（应用化学专业论文）两性表面活性剂与DNA相互作用的研究.pdf

中国日片j 化学工业研究院 硕士学位论文 摘要 在水溶液中表面活性剂可与d n a 相互作用形成复合物，由于其可以作为潜在的非 病毒基因载体而成为近年来研究的热点。阳离子表面活性剂通过静电引力诱导d n a 发 生舒展线团状向紧密小球状的构象转变。但是由于阳离子表面活性剂的生物毒性及与 d n a 相互作用程度的不可控性等缺点限制了其可能的应用。 两性表面活性剂在一定条件可实现非离子态向阳离子的转变，然而目前对p h 敏感 的两性表面活性剂一d n a 复合物的研究还较少。为了深入研究外界环境对表面活性剂与 d n a 相互作用的影响，本论文在前人对两性表面活性剂与d n a 相互作用研究工作的基 础上，着重研究了烷基二甲基氧化胺与d n a 之间的相互作用，并对形成复合物可能的 机理进行了阐述。研究中首先通过浊度法、紫外光谱法确定了二者相互作用的相图；进 而选取不同相区有代表性的点，采用表面张力法、z e t a 电位法、荧光探针法等进一步研 究了体系的相互作用。结果表明在中性条件下，烷基二甲基氧化胺与d n a 不产生明显 的相分离，但表面活性剂浓度达到临界胶束浓度( c m c ) 时，二者可以通过弱的疏水作 用形成复合物。随p h 降低，两性表面活性剂与溶液中的质子结合而逐渐质子化为阳离 子态。其与d n a 相互作用的强度随烷基二甲基氧化胺质子化度的升高而明显升高，表 现出与阳离子表面活性剂一样的强烈静电引力作用。而通过这种强的静电引力作用导致 体系发生相分离则需要同时具备两个条件：临界p h 与临界胶束浓度。通过相图研究得 到了临界p h 受烷基二甲基氧化胺浓度影响显著的相区，在该表面活性剂浓度范围内调 节p h ，改变烷基二甲基氧化胺的质子化度可以实现对其与d n a 相互作用程度的调节。 利用烷基二甲基氧化胺质子化时可能形成二聚体的理论，尝试解释了体系p h 改变时烷 基二甲基氧化胺与d n a 相互作用而形成复合物的机理。 本论文还研究十二烷基磷酸三甲铵基乙酯与d n a 的相互作用，它是对c a c l 2 浓度敏 感的新型两性表面活性剂。实验结果表明它与d n a 的作用较弱，并且在较高c a c l 2 浓度 时体系产生的相分离是盐析作用导致的。此外，本论文对小分子的精胺与d n a 相互作 用的初探研究中发现：带有多个正电荷的精胺与d n a 相互作用的静电引力相当强。通 过本论文的研究期望对扩展表面活性剂在生命科学领域的应用起到一定作用。 关键词：两性表面活性剂；d n a ；相互作用：烷基二甲基氧化胺；p h ；临界胶束浓度 p 国日用化学t = 业研究院硕 学位论文 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，s p e c i a la t t e n t i o nh a sb e e np a i dt ot h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n d s u r f a e t a n t si ns o l u t i o n ，a n dt h es u r f a c t a n t d n ac o m p l e xh a sb e e ns t u d i e de x t e n s i v e l yf o r a p p l i e da sap o t e n t i a ln o n - 啊r a lg e n ev e c t o r m a n yp a p e r sh a v ed i s c u s s e dt h ep h e n o m e n o no f d n ac o m b i n e dw i t ho p p o s i t e l yc h a r g e dc a t i o n i cs u r f a c t a n t sb ye l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o n ，a n dt h e c o n f o r m a t i o no fd n ac h a n g i n gf r o mu n f o l d e dc o i lt oc o m p a c t e dg l o b u l e b u ts o m e d i s a d v a n t a g e s ，s u c ha s c e l lt o x i c i t ya n du n c o n t r o l l a b l ec o m b i n a t i o n ，r e s t r i c tt h ep o t e n t i a l a p p l i c a t i o no fc a t i o n i cs u r f a c t a n t d n ac o m p l e x t h ef o r mo fa m p h o t e r i cs u r f a c t a n tc o n v e r t sf r o mn o n - i o n i ct oc a t i o n i cs u r f a c t a n ti n s p e c