（生物医学工程专业论文）材料表面拓扑结构和化学组成对细胞响应行为的影响.pdf

武汉理工人学硕士学位论文 3 选用了d l 两种不同构型的半胱氨酸分子( c y s t e i n e ，c y s ) ，通过在金 表面( g o l d ) 自组装的方法分别成功组装上了d 型和l 型的c y s ，并进一步研 究了修饰有这两种不同构型分子的表面( g o l d l - c y s ，g o l d d c y s ) 对l 9 2 9 成 纤维细胞黏附，铺展和增殖的影响。并分别通过蛋白吸附实验和蛋白印迹实验 ( w e s t e r nb l o t ，w b ) 进一步研究了模型蛋白纤维蛋白原( f i b r i n o g e n ，f g ) ，细 胞黏附蛋白f n 与玻连蛋白( v i t r o n e c t i n 。v n ) 在这三种表面上的吸附情况。研 究发现：与l 构型表面相比，组装有d 构型c y s 的表面在最初的1 2 小时内表现 出显著的抗细胞黏附和铺展性能，并且三种表面对细胞黏附的支持程度按g o l d ， g o l d l c y s ，g o l d d c y s 依次递减。蛋白吸附实验表明：无论是在单纯纤维蛋 白原溶液中还是血浆中，与金表面相比，组装有两种不同构型半胱氨酸的表面 对纤维蛋白原吸附都有显著下降，但组装有不同构型半胱氨酸分子的表面之间 的吸附量没有显著差异；蛋白印迹实验结果表明，三种表面对f n ，v n 这两种 细胞黏附蛋白的吸附量均无显著差别，但修饰有两种不同构型c y s 的金表面却 表现出抗血浆中f g 吸附性。 本课题通过考察材料表面拓扑结构、化学组成、手性以及外界重力场因素 对细胞黏附、铺展、取向及增殖等行为的影响，深化了我们对材料表面多种性 质对蛋白质吸附、细胞响应行为影响的认识，因此对生物医用材料的表面的合 理设计、修饰有一定的指导意义。 关键词：软刻蚀，拓扑图案，接触引导，重力场，手性，自组装 j i a b s t r a c t t h ep r o p e r t i e so fam a t e r i a ls u r f a c e ，s u c h a st h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o n s ， t o p o 聊1 1 i c a lf e a t u r e s ，e v e nt h es u r r o u n d i n g f o r c ef i e l da n dt h ec m r a l i t y ，h a v e s i g n i f i c a n ti n f l u e n c e so nt h ec e l lr e s p o n s i v eb e h a v i o r si n c l u d i n ga d h e s i o n ，s p r e a d i n g , p r o l i f e r a t i o n e r e t h e r e f o r e ， w h i l ec o n s i d e r i n gt h ec o m m o n l y o v e r l o o k e d s u 】u n d i n gf o r c ef i e l d ，i n v e s t i g a t i o no nt h ei n f l u e n c eo f t h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o n s ， t o p o g r a p h i c a lf e a t u r e so fas u r f a c eo nc e l l r e s p o n s i v eb e h a v i o r si s v i t a lf o rt h e r a t i o n a ld e s i g n ，m o d i f i c a t i o no f b i o m a t e r i a ls u r f a c ea n dt h ei m p r o v e m e n to f b i o c o m p a t i b i l i t y h lm i sr e s e a r c h ，c h e m i c a llyh o m o g e n e o u st o p o g r a p h i cp a t t e r n s ( d o t - l i k ea n d g r o o v e 1 i k e l w e r ef a b f i c m e do np o l y m e r i c b i o m a t e r i a l ss u r f a c e su s i n g s o f t l i t h o 呈，a p h y t h ei n f l u e n c e so fd o t - l i k et o p o g r a p h ys u r f a c e ( b e f o r ea n da f t e r t h e m o d i f i c a t i o no ff i b