（动物学专业论文）黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究.pdf

i i il l i i r lllr f l l li lrrri lll it i f 舢 一 ；y 17 3 3 011 苏州大学学位论文使用授权声明 ? 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属 在年一月解密后适用本规定。 ：非涉密论文因 论文作者签名： 王查多 日期：纠矽! 堡! ! 导师签名：二主缉日期：五 黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究中文摘要 中文摘要 表皮的鞣化，骨化及黑化在昆虫发育中起着重要作用，3 ，4 二羟苯丙氨酸( 多 巴，d o p a ) 是昆虫新生表皮鞣化和免疫黑化所必需的。酪氨酸在酶的作用下羟化为 d o p a ，d o p a 再在一系列酶的作用下转化为儿茶酚类及其衍生物，并且参与到鞣化 与免疫黑化中。酪氨酸羟化为多巴的反应可在两种酶的作用下进行：酪氨酸羟化 酶( t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ，t h ，e c1 1 4 16 2 ) 及酚氧化酶( p h e n o l o x i d a s e ，p o ，e c 1 1 4 1 8 1 ) 。t h 是芳香族氨基酸羟化酶家族的一员，其所参与的羟化反应需要四氢 生物喋呤( b h 4 ) 作为辅因子，该反应是儿茶酚胺类及其衍生物生物合成中的第一步 也是整个过程中的限速步骤。 酪氨酸羟化酶在脊椎动物及无脊椎动物中是高保守的，对果蝇t h 及其他昆虫 类t h 的研究表明t h 在昆虫表皮鞣化及免疫防御反应中扮演着重要的角色。目前 对昆虫3 7 - 1 的研究主要集中在双翅目及鳞翅目类昆虫，且尤以黑腹果蝇( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) 研究较为深入。 为获得鞘翅目昆虫中t h 特性，本文以鞘翅目昆虫黄粉虫( t e n e b r i om o l i t o r ) 为 研究对象，采用e d n a 末端快速扩增( r a c e ) 技术和p c r 方法从大肠杆菌免疫注射 诱导的黄粉虫末龄成熟幼虫脂肪体中获得了编码黄粉虫酪氨酸羟化酶( t m m ) 蛋白 的e d n a 全长序列2 1 0 3 b p ，其中包含可编码5 3 4 个氨基酸残基的1 6 0 5 b p 开放式阅 读框，预测t m t h 蛋白质分子量为6 0 6 6 k d a ，等电点为5 7 0 ( g e n b a n k 登录号： g q 3 9 0 3 6 6 ) 。序列比对分析显示t m t h 蛋白序列与其他昆虫类蛋白序列高度保守， 与赤拟谷盗( t r i b o l i u mc a s t a n e u m ) 同源性高达9 2 3 2 ，与鳞翅目昆虫及哺乳动物同 源性分别达到6 5 1 2 及4 3 4 7 ，且该酶在氮端区域包含一个保守的e a _ m - p 依赖性 蛋白激酶磷酸化位点。氨基酸序列分析显示，t m t h 蛋白不存在信号肽，不是一 种分泌型蛋白，同时具有芳香族氨基酸羟化酶家族的典型结构特征：四氢生物喋 呤结合区、催化区及调控区。 为了解t h 在黄粉虫中的表达特性及与免疫的相关性，使用半定量r t - p c r 方 法分析了末龄成熟黄粉虫幼虫中t m t h 表达情况，数据显示t m t hm r n a 在正常 中文摘要黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究 幼虫大脑中大量表达，而在表皮、脂肪体及血淋巴表达量相对较少，这表明该酶 可能会参与到黄粉虫幼虫神经活动中，该作用有待于进一步研究。末龄成熟幼虫 在灭活大肠杆菌处理后，表皮及脂肪体中t m t h 表达量明显增加，且在处理后6 - 1 2 h 内达到最大值，在3 6 h 内仍处在较高的表达水平，随后表达量逐渐恢复正常水平， 而在脑中t m t h 的表达上调不明显。在研究t m t h 的诱导表达特异性中发现革兰 氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均可诱导t m t h 的表达，且无明显差异。 为探讨t m t h 与表皮鞣化间的相关性，使用半定量r t - p c r 方法分析了黄粉 虫幼虫、蛹及成虫不同特定发育阶段t m t h 在表皮及脂肪体中的表达情况。研究 发现t m t h 在每个发育阶段的起始表达量较高，且其表达量随着表皮鞣化程度的 进行而减少，数据证实t m t h 的表达量与黄粉虫表皮鞣化程度密切相关。 为进一步研究t m t h 蛋白，将砌珊编码区克隆到表达载体p e t 2 8 a ( + ) 中，在 大肠杆菌b l 2 1 中进行了i p t g 诱导表达，经s d s p a g e 分析显示诱导表达获得大 小为6 2k d 的融合蛋白。