i a lc o n d i t i o n a sy e t ，f e wp a p e r sh a v ed i s c u s s e dp h - s e n s i t i v ea m p h o t e r i cs u r f a c t a n t d n a c o m p l e x e s i no r d e rt os t u d yt h ei n f l u e n c eo fe n v i r o n m e n to ns u r f a c t a n t - d n ai n t e r a c t i o n i n d e p t h ，t h es t u d yo fa l k y l d i m e t h y l a m i n eo x i d e - d n ai n t e r a c t i o nw a se m p h a s i z e di n t h i s p a p e r , a n dt h em e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o nw a se x p a t i a t e d b a s e do np r e v i o u sr e s e a r c h 1 1 1 e r e s e a r c hs t a r t e da tp h a s ed i a g r a mt h a td e t e r m i n e db yt u r b i d i t ya n du v - s p e c t r u m t h e n ， p h a s e p o i n t s w e r ec h o u s e di nd i f f e r e n t p h a s er e g i o n a n d t h ef u r t h e rr e s e a r c ho f a l k y l d i m e t h y l a m i n eo x i d e d n ai n t e r a c t i o nw a si n v e s t i g a t e db yt h em e t h o d so fs u r f a c e t e n s i o n ，z e t ap o t e n t i a l ，f l u o r e s c e n tp r o b ea n ds oo n t h er e s u l t so fn e u t r a ls o l u t i o ni n d i c a t e d t h a tn oo b v i o u sp h a s es e p a r a t i o nw a so b s e r v e di nd n a - a l k y l d i m e t h y l a m i n eo x i d es y s t e m b u tw h i l em i c e l l ef o r m e d t h es u r f a c t a n t d n ac o m p l e x e sw e r ec a m ei n t ob e i n gt h a ti n d u c e d b yw e a kh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n a sp ho fs o l u t i o nd e c r e a s i n g ，n o n i o n i ca m p h o t e r i c s u r f a c t a n tc o m b i n e dw i t hap r o t o na n dc o n v e n e di n t oc a t i o n i cs p e c i e s w h i l es u r f a c t a n t p r o t o n i z i n g ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n a a n da l k y l d i m e t h y l a m i n eo x i d eb e c a m es t r o n g e r , w h i c hw a ss i m i l a rt ot h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o no fc a t i o n i cs u r f a c t a n t c r i t i c a lp ha n dc r i t i c a l m i c e l l ec o n c e n t r a t i o n ( c m c ) t h o s ew e r ei n d i s p e n s a b l et ot h eo c c u r r e n c eo fp h a s es e p a r a t i o n ， w h i c hi n d u c e db ye l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n t h ep h a s er e