r o n c e t i n ( f n ) o nc e l la d h e s i o n ，s p r e a d i n ga n dp r o l i f e r a t i o nw e r e i n v e s t i g a t e d m o r e o v e r , t h ec o m b i n e de f f e c t so f t h ed i r e c t i o no fg r a v i t yf i e l dt o g e t h e r w i t l it h eg r o o v e - l i k ep a t t e r n0 1 1 “c o n t a c tg u i d a n c e o fl 9 2 9 c e l lw e r ea l s o i n v e s t i g a t e d o nt h eo t h e rh a n d ，t o f a b r i c a t ea r t i f i c i a lc h i r a ls u r f a c e s ，d i f f e r e n t c o n f i g u r a t i o a so fc y s t e i n e ( d a n dl ) m o l e c u l e sw e r es e l f - a s s e m b l e do n t ot h eg o l d s 1 1 r f a c e sr e s p e c t i v e l y t h ei n f l u e n c e so ft h et w oa r t i f i c i a lc h i r a l s u r f a c e so np l a s m a p r o t e i na d s o r p t i o n ，l 9 2 9c e l la d h e s i o n ，s p r e a d i n ga n dp r o l i f e r a t i o nb e h a v i o rw e r e s t u m e d t h em a i nc o n t e n t so ft h i ss t u d ya le a sf o l l o w s ： 1 c h e m i c a l l yh o m o g e n e o u sd o t - l i k em i c r o t o p o g r a p h y o i lp o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ( p d m s ) w a sf a b r i c a t e du s i n gs o f t - l i t h o g r a p h yt e c h n i q u e 。t h ep a t t e r no nt h es u r f a c e w a se v e n l yd i s t r i b u t e da n dc h e m i c a l l yh o m o g e n e o u s l 9 2 9c e l la d h e s i o n ，s p r e a d i n g a n dp r o l i f e r a t i o ns t a t i s t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a to na l ls u r f a c e s ，n om a t t e rw i t ho f w i t h o u tp r e a d s o r b e df n ，c e l l sp r o l i f e r a t e dv e r y w e l la n dc e l ld e n s i t yi n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l ya si n e a s i n gc u l t u r et i m ea n d t h ep e r c e n t a g eo fs p r e a dc e l l sc o n s i s t e n t l y i n c r e a s e do ns u r f a c e sw i t hp r e a d s o r b e df n i nc o n t r a s t ，a t7 2h t h ep e r c e n t a g eo f s p r e a dc e l l sd e c r e a s e do ns u r f a c e sw i t h o u tp r e - a d s o r b e df n a m o n g a l lt h es u r f a c e s ， l l i 武汉理工大学硕士学位论文 v i r g i np a t t e r ns u r f a c ew a st h ew o r s ts u b s t r a t e ，w h e r e a sf l a ts u r f a c e sp r e - a d s o r b e