这为t m t h 体外酶学性质及相关调控等方面的研究提供 了便利，体外性质的研究也将是下一步的工作重点。 本研究首次在鞘翅目黄粉虫中克隆了酪氨酸羟化酶基因( t r o t l - 1 ) 全长e d n a 序 列并进行了生物信息学分析，研究了该蛋白的体内功能，并在体外成功获得重组 蛋白。通过对t m t h 在不同发育时期及免疫刺激后的表达特征研究，推测该基因 可能与黄粉虫神经活动、表皮鞣化及免疫反应有关，这不仅对研究以黄粉虫为代 表的鞘翅目昆虫表皮形成机理具有重要的理论意义，也为研究昆虫病虫害防治提 供了一个实践上的参考。 关键词：黄粉虫；酪氨酸羟化酶；克隆；r t - p c r ；鞣化；免疫；原核表达 作者：王犬永 指导教师：许维岸 黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究英文摘要 m o l e c u l a rc l o n i n g ，f u n c t i o na n a l y s i sa n dp r o k a r y o t i c ! e x p r e s s i o no f t h et y r o s i n eh y d r o x y l a s eg e n ei nm e a l w o r m ， t e n e b r i om o l i t o r ( i n s e c t ac _ o l e o p t e r a ) a b s t r a c t c u t i c l et a n n i n g ，p i g m e n t a t i o na n dm e l a n i z a t i o no fi n s e c t sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n t h e p r o c e s so ft h e i rd e v e l o p m e n t a lm e t a m o r p h i s m i t i sw e l lk n o w nt h a t3 ， 4 一d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e ( d o p a ) i se s s e n t i a lf o rt a n n i n go fn e w l yf o r m e dc u t i c l ea n d t h ei m m u n e - a s s o c i a t e dm e l a n i z a t i o ni ni n s e c t s d o p ai sp r o d u c e db yt h eh y d r o x y l a t i o n o ft y r o s i n e ，a n di ts u b s e q u e n t l yc o n v e r t st oo x i d i z e dc a t e c h o l sa n dt h e i rd e r i v a t i v e sb ya s e r i e so fe n z y m e s ，w h i c hl e a d t o t a n n i n g ，m e l a n i z a t i o n a n d i m m u n i t y t h e h y d r o x y l a t i o no ft y r o s i n et od o p ac a nb eg e n e r a t e db yt w ot y p e so fe n z y m e s ：t y r o s i n e h y d r o x y l a s e ( t h ，e c1 1 4 1 6 2 ) a n dp h e n o l o x i d a s e ( p o ，e c1 1 4 1 8 1 ) t hc a t a l y z e s t h eh y d r o x y l a t i o no ft y r o s i n et od o p ai nt h ep r e s e n c eo ft e t r a h y d r o b i o p t e r i n ( b i - h ) 嬲 e o f a c t o r t h er e a c t i o ni st h ef i r s ta n dr a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e p r o d u c t i o n o f e a t e c h o l a m i n e sa n dt h e i rd e r i v a t i v e s t h sa l eh i g h l yc o n s e r v e de n z y m e sf o u n di nb o t hv e r t e b r a t e sa n di n v e r t e b r a t e s s t u d i