g i o nt h a tc r i t i c a lp hi n f l u e n c e db y s u r f a c t a n tc o n c e n t r a t i o no b v i o u s l yw a so b t a i n e db yp h a s ed i a g r a ms t u d y i nt h i sp h a s e r e g i o n ， t h ed e g r e eo fi n t e r a c t i o nc o u l db ea d j u s t e db yc h a n g i n gt h ep r o t o n a t i o nd e g r e e i na d d i t i o n ， b a s e do nt h ea l k y l d i m e t h y l m n i n eo x i d ed i m e rh y p o t h e s i s ，t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo f p h a s e b e h a v i o rw f l si n t e r p r e t e d t h i sp a p e rd i s c u s s e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n d2 - t r i m e t h y l a m i n oe t h y ld o d e c a n e p h o s p h o n a t e ，an e wa m p h o t e r i cs u r f a c t a n tt h a ti ss e n s i t i v et oc a c l 2 t h er e s u l ts h o w e dt h a t w e a ki n t e r a c t i o nb e t w e e nt h e ma n ds a l t i n go u tw a sd o m i n a n ti nh i g hc a c l 2c o n c e n t r a t i o n s y s t e m a n d ，s p e r m i n e d n as y s t e mw a sd i s c u s s e dt o o t h es t r o n g e re l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n w a so c c u r r e db e t w e e nd n aa n ds p e r m i n e ，am u l t i c a t i o n i cm o l e c u l e t h er e s e a r c ho ft h i s p a p e rw a sl o o kf o r w a r dt oe x p a n d i n gt h es u r f a c t a n ta p p l i c a t i o ni nl i f es c i e n c e s k e yw o r d s ：a m p h o t e r i cs u r f a c t a n t ，d n a ，i n t e r a c t i o n ，a l k y l d i m e t h y l a m i n eo x i d e ，p h ，c m c 创新性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得 的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的科研成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名 关于学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解主鱼旦旦些堂苎些堑宝蹩有关保留、使用学位论文的规 定，同意主国旦旦垡生墨些壁宝瞳保留或向国家有关郡门或机构送交论文复印件和电 子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权生圜旦旦焦堂三些叠究堕可以将本学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文和汇编本学位论文。本论文所取得的研究成果属主圜旦旦垡生墨些盟宝瞳，其他 任何个人或集体未经授权不得使用。 论文作者签名： 导师签名：毯垒1日期：丝! ：! ：塑 中国日用化学工业研究院 硕士学位论文 主要创新点 l ，通过浊度法确定了烷基二甲基氧化胺型两性表面活性剂与d n a 相互作用的相图，利 用形成d n a ，表面活性剂复合物时体系浊度的变化确定了不同p h 的相分离点。 2 根据烷基二甲基氧化胺在质子化过程中可能形成二聚体的理论，解释了十二烷基二甲 基氧化胺与d n a 相互作用的过程。 3 本论文将z e t a 电位法与荧光探针法应用于研究两性表面活性剂一d n a 体系。 