df n w a st h eb e s ts u b s t r a t ef o rl 9 2 9c e l ls p r e a d i n g 2 m i c r o g r o o v e l i k ep a t t e r no np d m sw a sf a b r i c a t e du s i n gs o f t - l i t h o g r a p h y t e c h n i q u e t h ec o m b i n e de f f e c t so ft h ed i r e c t i o no fg r a v i t yf i e l dt o g e t h e rw i t ht h e g r o o v e l i k ep a t t e r no nt h eo r i e n t a t i o nb e h a v i o ro fl 9 2 9c e l lw e r ei n v e s t i g a t e d t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，c o m p a r e dw i t ht h ef a c t o ro fg r a v i t yf i e l d ，a l t h o u g h ”c o n t a c t g u i d a n c e ”i n d u c e db yg r o o v e l i k ep a t t e r np l a y sad o m i n a n tr o l ei nd e t e r m i n i n gt h e o r i e n t a t i o no fc e l l ，t h e p h e n o m e n o no f “c o n t a c tg u i d a n c e w a s d i m i n i s h e d s i g n i f i c a n t l yw h e nt h ed i r e c t i o no fg r a v i t yf i e l dw a sv e r t i c a l t ot h ed i r e c t i o no f g r o o v e l i k ep a t t e m n os y n e r g i s t i ci n f l u e n c eo nt h ec e l la l i g n m e n tw a so b s e r v e d w h e nt h ed i r e c t i o no fg r a v i t yf i e l dw a sp a r a l l e lw i t ht h ed i r e c t i o no fg r o o v e l i k e p a t t e r n 3 c y s t e i n e ( c y s ) m o l e c u l e so fd i f f e r e n tc o n f i g u r a t i o n s ( d a n dl 一) w e r e s e l f - a s s e m b l e do n t og o l ds u r f a c er e s p e c t i v e l y ，a n dt h ee f f e c to ft h ea b o v ea r t i f i c i a l c h i r a ls u r f a c e s ( g o l d - l c y s ，g o l d - d c y s ) o nl 9 2 9c e l la d h e s i o na n dp r o l i f e r a t i o n w a si n v e s t i g a t e d t h ei n f l u e n c eo ft h e s es u r f a c e so nm o d e lp r o t e i nf i b r i n o g e n ( f 曲， c e l la d h e s i o np r o t e i nf i b r o n e c t i n ( f n ) ，v i t r o n e c t i n ( 彤a d s o r p t i o nw a sa l s os t u d i e d v i ap r o t e i na d s o r p t i o na s s a ya n dw e s t e r nb l o t ( w b ) a s s a y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ， c o m p a r e dw i t ht h es u r f a c em o d i f i e dw i t hg o l d - l - c y s ，t h eg o l d - d c y se x h i b i t e d s i g n i f i c a n ta n t i c e l la d h e s i o np r o p e r t y , w h i l et h eg o l