提高 4 ，提取率提高1 。超声波和微波提取可以节省溶剂和时间，提取率较高。但是由于处理 量的限制，目前仅限于实验室规模。 1 2 5 绿原酸的分离纯化方法 1 2 5 1 金属离子沉淀法 ( 1 ) 石硫醇法p o 】：该法是从金银花中提取绿原酸的一种常用方法。先将金银花水煮液浓 缩，加石灰乳，使水提液中的绿原酸形成难溶于水的钙盐，过滤后将沉淀悬浮于乙醇中加入 5 0 硫酸至p h 3 4 ，绿原酸钙盐分解产生硫酸钙沉淀析出，绿原酸成为游离酸溶于水中，然 后中和、浓缩、干燥得绿原酸粗品。粗品中绿原酸含量一般在2 0 3 0 之间，收率较低约为 1 2 。此法得率低，且在碱性条件下绿原酸易水解，难以大规模用于生产。 ( 2 ) 铅沉法：该法同有机溶剂萃取、分步结晶和重结晶相结合可得到绿原酸纯品。但 是此法使用了有毒的重金属铅，金属铅会在绿原酸中有所残留，对产品造成污染，因此也不 宜产业化大规模生产。 1 2 5 2 有机溶剂萃取分离法 通常与其它分离方法配合应用，才能达到完全分离的目的。胡锦蓉【3 l 】利用天然沉降剂、 超滤膜、乙酸乙酯、d 1 4 0 树脂处理从杜仲叶中提取的绿原酸粗品，最后得到纯度为9 2 9 9 o 的绿原酸产品。韩鲁加等l j2 j 利用澄清剂及乙酸乙酯萃取的方法，最后从金银花中得到了纯度 4 第一章绪论 为8 4 的绿原酸产品。该方法操作简单、方便、成本低、无有害溶剂、适合于产业化；但溶 剂萃取的选择性差，对原料液的质量要求高，得率低。 1 2 5 3 膜分离法 目前用于绿原酸纯化的主要有超滤，它可有效除去金银花提取液中多糖、蛋白质等大分 子物质。该技术同有机溶剂分离和树脂精制结合，绿原酸纯度可达到9 2 9 9 ，得率为0 5 5 【2 5 1 ，再经重结晶可得到绿原酸纯品【3 3 】。膜分离法能保留有效成分、无污染、能耗低、得率 高、适用于工业化生产；但是该法对提取液预处理要求高，产量易受超滤条件的影响，而且 膜的清洗麻烦，工业化生产投资一次性大。 1 2 5 4 重结晶法 陈燕军等【3 4 】用有机溶剂萃取等一系列工艺得到绿原酸粗品后，经分步结晶和重结晶等方 法精制得到绿原酸纯品，得率约为0 5 。孙波【3 目重结晶法处理纯度为9 2 9 9 的绿原酸粗品 而得到绿原酸纯品。此法操作麻烦、结晶条件难以控制，而且只适用于处理较高纯度的绿原 酸粗品。 1 2 5 5 澄清剂吸附法 现在已经报道吸附澄清剂用于纯化绿原酸的只有壳聚糖，并取得了不错的效果。浓缩比 例越大，澄清剂添加量越多，有效成分损失也越多。同时，澄清剂没有法定的药用标准，在 使用过程中还有可能带入其它成分，因此澄清剂吸附法能否完全取代其它方法尚待进一步研 究。 1 2 5 6 大孔吸附树脂分离法 大孔吸附树脂分离法是利用大孔树脂对混合物中待分离物质所具有的吸附和筛选作用从 而达到分离目的的方法。由于其具有相当的表面积，与传统吸附剂相比，具有选择性好、解 析容易、机械强度好、可反复使用和流体阻力小等优点。刘斌【3 6 】采用大孔吸附树脂两次吸附 分离金银花中的绿原酸，纯度达4 0 8 0 。我国树脂品种繁多而杂，筛选一种适宜产业化生 产的最佳吸附树脂并非一件容易之事，因此大孔吸附树脂对绿原酸的分离还有许多工作要做。 1 2 5 7 其它分离纯化方法 聚酰胺柱层析法口7 】能使绿原酸和黄酮类化合物获得较好的分离，吸附剂聚酰胺可反复使 用，纯化度高，适合于工业化生产。但操作麻烦，洗脱时间长，成本高，材料不易再生，产 业化生产投资相对较大。 k o p s e h 【3 9 】利用凝胶色谱法将咖啡中绿原酸的异构体3 ，4 - ，5 - 绿原酸分离开来，其纯度 达到9 4 。该方法设备简单，操作方便，结果准确，纯度高；但是生产成本高，产量低，凝 胶价格昂贵，产业化生产投资大。 彭密军等p 9 】利用制备型高效液相色谱法( 肿l c ) 从杜仲叶中分离纯化得到绿原酸，制备回 收率为8 3 3 ，纯度高达9 8 6 1 。该方法分离效果好，产品纯度高，速度快，自动化程度高； 但仪器价格高，产量低，技术要求高，目前仅能用于实验室制备以及有效成分测定和结构类 似组分的分离上。 