4 首次对两性表面活性剂十二烷基磷酸三甲铵基乙酯与d n a 的相互作用进行了研究。 采用表面张力、紫外光谱等方法研究了c a c l 2 浓度对体系相互作用的影响。 5 精胺与d n a 相互作用的宏观研究发现，二者间静电引力相当强，但无疏水相互作用。 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 分子生物学的发展使基因疗法有可能实现对疾病的分子水平治疗【l 2 】。基因疗法 的关键步骤之一就是使体外重组的d n a 片段在基因载体的携带下进入细胞【3 4 】。表面 活性剂与d n a 相互作用最重要的潜在应用是在基因修饰及其控制基因传输过程中的 关键作用。相对于脂质体，表面活性剂价格低廉、易于保存；更重要的是，表面活性 剂结构易于调控，使研究生物大分子与两亲分子形成复合物的结构与二者作用方式之 间的关系成为可能。另外，表面活性荆在生物体内也不会像噬菌体那样引起细胞免疫 响应。因此，近年来以表面活性剂d n a 复合物为基因传输介质的非病毒载体成为研 究的热点p j 。 d n a 是具有双链螺旋结构并且在水溶液中带有高度负电的生物聚电解质。d n a 分子可以不同构象存在：细胞中天然d n a 常以紧密集堆积的小球状方式存在，而水 溶液中的d n a 一般以空间舒展的线圈状形式存在 6 。将重组的d n a 缩拢成质密的小 球输入细胞的过程是实现基因转染的关键步骤 7 。在水溶液中，某些小分子达到一定 浓度、温度或溶剂性质改变时，也有可能与d n a 相互作用形成复合物，并诱导d n a 构象发生上述转变。近年来有许多关于d n a 可与阳离子表面活性剂及阳离子脂质体 发生相互作用形成复合物，并伴随d n a 构象转变的报道0 1 ，这些研究结果为基因 疗法开辟了可能的途径 6 , 1 1 , 1 2 】，并正在向临床治疗转化 1 3 , 1 4 。但由于阳离子表面活性 剂体系一些不可避免的缺点，如阳离子表面活性剂的细胞毒性、与d n a 形成复合物 稳定性低等，限制了其可能的应用。所以人们对其它类型的表面活性剂与d n a 的相 互作用进行了研究，如对g e m i n i 型表面活性剂d n a 复合物的研究等【1 5 - 1 7 。本文研 究的两性表面活性剂在一定程度上避免了阳离子表面活性剂的缺点，并具有其它表面 活性剂没有的独特性质。因此，两性表面活性剂有可能作为研究d n a 与表面活性剂 相互作用的模型化合物而成为新的研究热点。 本章首先叙述了d n a 的性质、两性表面活性剂的特点以及表面活性剂一d n a 复 合物作为基因载体的研究背景，接下来主要介绍了研究表面活性剂与d n a 相互作用 的常用方法以及如今国际上对两性表面活性剂与d n a 相互作用的相关文献报道和主 要的研究结果。 中国日用化学j r 业研究院硕十学位论文 1 2d n a 的性质 脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) ，是一种主要存在于生物体细胞核 内的重要大分子，它是遗传信息的主要载体1 5 。d n a 的基本单位脱氧核苷酸， 它是由脱氧戊糖与碱基通过n 苷键连接形成脱氧核苷，脱氧核苷与磷酸组成脱氧核 苷酸( 如下所示) ： 嘌呤、 嘧啶，碱 基脱氧核q 脱氧戊糖jl 脱氧核苷酸卜脱氧核糖核酸 磷酸j d n a 的空间结构是由碱基氢键作用力形成的特殊双螺旋结构，它在不同的环境 中以不同的空间结构存在，如右手螺旋的a 、b 、c 、d 型和左手螺旋的z 型等，天 然d n a 在正常的生理条件下是以b 型存在的( 如图1 1 ) 。 d n a 中脱氧核苷酸除末端磷酸残基外，其骨架的磷酸二酯中磷酸残基只有一个 解离常数，p k a = 1 5 。由于磷酸残基中p k a 较低，而且有多价解离性，因此，在p n 4 的 水溶液中，核酸几乎全部以“聚阴离子”状态 存在。体系的p h 直接影响d n a 双螺旋结构 中碱基对问氢键的稳定性；只有p h 在4 , 0 11 0 之间，碱基对间的氢键是稳定的；p h 超过此 范围，d n a 结构与性质可能要发生改变。并 且d n a 具有两性的特点，其等电点为p h = 4 0 4 5 ，此时其溶解度最低，其磷酸骨架中的 磷酸根可以电离呈阴离子状态，因此，为了便 于研究，在化学领域常将d n a 看作一种带高 图1 1 d n a 结构示意圈 度负电荷的生物聚电解质或聚阴离子。 f i g 1 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f d n a c o n f l g u r a t i o n 1 3 两性表面活- 性剂 两性表面活性剂( a m p h o t e r i cs u r f a c t a n t ) ”圳1 是指在同分子中存在被桥联的 一个或多个正、负电荷中心或偶极中心的一类表面活性剂。该类表面活性剂的特点是 具有等电点( p i ) ，即以内盐形式存在的两性表面活性剂在静电场中不向任何极移动 时溶液的p h 。 第一章绪论 两性表面活性剂主要分为甜菜碱型、咪唑啉型、氨基酸型、氧化胺型以及聚合型 几类。