ds u r f a c es u p p o r t e dc e l la d h e s i o n a n dp r o l i f e r a t i o nb e t t e r f i b r i n o g e n ( f g ) a d s o r p t i o nf r o ms i n g l ep r o t e i ns o l u t i o na n d p l a s m ai n d i c a t e dt h a t ，g o l d l - c y sa n dg o l d d - c y se x h i b i t e de x c e l l e n ta n t i - f g a d s o r p t i o np r o p e r t y , c o m p a r i n g w i t h g o l ds u r f a c e h o w e v e r , n os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e sw a sf o u n db e t w e e ng o l d - l c y sa n dg o l d d - c y s m o r e o v e r , w ba s s a y r e s u l t ss h o w e dt h a ta l t h o u g hn on o t i c e a b l ed i f f e r e n c e sw e r en o t i c e da m o n gt h et h r e e k i n d so fs u r f a c e si nt e r m so ft h ea m o u n to fa d s o r b e df na n dv n ，g o l ds u r f a c e s m o d i f i e dw i t hc y sc a ns e l e c t i v e l ya d s o r bf gi np l a s m a t h i sr e s e a r c hm a yb eh e l p f u lt ot h er a t i o n a l d e s i g na n dm o d i f i c a t i o no f b i o m a t e r i a ls u r f a c ep r o p e r t i e s k e yw o r d s ：s o f t l i t h o g r a p h y ；t o p o g r a p h y ；c o n t a c tg u i d a n c e ；g r a v i t yf i e l d ；c h i r a l i t y ； s e l f - a s s e m b l y i v 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 武汉理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示了谢意。 2 0 口宇f 上6 学位论文使用授权书 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权武汉理工大学可以将本学位论文的 全部内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存或汇编本学位论文。同时授权经武汉理工大学认可的国家有 关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供信息 服务。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生( 签名) 周哞 导师( 签名) 协。日期州- 2 多 武汉理下大学硕十学位论文 第一章绪论 1 1 生物材料的发展历程及组织工程的建立 生物材料( b i o m a t e r i a l s ) 在医学领域中又称为生物医用材料( b i o m e d i c a l m a t e r i a l s ) 是指用于生理系统疾病的诊断、治疗、修复或替换生物体组织或器官， 增进或恢复其功能的材料【l j 。 最初，一些临床应用的生物材料并不是专门针对医用设计的。这些材料在 实现其基本的临床功能的同时，也带来了一系列不良的生物反应，例如术后的 感染、炎症反应、血栓栓塞、组织增生等【2 】。随着对免疫系统的深入认识，人们 逐渐意识到这些不良反应都是由生物医用材料和生命环境之间的非生物相容性 作用造成的。2 0 世纪6 0 , - - - 7 0 年代，开发出物理性能适宜、对宿主反应较小的 组织替代物，但它们大多属于惰性生物材料，其目的是将免疫排斥反应降到最 低。此类惰性生物材料的应用使数千万患者的寿命延长了5 - 2 5 年。到目前为 止，生物材料的发展大致经历了以下3 个阶段：2 0 世纪6 0 - 7 0 年代的第一代 生物材料大多数为生物惰性材料：2 0 世纪8 0 年代开发了生物降解高分子材料， 如聚乳酸( p l a ) ，聚乙醇酸( p g a ) 及其共聚物( p l g a ) ，这些第二代生物材料虽 在矫形外科和心脏瓣膜的修复以及控制释放载体等方面有一定应用，但由于这 些生物材料不能很好地达到应用要求，因此影响不大。