e so ft hh a dd e m o n s t r a t e dt h a tt hw a sr e q u i r e df o rc u t i c l et a n n i n ga n di m m u n e f u n c t i o ni nn m e l a n o g a s t e ra n do t h e ri n s e c t s t h ep r e v e a i e mr e s e a r c h e so nt hm a i n l y f o c u s e do nl e p i d o p t e r aa n dd i p t e r ai n s e c t s ，b u tl i t t l eo nc o l e o p t e r ai n s e c t 。 i no r d e rt oc h a r a c t e r i z et y r o s i n eh y d r o x y l a s eo ft e n e b r i om o l i t o r ( t r o t h ) a n dt o a s s e s st h ep r e l i m i n a r yf u n c t i o no ft m t hi ni t sc u t i c l et a n n i n ga n di m m u n ed e f e n s e w e c l o n e daf u l ll e n g t hc d n ac l o n ee n c o d i n gt m t hf r o mt h ef a tb o d yo fi m m u n i z e dz m o l i t o rl a r v a eb yr a c ea n dp c rm e t h o d s t h ee d n ac o n s i s t e do f2 10 3 b pw i t ha s i n g l eo p e nr e a d i n gf r a m eo f16 0 5n u c l e o t i d e se n c o d i n g5 3 4a m i n oa c i dr e s i d u e s t h e i i i 英文摘要黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究 p r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h ta n dp io ft m t hw e r e6 0 6 6k d aa n d5 7 0r e s p e c t i v e l y ( g e n b a n kn o g q 3 9 0 3 6 6 ) a m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h ed e d u c e dp r o t e i nw a sc o m p a r e d a n da n a l y z e dw i mo t h e ri n s e c ta n dv e r t e b r a t et h sp r o t e i ns e q u e n c e sb a s e do na c l u s t a l wa l i g n m e n ti n c l u d i n g15 t h sp r o t e i ns e q u e n c e s t h ea l i g n m e n tr e s u l t ss h o w e d t h a ti t sa m i n oa c i ds e q u e n c ew a sw e l lc o n s e r v e da m o n gi n s e c t s t h ei d e n t i t i e so ft m t h t ot r i b o l i u mc a s t a n e u mt h ( g e n b a n kn o e f 5 9 217 8 ) w e r e9 2 3 2 t h et o t a ls e q u e n c e i d e n t i t i e st ol e p i d o p t e r a nt h sw e r ea b o u t6 5 12 ，a n d4 3 - 4 7 t ov e r t e b r a t et h s i nt h e n - t e r m i n a lc o n s e r v e dr e g i o no fi n s e c tt h s ，t h e r ew a sac o n s e n s u ss i t e ( r r x s ) f o r p h o s p h o r y l a t i o nb yc a m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ea ts e t3 2 ，w h i c hc o r