广义的两性表面活性剂包括在等电点及以上都以内盐形式存在的两性离予型表 面活性剂( z w i t t e r i o n i cs u r f a c t a n t ) ，如烷基甜菜碱、眯唑啉等都是含强碱性季铵n 的 两性表面活性剂。两性表面活性剂具有很多独特的性质：在相当宽的p h 范围内具有 良好的水溶性、表面活性及配伍性，同时具有良好的钙皂分散性及生物降解性等。 典型的两性表面活性剂，如氨基酸型两性表面活性剂等，在溶液中表现出的特征 是：亲水基性质随p h 的升高而发生由阳离子型到阴离子型表面活性剂的转变，转变 中存在一个等电点，在该点分子显示两性离子表面活性剂的性质，并表现出独特的性 质。当p h 在等电点以下，分子负电荷中心接受质子，表面活性剂以阳离子形式存在； 在等电点以上，分子正电荷中心失去质子，表面活性剂以阴离子形式存在：而在等电 点附近，分子正负电荷中心以内盐形式存在，整个分子对外显示不带电荷( 如图1 2 ) 。 w f 、11 4 r 1 r n h c h 2 c 0 0 警n a o hr n + h 2 c h 2 c o o 兰鳖r n + h 2 c h 2 c o o h n a o h z2 砸h f 1 h 册料 图1 - 2 含弱碱性n 的两性表面活性剂不| 司p h 时，结构与所带电荷的关系 f i g 1 - 2 r e l a t i o n s h i p b e t w e e ns t r u c t u r ea n dc h a r g eo f a m p h o t e r i cs u r f a c t a n ta td i f f e r e n t p h 而对于含强碱性n 的两性表面活性剂，如甜菜碱型两性表面活性剂等，在等电 点以下可与体系中的质子结合，表现为阳离子表面活性剂态；然而由于n 原子上没 有可以失去的质子，因此在等电点及以上时，此类两性表面活性剂都是以内盐形式存 在的，因此属于两性离子型表面活性剂( 如图1 3 ) 。 r c ih c o o 。h c lr c ih c o o 。h c lr c ih c o o h h ，c _ 二c h ，意即一卜c h ，意即一 二c h ， c 。h ， c h 3c h 3 特册抖 p t p li ( 幽中：头晕大小表示电荷强度的大小，不表小头基实际j t 寸大小) 图1 - 3 含强碱性n 的两性表面活性剂不同p h 时，结构与所带电荷的关系 f i g 1 - 3 r e l a t i o n s h i p b e t w e e ns 仉l c t u r e a n dc h a r g e o f a n a p h o t e r i cs u r f a c t a n ta t d i f f e r e n t p h 中国日用化学1 业研究院硕十学位论文 近年来，对两性表面活性剂与聚合物的相互作用的研究 2 2 - 2 6 1 表明二者在酸性条件 主要通过静电引力形成复合物，而在中性条件则无复合物生成，但对彼此性质有影响， 并且提高离子强度可促使二者通过氢键发生弱疏水相互作用。 1 3 两性表面活性剂d n a 复合物应用于基因载体的研究背景 近年来，随着基于d n a 重组技术建立的基因工程的发展，极大的推动了分子生物 学的发展，使得对疾病的基因治疗成为医学和生物化学领域的研究热点。基因治疗的 主要过程如下： 1 ) n a 抽提一体外重组一载体封装( 关键步骤之一) 一 克隆筛选一导入细胞一基因复制一基因表达 一般j 隋况下，细胞中的d n a 是以紧密集堆积的方式存在的，而水溶液中则以舒 展的线圈状形式存在。基因治疗过程是在体外将含有缺陷的目的d n a 舒展开，利用 d n a 重组技术，通过限制性内切酶的作用对目的d n a 进行切割，然后通过d n a 连 接酶将外源d n a 引入目的d n a 从而形成重组d n a ，然后将舒展的重组d n a 链压 缩成密堆积形式，通过载体将这种带有目的外源基因片段的d n a 导入受体细胞，进 行细胞增殖和基因的复制与表达。在这个过程中，舒展的d n a 分子的压缩并通过载 体导入细胞的过程是基因治疗的关键步骤之一( 也称为转染过程) 。在生物化学领域 由于病毒载体具有较高的转染率而被广泛使用，如病毒、噬菌体及线粒体等常作为基 因传输介质，但是因为病毒载体具有潜在的免疫危险性而使其应用受到一定限制。由 于发现某些表面活性剂可以与d n a 发生相互作用，并可使d n a 发生线圈状n d , 球 状的构象改变，如表面活性剂、低聚阳离子( 精胺及其衍生物) ，可以诱导d n a 发 生强烈静电作用 2 7 , 2 8 】。因此，近年来以表面活性剂为代表的小分子与d n a 相互作用 形成的复合物作为基因传输的新型非病毒载体的研究成为了基因载体研究的新热点。 表面活性剂分子因其具有两亲性而可与聚合物或生物大分子，如d n a 等，发生 相互作用 2 9 - 3 2 。阴离子表面活性剂与d n a 都带有负电荷，由于同种电荷的静电斥力 作用使二者几乎不发生相互作用【3 3 】。非离子表面活性剂与d n a 之间的相互作用较弱， 主要以溶液的极性、粘度及介电常数来影响d n a 的构象，这与有机溶剂对d n a 构 象的影响相似；也有人认为二者通过氢键发生相互作用，但一般只有在非离子表面活 性剂浓度很高时才能对d n a 构象产生影响 3 4 】；最近有研究发现烷基糖苷非离子表面 活性剂( a p g 在一定条件下可以诱导d n a 发生构象的转变1 3 5 - 3 7 。