第三代生物材料综合了 工程科学与生命科学原理，构筑取代物以修复组织缺损，恢复其部分功能【3 】。从 材料科学角度看，可将组织视同细胞复合材料，它由细胞及其合成与分泌的细 胞外基质( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ，e c m ) 组成，e c m 提供可供细胞识别的外部物理和 化学信号：而与此同时，细胞则负责指导e c m 的合成，细胞与材料之间的这种 “互动 反馈机制决定着细胞的多重响应行为【4 】。目前，随着分子细胞生物学的 发展，第三代生物材料( 细胞和或基因活化生物材料) 的设计理念已逐渐清晰， 即从分子上控制生物材料与细胞间的相互作用，引发特异性细胞反应，抑制非 特异反应，实现细胞黏附、 增殖、分化、凋亡及细胞外基质的重建【5 】。细胞与 生物材料间的反应和材料表面性质有着密切关系，所以深入研究生物材料表面 与细胞间的相互作用是设计和改进第三代生物材料的关键【6 】。 武汉理工大学硕+ 学位论文 1 2 生物材料的生物相容性 生物医用材料的生物相容性是指材料在生理环境中，生物体对植入材料的 反应和产生有效作用的能力，用以表征材料在特定应用中与生物机体相互作用 的生物学行为f 7 1 。生物相容性取决于材料和生物系统两个方面：在材料方面，影 响生物相容性的因素有制品的形态、材料的类型、物理化学性质、表面组成、 使用环境、力学性质等；在生物系统方面，影响因素有生物机体的种类、生理 环境、植入部位、材料存留的时间等。生物相容性是生物医用材料极其重要的 性能，是区别于其他材料的标志，是生物医用材料能否安全使用的关键性能 s 】。 1 2 1 生物相容性与蛋白及细胞的关系 通常，生物材料直接与人体组织接触，因此这对材料表面的理化性质有着 较高的要求，如最重要的一点是它必须具有良好的生物相容性【9 】。目前许多合成 材料虽然具有足够的机械性能和适当的降解速率，但它们中有些材料的细胞相 容性较差，究其原因其最大不足是聚合物基质表面没有细胞可进行识别的信息， 即缺乏细胞可识别的位点【l0 1 。另一方面，蛋白质广泛而大量地存在于生物体内， 是构成生物体的主要物质之一，同时也是生物识别机制的主要信息载体之一。 而蛋白质在植入材料表面的吸附是材料进入生物体后发生的首要事件，与蛋白 质的快速吸附相比，细胞与材料的接触要慢得多。实际上，细胞一般不会直接 与材料表面相接触，而是与已吸附在材料表面的一层蛋白相互作用【1 1 1 。因此， 材料表面所形成的蛋白吸附层的结构和组成决定着后续细胞响应的类型和程 度。因此，蛋白质在生物医用材料表面的吸附行为与材料的生物相容性有重要 关系【1 2 1 。 1 2 2 材料表面与蛋白及细胞的相互作用 蛋白质在生物医用材料表面的吸附是一个复杂的动态的过程，它包含着蛋 白质的吸附、重排和解吸附，通常该过程与范德华力、疏水相互作用、静电和 氢键作用有关。蛋白质与材料表面的相互作用主要和蛋白质自身以及材料表面 性质有关【1 3 】： 2 武汉理工人学硕士学位论文 影响与材料表面相互作用蛋白质自身的性质 蛋白性能影响 尺寸较大的分子可以与材料表面形成更多的接触位点 电荷在接近分子等电点时通常吸附更加迅速 结构稳定性较不稳定的蛋白质，如较少分子间交联的蛋白，可以较大程度伸 展，形成更多的与材料接触的位点 伸展速率可以快速伸展的分子，与表而接触更加迅速 影响与蛋白质相互作用的材料表面性质 性能影响 表面形貌织构表面暴露更多的与蛋白质相互作用的区域 成分表面化学成分影响与蛋白质相互作用的分子间作用力 疏水性疏水性倾向于结合更多的蛋白质 均匀性非均匀的表面性质导致形成不同的微区，而与蛋白质发生不同的相 互作用 电势表面电势影响在溶液中的离子分布，并影响与蛋白质的相互作用 细胞与材料的相互作用是生物材料及组织工程研究的重要领域之一，大多 数哺乳动物细胞必须与材料黏附后才能进行迁移、增殖和分化。因此，细胞在 生物材料上的黏附或凋亡将直接影响到生物医用材料产品在临床应用上的成 败。本质上，在生物环境中当材料植入体内时，细胞膜表面的受体积极寻找与 之接触的材料表面所能提供的信号，以区别所接触的材料为自体或异体。细胞 和材料的相互作用实际上是细胞表面受体( 如整联蛋白，钙黏素蛋白等) 与细 胞外生物材料所能提供的相应配体之间的相互间分子识别，产生特异性相互作 用，并将胞外的物理、化学信号转导至细胞核从而实现细胞行为及生理功能的 改变t 1 4 1 。只有生物相容性适宜，植入材料才能被生物体“认同 ，而表面修饰 技术正旨在抑制非特异性相互作用，引入特异性相互作用位点以实现细胞对所 接触材料做出适当的生理响应。由于材料表面的拓扑结构及材料表面的化学组 成等都对蛋白质的吸附行为产生重要影响，而蛋白质的吸附状态又直接决定着 后续细胞对该表面的响应行为。因此，材料表面的拓扑结构及材料表面的化学 组成也与细胞的黏附、铺展、增殖、分化等行为休戚相关【1 5 】。所以，研究材料 武汉理工人学硕士学位论文 表面性质与蛋白质，细胞三者之间相互作用的关系，将有助于最终阐明材料表 面的理化性质对细胞黏附、铺展、增殖和分化等行为的影响，从而有助于我们 深化对材料的生物相容性与细胞，蛋白之间关系的认识。 