r e s p o n d e dt o t h es e r4 0i nv e r t e b r a t et h s t r o t hw a sn o tp r e d i c t e dt ob eas e c r e t e dp r o t e i na s d e t e r m i n e db ys i g n a l et h ee n c o d e dp r o t e i nh a dn op o s s i b l es i g n a lp e p t i d e i na d d i t i o n ， t m t hc o n t a i n sab i o p t e r i n _ _ hd o m a i n ，ac o n s e r v e dc t e r m i n a lc a t a l y t i c ( c ) d o m a i na n d a nu n r e l a t e dn - t e r m i n a lr e g u l a t o r y ( r ) d o m a i n t od e t e r m i n et h e e x p r e s s i o nc h a r a c t e r i s t i c sa n de l e m e n t a r yi m l u n eb i o l o g i c a l j f u n c t i o n so ft m t h ，w ea n a l y z e ds e v e r a le x p r e s s i o np r o f i l e si nd i f f e r e mt i s s u e so f f u l l g r o w nl a s ti n s t a rl a r v a l e t m t hm r n a w a sa b u n d a n t l ye x p r e s s e di nt h eb r a i n ，b u t m u c hl e s si ni n t e g u m e n t ，f a tb o d ya n dh e m o l y m p h b u tt h eg e n ee x p r e s s i o nw a s s t r o n g l y i n d u c e di nf a tb o d ya n di n t e g u m e n tb yu v - k i l l e de c o l im i c r o b e s t h i s i n d i c a t e dt h a tt h ee n z y m em i g h tb ei n v o l v e di nn e u r a la c t i v i t yi nt h el a r v a e ，a n df u r t h e r i n v e s t i g a t i o no nt h i sw a sn e e d e d t h eg e n et r a n s c r i p t sr e a c h e dt h em a x i m u m l e v e l sa t 6 - 1 2ha f t e rt h e b a c t e r i a lc h a l l e n g e ，l a s t e df o rm o r et h a n3 6 ha th i 曲l e v e l sb e f o r e g r a d u a l l ya t t e n u a t i n ga f t e rt h ei n f e c t i o n , b u tw e a k l yi nt h eb r a i n i na d d i t i o n , t h e i n d u c t i o nc o u l db ec a u s e d b y e s c h e r i c h i a c o l i ( g ? ，b a c i l l u ss u b t i l i s ( g + ) ， s t a p h y l o c c o c u sa u r e u s ( g + ) a n dc a n d i d am y c o d e r m a 口) t ou n d e r s t a n dw h e t h e rt h ee x p r e s s i o no ft hw a sc o r r e l a t e dw i t h c u t i c l et a n n i n g d u r i n gm e t a m o r p h i s m ，w eu s e dr t - p c r t od e t e r m i n et h er e l a t i v el e v e lo ft ht r a n s c r i p t i nt h et h r e ed e v e l o p m e n t a ls t a g e s ( 1 a r v a e ，p u p a ea n da d