江南大学硕士学位论文 h a i t a ol u i 4 0 】采用制备型高速逆流色谱( h s c c c ) 从金银花提取物中分离纯化绿原酸，回 收率达到9 0 左右，纯度达到9 4 8 。但由于仪器较昂贵、技术要求高，目前也仅限于实验 室的制备上。 1 2 6 绿原酸的开发和应用前景 目前已利用金银花、杜仲、银杏叶和丹参等植物资源开发出各种生物源性药物，对治疗 动脉粥样硬化等疾病有显著疗效，其主要有效成分就是绿原酸。利用绿原酸具有较强的抗氧 化性，或直接发挥清除自由基以对抗过氧化脂质和氧化低密度脂蛋白的形成，或提高体内超 氧化物歧化酶的活性水平，发生间接作用，已成为当前进一步研发生物源抗氧化性研究的重 要标志和热点之一。 绿原酸是一种新型高效的天然抗氧化剂，在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人 工合成的抗氧化剂。在猪油中加入少量绿原酸，可提高猪油的抗氧化稳定性延长保质期。同 时，绿原酸具有增香和护色作用，可用于食品的保鲜。h i r a z a w a 等【4 1 1 把绿原酸用于鱼片的保 鲜后，发现其效果要优于茶叶提取物和洳生育酚。 由于绿原酸具有抗氧化作用，它可以用于保护胶原蛋白不受活性氧等自由基的破坏，并 能有效防止紫外线对人体皮肤的伤害作用。现已有多项添加绿原酸后用于抗脲酶化妆品、防 止紫外线和染发剂对头发损伤的洗发水的欧洲专利i l 引。日本也利用绿原酸及其衍生物的抗氧 化特性研制出了抗衰老的护肤和美白用品。 1 3 立题依据和意义 综上分析，绿原酸在药理活性、保健功能等领域的研究成果预示着开发含有绿原酸的药 品、保健食品和日用化工产品具有良好的前景，因此寻找富含绿原酸的植物资源成为解决原 料来源的一大问题。我国已确认绿原酸为主要药用成分的植物是金银花，它是忍冬科忍冬的 干燥花蕾，由于花蕾的产量低、价格贵，迫切需要扩大药源。我国葵花籽粕的资源十分丰富， 在生产中以葵花籽粕代替金银花提取绿原酸，将较大幅度地降低绿原酸的生产成本。提取绿 原酸后，也为良好消化率( 9 0 ) 和较高生物价( 6 0 ) 4 2 1 的葵花籽粕蛋白的生产创造了条件。因 此，研究开发利用葵花籽粕资源不仅可以解决葵花籽粕积压严重的问题，提高葵花籽粕的附 加值，而且对于推动向日葵的产业化、促进向日葵产区的经济发展都具有显著的现实意义。 1 4 本论文主要研究内容 1 绿原酸分析方法的建立 2 葵花籽粕中绿原酸和蛋白质提取工艺的研究 3 绿原酸分离纯化工艺的研究 4 绿原酸生物活性的研究 第二章绿原酸分析方法的建立 第二章绿原酸分析方法的建立 目前，绿原酸的测定方法有紫外分光光度法( u v ) 、薄层层析法( t l c ) 、高效液相色 谱法( h p l c ) 、高效毛细管电泳法( h p c e ) 等。紫外分光光度法易受其它成分干扰，测定 值一般偏高；薄层层析法涂层工序繁琐，分离效果欠佳，且不利于大量样品的检测和自动化 连续检测；高效毛细管电泳法是目前发展较快的一种分离新技术，具有分离效率高、进样量 少、分析时间短等优点，由于发展初期仪器本身的缺陷以及操作人员经验不足等原因，它仍 存在着重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低等缺点h 3 1 。高效液相色谱法是7 0 年代发展起来 的一种色谱分离方法，经过3 0 年的发展，现在高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、 检测灵敏度高和分析速度快的特点，是目前国内外专家公认的准确测定植物有效成分的先进 方法。本文旨在确定一种简单、快速和准确测定绿原酸的高效液相色谱方法，为绿原酸分离 提取工艺的建立奠定基础。 