1 2 2 1 材料表面化学性质对蛋白吸附及细胞响应行为的影响 过去几十年以来，人们对材料表面的化学组成和拓扑结构图案对细胞行为 的影响进行了广泛的研究，发现材料表面的拓扑结构图案与表面化学组成对细 胞的黏附、增殖、分化等行为都有着重要影响，如一般认为亲水性、带有负电、 并且具有一定粗糙度的材料表面更有利于细胞黏附与增殖【l 州。如k o w a l c z y n s k a 等人研究了磺化和天然的聚苯乙烯表面对纤连蛋白( f i b r o n e c t i n , f n ) 吸附量， 构象及吸附状态的影响，发现经过磺化的聚苯乙烯表面更适合吸附上的纤连蛋 白a r g - g l y - a s p ( r g d ) 位点的暴露，从而对细胞的黏附更为有利【l 刀；j i a n g 等 人则研究了带有不同电荷的表面对玻联蛋白( v i t r o n e c t i n , v n ) 吸附构象和分子 取向的影响，他们发现与分子取向相比，v n 的吸附构象对后续细胞黏附行为影 响更为显著【1 8 】。r b a r b u c c i 等人研究发现，与无论是经物理吸附还是共价结合 在未经磺化处理的透明质酸表面的f n 相比，物理吸附有f n 的磺化透明质酸表 面对成纤维细胞的黏附、增殖最为有利 19 1 。e u r i d i c ep v i e i r a 等人则研究了材料 表面的亲疏水性对多种血浆蛋白吸附层结构、扩散、解离的影响，发现蛋白吸 附后的结构与吸附时间、蛋白初始浓度、表面亲疏水性有关、而蛋白的扩散和 解离则主要与表面的亲水性有关：蛋白扩散与解离速率与表面亲水性成正相关 【2 0 】。e l o d i ev e l z e n b e r g e r 等人研究了纤连蛋白在p s ，t p s ，p o l y h e m a 等几种表 面的吸附情况后发现，在抗细胞黏附的材料表面，纤连蛋白并不能诱导细胞黏 附，而对于可以黏附细胞的表面，纤连蛋白的存在虽不能促进细胞的黏附，但 是能促进细胞的铺展过程【2 1 1 。最近，研究发现修饰有天然多肽的金表面不仅可 以显著抑制血浆蛋白的非特异性吸附，从而表现出显著的抗细胞黏附能力，而 且由于多肽是由天然氨基酸组成的，因而该表面有很好的生物相容性。因此， 利用多肽分子对生物医用材料表面进行修饰也是提高其生物相容性的一条新途 径【2 2 】。 4 武汉理工人学硕士学位论文 1 2 2 2 材料表厩拓扑结构图案对蛋白吸附及细胞响应行为的影响 除了以上所报道的材料表面化学组成对蛋白吸附，细胞黏附行为的影响外， 材料表面的拓扑结构图案对蛋白吸附及后续细胞响应行为的影响也越来越引起 人们的关注，如v e r aa s c h u l t e 等人研究表明，通过引入微米级拓扑结构图案而 不对由星状p e g 交联而形成的水凝胶表面进行任何化学修饰，l 9 2 9 细胞便可以 在原本抗细胞黏附的该表面黏附生长【1 1 1 。y i m 等人发现由沟槽图案引起的“接 触引导 现象对间叶干细胞的分化有显著的促进作用，主要体现在与微管蛋白 形成有关的基因及z u j l ，m a p 2 ，g f a p 基因的表达上，并且他们还发现这种促 进作用与“接触引导 的发生程度呈正相关 2 3 】。g o m e z 等人则报道了“接触引 导”现象能够有效引起海马趾胚胎神经细胞的极化和轴突形成过程【2 4 1 。除了以上 材料表面拓扑结构图案因素外，近些年来材料的物理性质如硬度，弹性模量对 细胞的行为及功能的影响也正受到日益广泛的关注。如t z v e t k o v a - c h e v o l l e a u 等 人通过软刻蚀技术在p d m s 基材上制作了“软”( 5 0 0k p a ) 、“较硬”( 7 5 0k p a ) 、 “硬”( 2 0 0 0k p a ) 三种不同弹性模量的微米级沟槽图案，研究了3 t 3 细胞和s a i n 癌细胞在这三种不同弹性模量图案上的迁移性和极化动力学等。他们发现3 t 3 细胞在图案上达到极化平衡态所需的时间随着基材弹性模量的递减而缩短； s a i n 癌细胞在“硬”( 2 0 0 0k p a ) 的图案上的迁移速率显著高于在“软”( 5 0 0k p a ) 图案上的迁移速率【2 5 1 。 由此可见，材料表面的化学组成和拓扑结构等物理因素都会对蛋白质的吸 附行为和后续的细胞响应产生显著的影响。因此，生物材料表面与蛋白、细胞 间的相互作用是生物材料研究中最重要的内容，是设计和改进生物材料的关键 【2 6 1 。在未来生物材料的设计中应充分考虑生物材料对生物活性分子的动态吸附、 细胞与细胞之间的相互作用、多种信号分子甚至场信号的影响等f 2 7 】。另一方面， 这些细胞及胞外基质也对生物材料的结构和性能产生影响，因而生物材料与细 胞的相互作用是双向互动的并且随时间和空间的不同而不同。细胞与生物材料 之间存在物质、能量和信息( 化学信使和场信号) 的传递，是一个受多因素共同 调控的复杂体系，这些都决定了生物材料研究的复杂性【2 引。