阳离子表面活性 剂可与d n a 发生强烈相互作用导致d n a 聚沉 3 “，并可使d n a 构象发生从线圈状向 筇一章绪论 小球状的剧烈变化，如十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 与d n a 的相互作用( 如图 1 - 4 ，从左到右c t a b 浓度依次增加，上行为荧光显微镜照片，下行为荧光光密度分 布图) ，二者之间相互作用形成复合物的尺寸大小符合基因转染的要求”，这种强烈 相互作用的主要作用力是相反电荷间的静电引力。并且在此过程中，表面活性剂烷基 链的疏水作用也起到了重要的作用，这使阳离子表面活性剂做为基因输送的非病毒载 体成为可能 4 0 , 4 1 。 ( 上幽为荧光显微镜照片，f 图为荧光光密度圈】 图1 - 4 c t a b 诱导d n a 发生构象转变 f i g 1 - 4 c o i l g l o b u l e t r a n s i t i o n o f d n a i n d u c e d b y c t a b 但是c t a b 较高的水溶性使形成的复合物不够稳定，在接近细胞表面时发生部分 解离，致使d n a 分子不能穿过细胞壁。以脂质体模拟细胞壁的研究表明【1 0 , 3 9 ，阳离 子表面活性剂一d n a 复合物在接近中性脂质体表面时复合物解离，阳离子表面活性剂 插入脂质体，使脂质体表面带正电荷，将d n a 吸附于脂质体表面( 图1 5 a ) 。复合 物接近阴离子脂质体表面时。复合物解离，阳离子表面活性剂通过静电引力插入脂质 体内，中和其表面电荷，使脂质体表面呈现电中性，d n a 分子释放到体相溶液中( 图 1 5 b ) 。而且由于c t a b 的阳离子特性，它具有较高的细胞毒性，这些缺点限制了单 纯阳离子表面活性剂体系应用与基因载体的发展。尽管如此，阳离子表面活性剂依然 是目前所发现的能与d n a 产生最强相互作用的表面活性剂种类。 至今为止，尚未有研究提出理想的理论模型来描述表面活性剂与d n a 相互作用 的机理，因此我们需要一种表面活性剂，它既能够与d n a 可以发生相互作用，同时 这种相互作用又是可以控制的。由于两性表面活性剂具有对p h 、盐度等外界条件反 应灵敏的特性，并且细胞毒性低，故可将其作为模型化合物来研究体系的相互作用。 国日用化学工业研究院硕士学位论文 两性表面活性剂在一定条件下，如p h 低于等电点时，可以像阳离子表面活性剂一样 与d n a 发生相互作用生成稳定的复合物；而p h 高于等电点时，又可使复合物分解， 从而有可能实现与d n a 相互作用的调控。因此，对两性表面活性剂一d n a 复合物形 成过程的研究有可能揭示表面活性剂与d n a 相互作用的机理，并有可能为获得具有 较高安全性和基因转染效率的非病毒载体提供理论参考。 e ， - 性躺鹱体 ( 幽中：a 复合物在中性脂质体表面的解离b 复含物在带负电荷脂质体表面的解离) 图1 - 5 阳离子表面活性剂d n a 复合物在细胞膜表面的解离 f i g 1 - 5 c o m p l e x o f c a t i o n i cs u r f a c t a n t d n a d i s s o c i a t i o na ic e l ls u r f a c e 1 4 两陆表面活性剂与d n a 相互作用的研究方法 一般说来，能够与d n a 发生强烈相互作用的表面活性剂都会诱导其构象发生转 变，并且生成复合物。在对d n a 与表面活性剂相互作用的研究中，既可通过宏观方 法对复合物形态等宏观性质进行表征【3 ”，又可通过微( 介) 观方法对二者相互作用过 程中构象的变化进行分子水平研究【32 1 。 在两性表面活性剂与d n a 相互作用的研究中，可以利用光散射技术和浊度法确 定浊度边界，从而通过相图研究体系组成与相行为的关系【4 2 j3 ；利用紫外光谱及荧光 光谱考察两性表面活性剂与d n a 相互作用的方式及强弱；利用恒温滴定量热可以考 察两性表面活性剂与d n a 相互作用时键合过程中能量的变化，并判断所形成复合物 的成键的情况【3 ” ；通过选择合适的表面活性剂选择性膜电极，可以利用实时电位测 定得到的键合等温线来研究两性表面活性剂与d n a 的键合度；利用z e t a 电位及动态 光散射考察两性表面活性剂一d n a 复合物z e t a 电位及流体力学半径的变化，并可以研 究复合物的表面电位、体积大小与复合物稳定性的关系，以及表面电位与粘度的关系 p o ”j 。通过小角中子衍射技术( s a n s ) ，配合表面张力和表面压测试，可以研究复合 物在气水界面的吸附及表面膜的结构；通过荧光显微镜可观察d n a 分子在复合物形 成过程中构象的变化；应用扫描电子显微镜( s e m ) 可观察复合物的形态；利用圆二 编一 一 b 蕊黼攀癯 满一 毋麟 第一章绪论 色谱( c d ) 可判别复合物形成过程中d n a 双螺旋的二级结构是否发生改型”4 4 1 ；此 外，还可利用核磁共振技术( n m r ) 表征分子结构、聚合物一表面活性剂复合物的细 微结构以及复合物表面电荷的分布1 4 ”。 