u l t s ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t r o t hm r n aw a sd e t e c t e di nh i 【g hl e v e l si nt h ef a tb o d ya n di n t e g u m e n ti nt h ei n i t i a l s t a g e so fl a r v a e ，p u p aa n da d u l t sw h e nt h en e w l yf o r m e dc u t i c l ew a sj u s ts t a r t i n gt ot a n l v 黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究 英文摘要 a n dd a r k e n t h e nt h et m t hm r n ag r a d u a l l yd e c r e a s e do rd i s a p p e a r e du n t i ltm o l i t o r w a sf u l l ym a t u r ei ne a c hs t a g ee x c e p tp u p aw h e nc u t i c l et a n n i n gw a st o w a r d st h ee n d i t d e m o n s t r a t e dac o r r e l a t i o nb e t w e e nt h et ht r a n s c r i p ta b u n d a n c ea n dt h ed e g r e eo f t a n n i n g t os t u d yt h et y r o s i n eh y d r o x y l a s eo ftm o l i t o ri nv i t r o ，t h et m t hw a st h e nc l o n e d i n t op e t 2 8 a ( + ) f o rp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ni ne s c h e r i c h i ac o l ib l 21 t h er e s u l t so f s d s - p a g ei n d i c a t et h a tw eg o taf u s i o np r o t e i n - 6 2k dp r o t e i nw i t h6 x h i s - t a gi n e s c h e r i c h i ac o l ib l 21 t h i sw i l ll a yt h ef o u n d a t i o nf o rr e s e a r c h e so n e n z y m a t i c p r o p e r t i e sa n dr e g u l a t i o no ft m t h i nv i t r o i nt h ef u t u r eo u rw o r kw i l lm a i n l yf a c eo n t h er e s e a r c h e so ft m t hi nv i t r o i no u rr e s e a r c h ，w ec h a r a c t e r i z e dt y r o s i n eh y d r o x y l a s eo ft e n e b r i om o l i t o r ( t m w h o o fc o l e o p t e r ai n s e c t sf i r s t l y w ec l o n e dt m t hb yr a c ea n dp c rm e t h o d s ，a n a l y s e d t h ee x p r e s s i o np a t t e r ni nv i v oa n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ni nv i t r o w ea s s e s s e dt h e p r e l i m i n a r yf u n c t i o no ft m t hi ni t s n e u r a la c t i v i t y , c u t i c l et a n n i n ga n di l m n u n e d e f e n s e t h i sw i l ln o to n l yl a yt h et h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rt h es t u d yo fe p i d e r m i s f o r m a t i o nm e c h a n i s mo fc o l e o p t e r ai n s e c t