目前研究生物材料 与细胞的作用还局限在宏观阶段，而对于微观阶段即生物材料表面的哪些性质 和结构将会对吸附在其表面的蛋白质产生怎样的影响，从而对后续细胞生理行 为产生哪些确切的影响，还不是很清楚，这也正是以后生物医用材料研究中的 一个重要方向【2 9 1 。因此，应从材料表面与细胞的相互作用入手，在充分考虑蛋 5 武汉理下大学硕七学位论文 白吸附因素的前提下，深入研究细胞与材料之间、细胞之间的信息传输及其机 制，通过分子设计和结构模拟，对生物材料进行表面进行合理的物理或化学修 饰，制备出有活性的生物医用材料，使其具有良好的生物相容性并进一步期望能 诱导，甚至控制后续细胞的响应行为，便成为当今生物材料表面工程面临的挑 战。 1 3 材料表面的修饰策略和常用方法 1 3 1 材料表面的修饰策略 材料表面的修饰方法通常可以分为两大类：一在材料表面构建微纳米级拓 扑结构；二材料表面的化学改性。通常材料表面的修饰通常有以下几种策略【3 0 j ： ( 1 ) 由于材料表面的微纳米拓扑结构对蛋白吸附过程及后续的细胞黏附行 为和生理功能等都有着重要影响。因此通过微加工技术在材料表面构筑微纳米 级的拓扑结构可以有效影响材料与蛋白、细胞之间的相互作用，以达到调控细 胞行为和功能的目的。 ( 2 ) 材料表面能量、表面电荷、化学组成及特异基团等都会影响动物细胞的 响应行为。因此，优化材料表面电荷、表面化学组成及特异化学基团对改善和 提高材料的生物相容性、抗凝血性及增加细胞识别位点等都是有效的手段。 1 3 2 材料表面的拓扑结构与细胞图案化 材料的结构决定材料性能，其表面的微观结构是影响材料表面性能的一个 重要因素。生物材料表面的拓扑结构( 表面的粗糙度、孔洞的大小及分布、沟槽 的尺寸和取向等) 对细胞的黏附、铺展、增殖、分化、功能表达有很大影响【3 1 1 。 利用微加工技术在材料表面构建纳微米尺度的与细胞相关的物理化学参量，如 形貌，硬度，粗糙度，温度，胞外基质蛋白及细胞生长因子等，制得细胞可“感 受 的拓扑图案化基底，进而诱使细胞通过自身响应机制选择性地黏附于特定 区域而形成图案，即细胞的图案化【3 2 】。目前，细胞图案化已经发展成为一种广 泛用于研究和控制细胞行为的实验工具，并渗透到细胞生物学的基础研究领域 以及组织工程学、细胞传感、药物筛选和创伤治疗等各个领域【3 3 1 。 6 武汉理工人学硕士学位论文 随着各类微加工技术的发展，细胞图案化的构建方法逐渐多元化，图案的 分辨率已经达到纳米水平，其研究内容也在不断扩展与深化，如对图案质量的 评价，对适合于图案化和组织工程学的各种生物可降解材料的开发等。而组织 工程学的最终目标是人工制造大块组织和整个器官，以解决器官短缺这世界 性难题。目前，基于细胞图案化并利用多种精确控制的技术己实现了不同种类 细胞的共培养，一旦解决了营养供给网络毛细血管的有望实现以上问题，则有 望实现上述目标。此外，芯片实验室的快速发展，也为在方寸之间的实施细胞 图案化及其后续应用如高通量药物筛选，不同种类细胞的分选等提供了广阔的 发展空间【3 2 1 。 1 3 3 常用的材料表面图案化方法 1 3 3 1 软刻蚀( s o f tl i t h o g r a p h y ) 软刻蚀是上世纪9 0 年代初期，由美国h a r v a r d 大学w h i t e s i d e s 教授的研究 小组率先研究开发出来的，这类技术所有操作方法的一个共同特征就是使用一 个弹性印章来进行图形的复制与转移或采用印章当作掩模， “软刻蚀”也应因 此得名【3 4 1 。 软刻蚀技术除了制作母板需要使用比较昂贵的电子束刻蚀或其他先进技术 外，在后续的操作过程诸如浇注、复制、转移图案等都是非常简便的操作，因 而与传统光刻技术相比，软刻蚀技术可以有效地克服光刻技术的一些缺陷，为 化学家、生物学家和材料学家提供了方便、廉价的微图案制作方法，具有明显 的优势。软刻蚀操作过程简单，方便快捷，不需要复杂昂贵的大型设备；弹性 印章一次模塑成型，可重复使用，有效地降低成本；可一次在大面积上制作图 案，适宜大面积、成批量生产；可以方便地在平面甚至曲面表面制作微细结构； 既可以制造二维图案，也可以制造三维的微结构；可以对图案表面的化学性质 加以控制，方便地形成带特定官能团的图形表面等等。 迄今为止，软刻蚀已经发展壮大成一系列的相关操作，现在的软刻蚀特指 这些操作的统称，它们具体包括微接触印刷( m i c r o c o n t a c tp r i n t i n g ，t t c p ) 【3 5 1 、 毛细微模塑( m i c r o m o l d i n gi nc a p i l l a r i e s ，m i m i c ) 【3 剐、复制模塑( r e p l i c am o l d i n g , r e m ) 3 7 】、转移微模塑( m i c r o t r a n s f e rm o l d i n g ，灯m ) 3 8 】、溶剂辅助微模塑 ( s o l v e n t a s s i s t e dm i c r o m o l d i n g s a m i m ) 3 9 】等多项内容。 7 武汉理工大学硕士学位论文 制作表面带有凸凹微结构的高精度弹性印章是软刻蚀技术的成败关键。