通常表面活性剂与d n a 发生相互作用的强度与表面活性削的类型、聚电解质的 分子结构、电荷密度，体系各组分浓度、p h 、离子强度以及温度等因素有关。研究 过程中需结合体系的特点而采用不同的研究方法。 】4 。1p h 对两性表面活性剂与d n a 相互作用的影响 十二烷基二甲基氧化胺( d d a o ) 属于氧化胺型两性表面活性剂，结构式如图 1 - 6 所示。d d a o 对体系的p h 很敏感( p k = 5 o ) 4 6 4 7 】。在中性水溶液中，d d a o 呈 现为非离子表面活性剂形态，随p h 降低，d d a o 逐渐发生质子化，分子转变为阳离 子表面活性剂形态。 f 竺a 八八八_ p h 6 h 3 图1 - 6 十二烷基二甲基氧化胺结构式 f i g 1 - 6m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f n n - d i m e t h y l d o d e c y l a m i n en - o x i d e m e l n i k o v a 等研究表明，一定p h 范围d d a o 可以与d n a 发生相互作用形成 复合物，并诱导d n a 发生构象的转变。w a n g 等4 9 1 认为，一定p h 及离子强度时， d d a o 是以表面活性剂胶束的形式与d n a 发生相互作用的，键合的主要作用力是静 电吸引力。 m e l n i k o v a 等【4 8 3 通过荧光显微镜研究了p h 为5 - 8 之间，较大表面活性剂浓度范 围内d n a 与d d a o 是否发生相互作用，以及不同d d a o 浓度下d n a 的构象状态( 图 1 7 ) 。研究结果表明：在一定p h 范围内，当d d a o 达到临界表面活性剂浓度( c 。) 时，全部d n a 分子发生了构象转变，表明d d a o 的存在可以诱导d n a 的构象缩拢， 即发生舒展线圈状向紧缩小球状的不连续转变，这个临界浓度是可以使体系中全部 d n a 发生缩拢的最低表面活性剂浓度，标志着线圈小球共存区的结束。这与 m e | n i k o v 等p o j l l 观察到的阳离子表面活性荆可诱导d n a 发生构象转变的现象是相 同的。表明在特定p h 范围内两性表面活性剂可以象阳离子表面活性剂一样与d n a 发生强烈相互作用。然而在可使d n a 发生缩拢的p h 范围以外，即使d d a o 浓度达 到数倍c m c ，体系也未发生d n a 分子构象的变化。 由于d d a o 在上述p h 范围内质子化度较高，大部分非离子态d d a o 转变为阳 中国日片j 化学工业研究院硕十学位论文 离子态，因此它可与聚阴离子形式存在的d n a 通过静电力发生相互作用；而d d a o 在该p h 范围以外质子化度较低( 多数d d a o 分子以非离子表面活性剂形式存在) ， 因此无论其浓度如何改变都不与d n a 发生键台。但该p h 范围却低于d d a o 单独存 在时完全质子化临界p h 。 扭，c o i l e ds i n g l e d n a p h 一74( b ) c o c x i s t e d c e o f d n a p h 一6 t 5c ) c o m p a c t e d d n a p h = 65 ( 图中：( a ) ( b ) c d d o = 0 0 2 r n o l l ，( c ) 嘶0 - o0 2 m o l l ) 图1 7 不同p h 时d d a o 与d n a 相互作用的荧光显微镜照片 f i g 1 - 7f l u o r e s c e n c e i m a g e so f i n t e r a c t i o n b e t w e e n d d a oa n d d n aa t d i f f e r e n t p h w a n g 等 4 9 的研究表明，一定p h 及离子强度时，d d a o 以表面活性剂胶束形式 通过静电引力与d n a 发生相互作用，并且d n a 与d d a o 胶束的键合与d n a 构象 变化为一协同过程，但二者间的作用强度取决于胶束的表面电荷密度，并且只有达到 临界胶束表面电荷密度( o 。) 以上才能形成复合物，而临界胶束表面电荷密度基本 不随胶束浓度改变，只与胶束形态等因素有关。在研究的p h 范围内，d d a o 胶束的 临界质子化度与离子强度有关。随离子强度增加，d d a o 胶束可发生从球状向棒状 的转交，并且与d n a 的相互作用明显增强，这可以解释为：( 1 ) 球形胶束在其一定 的质子化度( t 3 ) 和离子强度下具有较大曲率，因此与d n a 链相互作用的接触面较 小：( 2 ) 棒状胶束与球形胶束相比具有更高的表面电势，因此棒状胶束有利于形成稳 定性更高的复合物。 1 4 2 离子强度对两性表面活性剂与d n a 相互作用的影响 m e l n i k o v a 等 4 蜘根据相图选择了2 个相区的3 个p h 。考察一定表面活性剂浓度 时，外加电解质对d n a 与d d a o 的相互作用的影响( 图1 8 ) 。