s ，b u ta l s op r o v i d ep r a c t i c a lr e f e r e n c et o s t u d yt h ei n s e c tp e s tc o n t r 0 1 k e y w o r d s ：t e n e b r i om o l i t o r ；t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ；m o l e c u l a rc l o n i n g ；r t - p c r ； t a n n i n g ；i m m u n i z a t i o n ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n v w r i t t e nb y ：w a n gd a - y o n g s u p e r v i s e db y ：x uw e i - a n 目录 前言1 第一章综述4 第一节昆虫表皮骨化研究进展4 第二节哺乳动物酪氨酸羟化酶研究进展1 3 第三节昆虫酪氨酸羟化酶研究进展2 l 第二章材料和方法“”2 8 1 实验材料”2 8 2 常用仪器设备”3 1 3 常用方法”3 2 第三章黄粉虫酪氨酸羟化酶基因的克隆及生物信息学分析”4 0 1 材料与方法4 0 2 结果与分析4 3 3 讨论5 4 第四章黄粉虫酪氨酸羟化酶变态发育中的功能分析5 6 l 材料与方法5 6 2 结果与分析5 9 3 讨论6 7 第五章黄粉虫酪氨酸羟化酶基因的原核表达一6 9 1 材料与方法6 9 2 结果与分析7 l 3 讨论7 3 第六章小结7 5 1 黄粉虫酪氨酸羟化酶基因的克隆及序列分析“”7 5 2 黄粉虫酪氨酸羟化酶变态发育中的功能分析_ o 7 5 3 黄粉虫酪氨酸羟化酶体外原核表达研究y 7 6 参考文献：”7 7 附录”9 l 研究生期间科研成果9 5 致谢9 6 黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究刖舀 t 上_ j 一 刖吾 黄粉虫f t e n e b r i om o l i w r ) ，又称面包虫，属鞘翅目拟步甲科( c o l e o p t e r a ： t e n e b r i o n i d a e ) 类，是一种在世界范围内分布的仓储害虫，同时也是一种常用的生 理生化、遗传学实验材料，对它的生物学特性、遗传特性及生理、病理、防治方 法等均有大量的研究报道。黄粉虫一生经卵、幼虫、蛹、成虫四个虫态变化，完 成_ 世代约需4 8 天。在2 7 0 c ，相对湿度7 0 条件下，卵期4 7 天，幼虫期2 5 - 3 8 天，蛹期6 8 天，成虫卵前期4 5 天，成虫寿命可达6 0 多天，产卵可延续5 0 天以 上【1 1 。根据黄粉虫幼虫脱皮次数，可将幼虫划分为1 3 龄，每龄幼虫的体长及头壳 宽相对稳定，可作为幼虫的分龄依据 2 1 。 昆虫体壁( i n t e g u m e n t ) 具有高等动物皮肤和骨骼的双重功能，使虫体得到严密 的保护和坚强的支撑，并为肌肉提供着生点。昆虫体壁包括真皮细胞( e p i d e r f i a a l c e l l ) 、表皮( c u t i c l e ) 和底膜( b a s e m e n tm e m b r a n e ) 。表皮是真皮细胞分泌的产物，一 般分为上表皮和原表皮，原表皮上层鞣化的为外表皮，下层未鞣化的为内表皮。 体壁对昆虫来说具有良好的保护功能，是昆虫免受病菌感染、天敌寄生或捕食、 抵御杀虫剂等化学物质侵害，避免体内水分散失的第一道防线。昆虫体壁结构的 多样性不仅赋予了昆虫形形色色的外形，还使昆虫获得了多种机械功能。体壁结 构和组分的复杂性，反映出它对所在生态环境的适应能力，同时昆虫各种生理生 化过程大都与体壁有密切的关系，其是一个复杂的代谢库。在提供保护的同时， 坚硬的体壁对昆虫体躯生长产生很大限制，因此昆虫必须周期性的蜕皮。昆虫蜕 皮包括皮层溶离和脱去旧表皮两个过程，且新表皮形成贯穿在整个蜕皮期间，在 蜕皮后通过鞣化或骨化，使表皮在硬度、色泽及透水性等一些列物理性状上发生 变化并存在区域差掣引。 昆虫缺少适应性的免疫系统，仅依赖于先天免疫有效的对入侵微生物产生免 疫应答防御【4 ，5 】，昆虫免疫系统建立在细胞及体液免疫之上，后者诱导一系列免疫 相关蛋白的大量合成及激活并合成黑色素【6 】，黑色素及其母体均具有细胞毒性和抗 菌性，参与到包括吞噬、病原体包裹及伤口愈合等一系列反应中【7 ，8 】。在昆虫一些 前言黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究 免疫反应中，3 ，4 二羟苯丙氨酸( d o p a ) 在新形成表皮鞣化及黑色素合成中是必需 的，其由酪氨酸羟化产生，酪氨酸在酶的作用下羟化为d o p a ，d o p a 再在一系列酶 的作用下转化为儿茶酚类及其衍生物，并且参与到鞣化与免疫黑化中。酪氨酸的 羟化反应可以被两种类型的酶所催化：酪氨酸羟化酶( t h ) 及酚氧化酶( p o ) 9 ，l o 】。 