弹 性印章的材料一般选用聚二甲基硅氧烷( p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e ，p d m s ) ，也可以 用聚氨酯( p o l y u r e t h a n e s ，p u ) 、聚酰亚胺( p o l y i m i d e s ，p i ) 等【4 0 1 。制作弹性模 印章的硬母板可以用光刻、电子束刻蚀、微机械等方法制造或用现有的带有微 图案的衍射光栅、t e m 格子等，或用计算机辅助设计的方法快速设计打印模板， 获得硬母板后，就可以制作弹性印章。现在研究者普遍使用的是以d o wc o m i n g 公司生产的牌号为s y l g a r d1 8 4 为代表的p d m s 作为弹性印章的材料。p d m s 弹 性印章制作过程如图1 1 所示，首先将室温为流体的p d m s 加入交联剂，混合 均匀后浇铸在硬母板上，用u v 光照或热处理数小时，使其交联，将固化的p d m s 轻轻剥下，就得到了弹性印章。之所以选用p d m s 作弹性印章，是因为p d m s 具 有良好的生物相容性，一定的气体渗透性，光学透明，很低的玻璃化转变温度， 在室温下为流体，通过交联，流体很容易转变为具有弹性的固体。其次，p d m s 还有其它一些特点，例如出色的弹性，可与非平面的基板形成良好的接触，有 很强的化学稳定性和图形稳定性，可以在几个月内使用多次而不发生明显性能 下降等 4 1 1 。 悸燃翟 p i ) h 岱 、，1 1、，f 可f 锶l 、 ， ，：，：t ： v ，：t ：，：；。：，：一 ：- ：! ：嫒：j ：! ：! ：；：； ：， 一：。：，：一：，：，：- ：t ：，：- ： 二致化辟氯 纯i 垒履危 翅牧或蝤 图1 - 1p d m s 弹性印章加工过程示意图 武汉理t 大学硕十学位论文 3 32 其他方法 光捌技术来源于半导体工业，最初用于金属在微电子电路上的图案化。光 刻涉及的设备与材料主要包括紫外光源、光刻胶、掩模和基材。光刻技术中的 常规步骤如下图所示：首先在基材表面涂覆一层光刻胶，然后在其上放置带有 图案结构的掩模，暴露出来的光刻胶将会受到紫外光的照射。对于正性光刻胶， 受到光照的区域相对于未受到光照的区域在显影剂溶液中更易于溶解；而对于 负性光刻胶，受到光照的区域不溶解于显影剂溶液。所得到的光刻胶图案将作 为掩模来图案化目标物质，常用的目标物质是硅烷类，当硅烷结合在暴露出的 基材表面后，通过在丙酮中超声清洗将作为掩模的光刻胶去除，这些原先被光 刻胶覆盖的区域可l 三【结合另一种所需的物质例如排斥或促进蛋白质吸附、细 胞黏附的物质【4 2 】。 l l b if o f n _ i l h h j 一* 妇；lb ：* “a p l m g * i a t ，i 耐 n - 曲_ d l f 口d _ u “1 l 。“n n * i a g 图1 2 光刻过程示意图 扫描探针显微镜技术( s c a n m n gp r o b em i c r o s c o p yt e c h n i q u e s s p m ) 如扫描 隧道显微镜和原子力显微镜，利用尖锐探针以及探针表面之间的相互作用得到 材料表面圈像。l i u 等通过增强定位相互作用，如探针和分子问力、隧道电子密 度和电场强度，由此选择性的打断化学键，将s p m 作为一种刻蚀工具来形成自 组装单分子层的图案，由这种方法得到的表面用于图案化生物素，进而选择性 的结合链霉亲和素【4 】。 热模压印技术是一种可在热塑性材料大表面上高产出地加工出微米或纳米 结构的简便方法。其大致过程如下：将具有微图案的模板置于一个升温的热塑 性聚合物上，通过加压在聚合物表面复制原模板圈案。如o e r l a c h 等在大表面铜 板上用微指抛磨工艺加工出毛细管电泳阵列结构模板，利用热压印工艺大批量 加工出可以一次性使用的具有9 6 个c e 结构的标准微孔板【州。 武汉理工大学硕士学位论文 三维直写技术，c i m a 与s a c h s 用印液打印技术来组装材料，首先提出了三 维写入的概念。所谓三维直写技术( d i r e c t w r i t e ) ，指的是利用计算机控制的移 动台移动一种图形生成装置，例如印液淀积或者激光写入光束等，来构建出具 有受控构造与构成的材料。三维直写技术大致有两类，一类是以配制的印液为 基础的写入技术；另一类是在已有材料中利用激光束的加工能力实现的写入技 术【4 5 】。 1 3 4 生物材料表面的化学改性 表面改性是指在不改变材料本体性能的前提下，赋予其表面新的性能【删。 组织工程用生物材料作为植入材料，使用时主要考虑其生物相容性，即材料表 面与宿主间界面上的相互作用，因此对植入材料的改性主要是对其表面物理或 化学的修饰。近年来由于组织工程的发展对生物材料的表面性质提出了更高的 要求，新的修饰技术也随着发展起来，如自组装、辐射接枝法、表面固定化、 低温等离子体法、离子注入法等【4 刀。 1 3 4 1 自组装 自组装单分子膜( s a m s ) 又b i g e l o w 于1 9 4 6 年首先提出来的，这是一种非常 有前景的表面官能化手段，是近几十年来发展起来的一种新型的有机超薄膜， 其制备技术及表征方法已得到很大发展。1 9 4 6 年z i s m a n 等就报道