2 1 实验材料和设备 2 1 1 材料和试剂 葵花籽粕 绿原酸标准品( 纯度 1 9 8 ) 甲醇( 色谱纯) 磷酸( 分析纯) 乙醇 2 1 2 实验仪器 u v 2 1 0 2 p c 紫外可见分光光度计 r - 2 0 1 型旋转蒸发器 c s f 1 a 型超声波发生器 d z f - - 6 0 2 1 型真空干燥箱 p l 2 0 0 2 型电子天平 w a t e r s 9 9 6 光电二极管阵列检测器 w a t e r sz m d 4 0 0 色谱质谱联用仪 色谱柱l i c h r o s p h e r c l 8 ( 2 0 x 2 5 0 m m ) 由上海佳格食品公司提供 s i g m a 公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 食用级 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 上海申顺生物科技有限公司 上海超声波仪器厂 上海精宏实验设备有限公司 梅特勒一托利多仪器有限公司 美国w a t t s 公司 美国w a t e r s 公司 汉邦公司 江南大学硕士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1 样品溶液的制备 将干燥的葵花籽粕粉碎，过物料粒度为0 4 2 m m 的标准筛【4 4 】。 称取l o g 粉碎的葵花籽粕，置于2 5 0 m l 平底烧瓶中，加入5 0 ( v v ) 的乙醇溶液1 2 0 m l ， 6 0 。c 下提取2 h ，然后把提取液蒸发、浓缩，真空干燥得到绿原酸粗品。称取绿原酸粗品 1 0 2 5 m g ，用甲醇溶解，超声波处理1 5 m i n ，然后定容于l o o m l 容量瓶中，避光保存，待测。 测定前经0 4 5 1 a m 微孔滤膜过滤。 2 2 2 标准溶液的配制 用十万分之一电子天平精密称取绿原酸标准品1 0 1 0 m g ，用甲醇溶解，超声波处理1 5 r a i n ， 然后定容于l o o m l 棕色容量瓶中，保存，备用。 2 2 3 色谱条件的确定 2 2 3 1 最大吸收波长的确定 吸取2 2 2 中的标准溶液2 o m l 置于l o m l 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，并以甲醇溶液 为参比液，作空白实验，采用紫外分光光度计在2 0 0 4 0 0 n m 的波长范围内扫描。 2 2 3 2 流动相的选择 在流速1 o m l m i n 、柱温3 5 时，考察甲醇与0 1 磷酸以不同比例( 2 0 ：8 0 ，3 0 ：7 0 ， 4 0 ：6 0 ，6 0 ：4 0 ，8 0 ：2 0 ) 组成的流动相对绿原酸的分离效果的影响。 2 2 4 标准曲线的建立 吸取2 2 2 中的标准溶液o 5 m l 、1 0 m l 、2 o m l 、4 o m l 、6 o r a l 、8 o r a l 分别置于l o m l 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。用高效液相色谱仪测定各种浓度绿原酸标准溶液的吸收峰面 积，以绿原酸浓度x 为横坐标，峰面积y 为纵坐标，绘制标准曲线。 2 2 5 加标回收率实验 向已知浓度的绿原酸样品溶液中加入一定量的标准品，配成6 个已知浓度的混合溶液。 用高效液相色谱仪测定各种浓度混合溶液的吸收峰面积，由标准曲线计算绿原酸的回收率。 2 2 6 精密度实验 用高效液相色谱仪重复测定6 次绿原酸样品溶液的吸收峰面积，根据标准曲线计算绿原 酸样品溶液的浓度。 第二章绿原酸分析方法的建立 2 3 结果与讨论 2 3 1 色谱条件的确定 2 3 1 1 最大吸收波长的确定 以甲醇为参比液，作空白实验，用紫外分光光度计对绿原酸标准溶液进行扫描，波长区 间为2 0 0 4 0 0 n m ，结果如图2 - 1 所示。由图2 1 可以看出绿原酸标准溶液在3 2 7 n m 处有最大 吸收峰，3 2 7 r t m 为最大吸收波长。因此，确定3 2 7 n m 为绿原酸的测定波长。 图2 - 1 绿原酸标准溶液紫外扫描图 2 3 12 流动相的选择 流动相的性质和组成是影响色谱柱效、分离选择性的重要因素。