酪氨酸羟化酶是催化合成儿茶酚胺类神经递质多巴胺、去甲肾上腺素及肾上 腺素的起始酶，也是该生物合成过程中的限速步骤】。在t h 所催化的反应中， 氧气、l 酪氨酸及四氢生物喋呤( t e t r a h y d r o b i o p t e r i n ，b i - h ) 共同作用合成l 二羟基 苯丙氨酸( l d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e ，l d o p a ) 及4 a - 羟基四氢生物喋呤( 4 a h y d r o x y t e t r a h y d r o b i o p t e r i n ，4 a o h b i - h ) 1 2 】，且在底物与酶的结合过程中存在顺序性，其 结合顺序依次为四氢生物喋呤，氧气，酪氨酸，然后发生羟化反应，4 a 羟基四氢 生物喋呤迅速脱水变为相对较稳定的醌型二氢生物喋呤( q b h 2 ) ，对鼠重组t h 催 化反应的稳定动力学机制研究发现，随后t h 再与四氢生物喋呤、氧气及酪氨酸结 合并发生催化反应【1 3 】。 t h 与苯丙氨酸羟化酶( p h e n y l a l a n i n eh y d r o x y l a s e ，p a h ，e c1 1 4 1 6 1 ) 及色氨酸 羟化酶( t r y p t o p h a nh y d r o x y l a s e ，t p h ，e c1 1 4 1 6 4 ) 在蛋白序列同源性及催化机制 上有着十分高的相似性，这三种酶共同隶属于芳香族氨基酸羟化酶。3 种芳香族氨 基酸羟化酶均由多亚基组成，亚基由n 端的调节区及c 端的催化区组成，n 端同 源性较差，c 端活性中心部位非常保守。每个亚单位中均含有一个非血红素铁原子1 1 4 ， t h 中铁原子位点的结构已利用光谱学技术及x 射线衍射晶体分析技术得到研究i l 引。 在哺乳动物中，t h 基因在很多物种中已被定性，一般一个基因编码一种形式 的酶，但在高级灵长类中发现存在特殊情况，可通过选择性剪切出多种形式的同 工酶：在猴中有两种 1 6 1 ，人中有四种【1 7 , 1 8 】。 酪氨酸羟化酶在脊椎动物及无脊椎动物中是高保守的。在黑腹果蝇( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) 中，p l e 缺陷型首次被发现可导致胚胎致死【1 9 】，其对应于染色体掰 基因位置。试验证明p l e 确实编码册基因 2 0 l ，随后有学者报道，在果蝇中掰基 因通过选择性剪切可产生两种亚型【2 l 】，在粘虫( p s e u d a l e t i as e p a r a t a ) 中也同样发现 存在两种亚型2 2 1 。果蝇t h 突变研究发现其是表皮鞣化及神经功能发挥所必须的 【l o ，2 3 2 4 2 5 1 。最近对橄榄凤蝶印f 砌x u t h u s ) 及粘虫的相关研究发现1 h 在褐色条纹表 皮细胞下表达【2 2 2 6 1 。此外许多试验证明t h 与免疫功能密切相关：果蝇微阵列分析 2 黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究 前言 表明成虫在注射诱导后t h 基因表达上调f 2 7 】；在免疫诱导后的大蜡螟( g a l l e r i a m e l l o n e l l a ) 血淋巴及野蚕( s a m i ac y n t h 扬，缸加f ) 脂肪体中也检测到类似现象【2 8 2 9 】；对 烟草天蛾( m a n d u c as e x t a ) 的研究发现t h 参与到表皮鞣化及免疫反应中【l o l ，这些均 表明t h 在昆虫表皮鞣化及防御反应中扮演重要角色。此外，人、鼠、果蝇及烟草 天蛾的重组t h 均在体外成功表达并对体外重组蛋白的酶学性质及调控进行了详 细研究。 目前对昆虫t h 的研究主要集中在双翅目及鳞翅目类，且尤以黑腹果蝇研究较 为深入，但对鞘翅目类昆虫的研究目前尚未见报道。 本研究即是以鞘翅目模式动物之一的黄粉虫为实验对象，对黄粉虫酪氨酸羟 化酶的基因特性及在黄粉虫体内的基本功能进行了研究，并获得该酶的体外重组 蛋白，为以后的研究打下基础。通过简并引物p c r 技术及r a c e 技术克隆获得了 黄粉虫t h 基i 丙i ( t m t h ) 序列并进行了一系列的生物信息学分析来研究砌册基因 特性；采用r t - p c r 技术分析t h 在黄粉虫中的表达特性；通过灭活细菌及真菌免 疫诱导研究t m t h 在黄粉虫免疫反应中的作用并对免疫时效性及诱导特异性进行 了分析；通过r t - p c r 研究了黄粉虫不同发育阶段特异时期时t m t h 的表达，分析 了其与表皮鞣化间的相关性；此外为研究t h 蛋白的体外酶学性质，以p e t 2 8 a ( + ) 为载体在b l 2 1 细胞中对t m t h 进行了原核表达。