研究发现，随p h 升 高使d n a 发生构象缩拢所需的电解质浓度降低，这可能是由于外加电解质屏蔽了双 电层而使d n a d d a o 复合物的静电相互作用减弱所导致的。w a n g 等 4 9 】也认为由于 电解质的加入屏蔽了d n a 与胶束静电作用，从而降低了二者之间的键合亲和力，因 此，提高胶束的表面电荷密度有利于形成较稳定的复合物。在w a n g 等 4 9 】的研究表明， 不同离子强度时，d n a 与d d a o 胶束只有在临界质子化度( b 。) 以上时才能形成复 第一章绪论 合物，并且可以通过改变体系p h 调节胶束中阳离子态d d a o 与非离子态d d a o 的 比率而不是表面活性剂与d n a 的比率来控制复合物的稳定性。d d a o 的临界质子化 度与临界胶束表面电荷密度对应，且随离子强度线性变化，当n a c l 浓度达到o 2 m o l l 时，d d a o 胶束从由球形转变为棒状，此时d d a o 的临界质子化度与离子强度的关 系出现不连续交化。通过光散射研究复合物线圈和小球状共存边界的体系，结果表明 d n a 一胶束复合物的形成与胶束诱导d n a 发生构象转变有关。 ( 图中：d n a 状态一小球状。共存x 一线圈状) 图l - 8 不同p h 时n a c l 对d n a 构象的影响 f i g 1 - 8n a c le f f e c to nt h ed n a a tv a r i o u sp h 1 4 3 相图法研究两性表面活性剂与d n a 的相互作用 在较高浓度的两性表面活性剂与d n a 发生相互作用的体系中，形成的复合物一 般都要发生相分离。借助相图，通过其它技术手段可以研究不同p h 时表面活性剂溶 液中d n a 分子的构象状态 3 ”。因此，相图被认为是研究相互作用体系宏观行为最有 效的手段之一【4 2 l 。 m e l n i k o v a 等 4 8 】以p h = 6 4 和7 4 两个p h 为界将所研究的相图分为如下三个相 区( 如图1 9 ) ，并对各相区解释如下： ( 1 ) p h 6 4 的相区，d d a o 完全质子化，临界表面活性剂浓度很低( 远低于 d d a o 的e r n e ) 且基本不随p h 变化。此相区发生的强相互作用主要是相反电荷的静 电引力作用，d n a 构象的转变过程是反离子扩散的熵驱动过程，这个过程由于聚电 解质诱导表面活性剂的自组装而使聚电解质一表面活性剂复合物的形成变得更容易。 ( 2 ) 6 4 p h 7 4 的相区，即使d d a o 浓度达到很高，d n a 仍只以线圈状存在，表 明在碱性环境中d n a 与d d a o ( 非离子态) 之间的相互作用非常弱，这与聚电解质 与电中性或非离子表面活性剂相互作用的体系相似【2 9 1 。 相同p h 的体系，由于d n a 对d d a o 质子化过程的诱导，d d a o d n a 体系中 d d a o 的质子化度高于单纯表面活性剂溶液时d d a o 的质子化度，因此相区1 到2 转变的p h 明显高于没有d n a 存在时d d a o 完全质子化的p h 。这个结果表明d n a 与d d a o 发生了协同静电相互作用，这同d n a 构象转变与c t a b 聚集体形成的协 同过程是相同的。 图1 - 9 d d a o 。d n a 体系相图( d n a 状态说明同图1 8 ) f i g 1 - 9 p h a s e m a po f d n a d d a os y s t e m 1 4 4 浊度法研究两性表面活性剂与d n a 的相互作用 w a n g 掣4 9 】采用光散射法研究了不同浓度d d a o d n a 体系的浊度一p h 变化关系 ( 如图1 - 1 0 ) 。研究结果表明：较高p h 时，不同d d a o 浓度体系的浊度几乎不随p h 改变；而d d a o 浓度高于其c m c 的体系，使浊度发生剧烈升高的临界p h 随d d a o 浓度变化很小，并且浊度曲线形状几乎相同，可以认为临界p h 与d n a - d d a o 相互 作用开始点相对应。 当d d a o 浓度小于c 1 t i c 时不同浓度d d a o 的体系浊度曲线之间偏离很大，说明 一2s一，_ 第一章绪论 此时表面活性剂多以以单个分子形式与d n a 发生作用，而d d a o 浓度大于c r a g 时， 表面活性剂则以胶束形式与d n a 发生相互作用，从而形成分子量较大的复合物，使体 系浊度显著增加。此外d n a 与d d a o 的摩尔比对临界p h 影响很小，表明键合度主 要是由临界表面电荷密度决定，而不是二者的摩尔比。 l ( d d a o 浓度口= lm m0 = 2 m m o = 1 0 m m v = 5 0 m m ) 图1 - 1 0 ，d n a 与不同浓度d d a o 的浊度滴定曲线 f i g 1 - 1 0 t u r b i d i m e t e r i c t i t r a t i o no f d n a a n dv a r i o u sc d d a o 1 4 5 介电谱及圆二色谱研究两性表面活性剂与d n a 的相互作用 介电谱( d i e l e c t