目前文献中采用h p l c 法测定葵花籽粕绿原酸时，流动相多采用乙腈、水和乙酸或甲醇、水和磷酸等。但由于样品 处理、仪器、柱型、流动相和流速等分析条件的差异，其保留时间都不尽相同，甚至相差较 大。考虑到绿原酸易发生离解，离解后的绿原酸会与色谱柱产生较强作用导致拖尾，直接影 响测定结果的准确性，因此，本实验，在流动相里加入了一定比例的磷酸，可有效抑制酚羟 基解离，克服谱图的拖尾现象。通过实验发现，当流动相体系中甲醇与0 1 磷酸的比例不同， 即为2 0 ：8 0 ，3 0 ：7 0 ，4 0 ：6 0 ，6 0 ：4 0 ，8 0 ：2 0 时，色谱柱对绿原酸的分离效果和保留时间 相差很大。综合考虑，选用流动相体系中甲醇与o 1 磷酸的比例为3 0 ：7 0 ，在这个条件下， 绿原酸标准品和样品的高效液相色谱图如图2 - 2 和图2 - 3 所示。从图2 2 和图2 3 可以看出， 绿原酸的保留时间在1 2 r a i n 左右，同时绿原酸也可以得到较好的分离，这说明该条件适合于 葵花籽粕中绿原酸含量的准确测定。 江南大学硕士学位论文 ) 0 l 图2 - 2 绿原酸标准品的高效液相色谱图 图2 - 3 绿原酸样品的高效液相色谱图 2 3 13 色谱条件的确定 经以上实验，高效液相色谱法测定绿原酸的条件： 色谱柱：l i c h r o s p h e r c l 8 ( 2 0 2 5 0 r a m ) ，流动相：甲醇一o 1 磷酸( 体积比3 0 ：7 0 ) ， 流速：1 0 m l m i n ，柱温：3 5 c ，进样量：1 0 i t l ，检测波长：3 2 7 n m 。 2 3 2 标准曲线的建立 按2 3 1 3 中的色谱条件，测定2 2 4 中不同浓度的绿原酸标准溶液，其对应的峰面积如 表2 1 所示。以绿原酸浓度为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图2 _ 4 所示。绿原酸浓度和吸收峰面积的回归方程为：y = 0 1 6 9 2 x 一0 2 8 5 ，x 一绿原酸浓度( g g m l ) y 一吸收峰面积( 1 0 4 ) ，相关系数r = 0 9 9 9 9 ，在5 0 5 1 0 1 0 0 9 9 m l 范围内呈线性关系。 表2 - 1 不同浓度绿原酸的吸收峰面积 浓度( g g m l ) 5 0 51 0 1 02 0 2 04 0 4 06 0 6 08 0 8 01 0 1 0 0 第二章绿原酸分析方法的建立 1 8 0 0 1 5 0 0 毛 1 2 0 0 釜 9 - o o 星6 0 0 3 0 0 0 0 0 2 3 3 加标回收率实验 0 0 02 0 0 04 0 0 06 0 0 08 0 0 01 0 0 0 0 1 2 0 0 0 浓度( u g m l ) 图2 4h p l c 分析绿原酸的标准曲线 向已知浓度的绿原酸溶液中加入一定量的标准品，配成6 个己知浓度的混合溶液，按 2 3 1 3 中的色谱条件分析，结果如表2 2 所示。由表2 - 2 可知，该测定方法具有较好的回收 率( 9 9 4 4 ) ，测定标准差s = 1 4 3 ，变异系数c v = i 4 4 。 2 3 4 精密度实验 按2 3 1 _ 3 中的色谱条件，对绿原酸样品溶液重复分析6 次，结果如表2 3 所示。 表2 - 2 加标回收率实验结果( n = 6 ) 样品号标准品绿原酸样品绿原酸混合溶液绿原酸测得标准品绿原回收率 含量( 1 a g m l )含量( p 咖l )含量( p g m l )酸含量( t g m l ) ( ) 14 0 41 4 6 1 1 8 6 34 0 2 9 9 5 0 2 3 4 5 6 8 0 8 1 0 1 0 2 0 2 0 3 0 3 0 4 0 4 0 1 4 6 1 1 4 6 l 1 4 6 1 1 4 6 1 1 4 6 1 2 2 4 8 2 4 8 6 3 4 9 0 4 4 4 6 5 4 7 3 7 8 7 1 0 2 5