通过本课题的研究，获得了黄 粉虫酪氨酸羟化酶基因的全长序列，并明确了该酶基因在不同组织部位、不同发 育阶段特定时期及外源物质诱导后的表达特征，阐述了其在黄粉虫表皮鞣化及免 疫反应中的相关功能。同时t m t h 原核表达成功，这为酪氨酸羟化酶蛋白体外酶 学性质研究及体外调控研究的进一步深入打下基础，也将成为我们未来工作的重 点。以上研究不仅对研究以黄粉虫为代表的鞘翅目昆虫表皮形成机理具有重要的 理论意义，也为研究昆虫病虫害防治提供了一个实践上的参考。 ” 一 t - 一一，一o 一一 第一章 黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究 第一章综述 第一节昆虫表皮骨化研究进展 摘要：昆虫表皮不同区域由于在骨化过程中稳定性及硬化程度的不同而具有 不同的机械性能，骨化是酚类物质与蛋白质相互交联的过程。我们对昆虫表皮骨 化化学过程的了解起始于1 9 4 0 年m a r kp r y o r 的研究，m a r kp r y o r 认为酶促反应所 产生的邻醌类物质与游离的氨基基团反应，从而使其与表皮蛋白发生交联，后续 的研究也进一步证实了m a r kp r y o r 的观点，正如本文所综述的，许多学者的研究 及实验使昆虫表皮骨化的复杂过程更加详细明确。然而，许多重要问题还亟待解 决，特别是在骨化过程中不同时期阶段的准确部位及时序调节。 关键词：表皮；骨化；鞣化；交联一 坚硬的昆虫体壁对昆虫具有良好的保护作用，但其也对昆虫体躯的成长产生 限制，因此昆虫必须通过周期性蜕皮( e c d y s i s ) 来解除该限制。昆虫的蜕皮过程一般 需经过皮层溶离、新表皮沉积、蜕去旧表皮、新表皮的鞣化和暗化等步骤，这些 过程必须在蜕皮激素的调控作用下，才能有条不紊的进行。昆虫新表皮的形成贯 穿在整个蜕皮期间，即蜕皮以后新表皮还在继续产生，可能一直维持到下一次蜕 皮。全变态昆虫( h o l o m e t a b o l o u s ) 生要经过多次蜕皮才能成熟，包括胚胎孵化蜕 皮( h a t c h ) 、幼虫不同龄期间的蜕皮( 1 a r v a lm o l t i n g ) 、幼虫到蛹的蜕皮( p u p a t i o n ) 和蛹 到成虫的蜕皮( e m e r g e n c e ) ，蜕皮是昆虫两个虫龄或虫态的分界线【3 j 。 新的昆虫表皮在形成后要通过鞣化或骨化使其在硬度、色泽和透水性等一系 列物理性状上发生变化。下面将对昆虫表皮的骨化的过程及已存在的几种机理进 行详细阐述，使大家更加了解昆虫表皮的骨化过程，为大家进一步完善该过程提 供依据。 、 1 昆虫表皮的骨化 表皮骨化即表皮与酚类化合物相互交联而使表皮稳定的过程，大量综述对该 4 黄粉虫酪氨酸羟化酶基因克隆、功能分析及原核表达研究第一章 过程进行了阐述【3 0 , 3 1 , 3 2 , 3 3 , 3 4 , 3 5 】。骨化过程的主要特征已被定性，但在一些细节上始 终存在争议，一些方面也未经深究。昆虫表皮存在多种物质，它们在厚度、硬度、 强度、弹性及颜色上有很大的区别，它们都含有前表皮的基本结构，前表皮由壳 多糖丝与蛋白基质交联，并覆盖有角质层( e p i c u t i c l e ) ，角质层主要成分是脂类及蛋 白质，表皮的多样性主要是由于分子结构及蛋白质组分的不同而造成的，同时表 皮的骨化在其中也发挥重要作用。表皮的每一个局部区域都会发生骨化并达到可 行使最佳功能的生理状态，但是每个区域的不同是如何产生的及该过程是如何被 调控的仍研究的不太深入。 在表皮骨化中，两种酰基多巴胺，n 一乙酰多巴胺烈- a c e t y l d o p a m i n e ，n a d a ，i v ) 【3 6 1 及n p 丙酰基多巴胺( n p a l a n y ld o p a m i n e ，n b a d ，v ) 3 7 1 发生氧化并交联入表皮 基质( c u t i c u l a rm a t r i x ) d p ，这种交联在脱皮之前( p r e - e c d y s i a ls e l e r o t i z a t i o n ) 及在蜕皮 之后( p o s t - e e d y s i a ls e l e r o f i z a t i o n ) 的很短一段时间内完成。在昆虫中除n a d a 及 n b a d 可作为骨化的前体物质外，还存在其他的儿茶酚类前体物质。 昆虫表皮的骨化过程如图1 1 所示，如下将对其中的一些细节进行阐述。表皮 骨化的第一步为酪氨酸( i ) 羟化为多巴( i i ) ，后多巴脱羧为多巴胺( i i i ) ，再形成两种 酰基多巴胺n a d a ( i v ) 及n b a d ) 。表皮骨化过程一旦起始，n a d a 与n b a d 都将从表皮细胞转入表皮基质( c u t i c u l a rm a t r i x ) 中并氧化为对应的邻醌类物质 ( o r t h o - q u i n o n e s ，v i ，v i i ) ，邻醌类可与可用亲核基团( n u c l e o p h i l i cg r o u p s ) 反应或重 排为对