（微生物与生化药学专业论文）酿酒酵母sod1基因在抗环境胁迫中的作用.pdf

中文摘要 酿酒酵母s o d l p 是铜锌超氧化物歧化酶，两分子s o d l p 亚基与一分子c u 2 + 和 一分子z n 2 + 组成具有生物活性的复合物，该复合物可以将细胞内0 2 催化分解成 h 2 0 2 ，h 2 0 2 进一步被过氧化氢酶催化分解成h 2 0 和0 2 ，使细胞免受超氧基的损害。 c c s l p 是s o d l p 的铜离子伴侣蛋白，为s o d l 复合物提供c u 2 + 。 通过筛选酿酒酵母缺失株文库对r a p 的敏感和抗性情况，我们发现酿酒酵母 s o d l 和c c s i 缺失株对r a p 具有明显的抗性，且这种抗性与胞# b c u 2 + 浓度有关，这 说明s o d l 和c o s 缺失株对r a p 的抗性是依赖于s o d l p 的超氧化物歧化酶活性的。 然后通过遗传学表型筛选的方法研究了s o d l p 在多种胁迫响应中的作用，首次发 现了s o d l 缺失株对s d s ，c o n g o r e d ，p h8 0 的敏感表型，表明了s o d l p 在细胞对 这些胁迫条件耐受性方面发挥一定的作用。为了进一步研究s o d l 基因的功能， 我们构建了能够表达s o d l h a 融合蛋白的多拷贝质粒p h a c l8 1 s o d l 和单拷贝 质粒p h a c l11 s o d l ，并通过功能互补实验验证了其具有生物学功能。 通过序列分析，我们在s o d l 的启动子部分发现了s 1 r i 汪序列，这暗示s o d l 可能被胁迫转录因子m s n 2 4 p 所调控。然后用w e s t e mb l o t 的方法，检测了在0 4 m n a c i 存在情况下，野生型菌株及m s n 2 4 缺失株中s o d l p 的表达情况。从蛋白 水平证明了，s o d l 在高渗胁迫应答中发挥重要作用，且m s n 2 4 p 参与对s o d l p 表达的调控。 关键词：酿酒酵母胁迫抗性s o d lm s n 2 4 p a b s t r a c t s o d le n c o d e sac u z ns u p e r o x i d ed i s m u t a s et h a t p l a y sar o l ei no x y g e nr a d i c a l d e t o x i f i c a t i o n s o d sc a t a l y z et h eb r e a k d o w no ft h es u p e r o x i d er a d i c a l ，0 2 ，t oa n o x y g e nm o l e c u l e ( d i o x y g e n ) a n dh y d r o g e np e r o x i d e c c slpi st h ec o p p e rc h a p e r o n e f o rs o d l p i no u rp r e v i o u ss t u d i e s ，w ef o u n dt h a ts o d la n dc c s ls t r a i n sh a dp h e n o t y p e so f r a p a m y c i nr e s i s t a n c e h e r ew es h o wt h a tt h ea c t i v i t yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s ei s r e s p o n s i b l ef o rt h i sr e s i s t a n c e i na d d i t i o n ，w ep r o v i d ee v i d e n c es h o w i n gt h a td e l e t i o n o fs o d lc a u s e sy e a gc e l l sh y p e r s e n s i t i v et os d s ，c o n g o r e da n d p h8 0 ，i n d i c a t i n g t h a ts o dlpp l a y saf u n d a m e n t a lr o l ei nt h ea d a p t a t i o nt ot h e s es t r e s s e s t of u r t h e r s t u d yt h ef u n c t i o no fs o d lp ，w ec o n s t r u c t e dam u l t i c o p yp l a s m i dp h a c181 s o d 1 a n dac e n t r o m e r i cp l a s m i dp h a c111 一s o d i w ea n a l y z e dt h es e q u e n c eo fs o d la n df o u n das t r ee l e m e n ti nt h es o d l p r o m o t e r t h i si n d i c a t e st h a ts o d lm a yb er e g u l a t e db yt r a n s c r i p t i o nf a c t o rm s n 2 4 p w et h e r e f o r ee x a m i n e dt h ee x p r e s s i o no fs o dlpi nw ta n dm s n 2 4s t r a i n se x p o s e dt o 0 4m n a c i ，d e m o n s t r a t i n gt h a ts o d li sr e g u l a t e db ym s n 2 4 p k e y w o r d s - s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，s t r e s sr e s i s t a n c e ，s o d l ，m s n 2 4 p 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁盗盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：黼芹 签字日期： 加。7 年多月6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丞鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 镭许 签字同期：如听年s 月6 日 新虢旃服 签字吼川年y - 月 日 第一章文献综述 1 1 酿酒酵母简介 1 1 1 酵母及酿酒酵母 第一章文献综述 酵母是一类单细胞微生物，属真菌( f u n g i ) 。酵母菌有6 0 个属，约5 0 0 个种。 酵母细胞呈圆形或椭圆形，直径为5 1 0 哪，由细胞壁、细胞质、细胞核、细胞 膜、液泡等构成，具有真正的细胞核和完整的细胞器。菌落形态与细菌相似，但 较大较厚，呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌属于兼性厌氧 微生物，在无氧的条件下，可分解碳水化合物产生酒精或乳酸，工业上常用于发 酵。酵母菌由于具有操作简单，生长快速等优点，还常用于科研特别是遗传学的 研究。目前，常用于科研的典型菌种有酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、裂 殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 、白色念珠菌( c a n d i d aa l b i c a n s ) 等。 酵母菌形态虽然简单，但生理却比较复杂，应用也是多方面的。在工业上用 于酿酒，酵母菌将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下， 经过内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精，此过程称为发酵。在医药上， 因酵母菌富含维生素b 、蛋白质和多种酶，菌体可制成酵母片，治疗消化不良。 并可从酵母菌中提取生产核酸类衍生物、辅酶a 、细胞色素c 、谷胱甘肽和多种 氨基酸的原料。 酵母菌种类繁多，常用的菌种有裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 、白 念珠菌( c a n d i d aa l b i c a n s ) 、酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 等。 酿酒酵母，又称啤酒酵母或芽殖酵母( b u d d i n gy e a s t ) ，属于半知菌亚门，芽 孢菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，酵母属。细胞呈圆形或椭圆形，以出芽方式 生长，能形成子囊孢子。在实验室培养时，绝大部份荫落呈乳白色，表面平滑， 稍显光亮，部份菌株菌落粗糙具皱折。 1 1 2 酿酒酵母作为模式生物 早在二十世纪三十年代，w i n g s 和他的同事们就开创了酿酒酵母遗传学研究， 大约l o 年以后，l i n d e g r e n 和他的同事们也开始了全面的研究工作，这两个研究 小组的工作揭示了酿酒酵母遗传学的基本原理和基本方法【l 】。1 9 9 6 年4 月，在国 际互联网的公共数据库中公布了酿酒酵母的完整基因组序列。酿酒酵母1 2 0 6 8k b 的全基因组序列中含大约5 8 8 5 个o r f s ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) 【2 j ，它们分布在 1 6 条染色体上，这是人们第一次获得真核生物基因组的完整核苷酸序列。 第。章文献综述 今天，酿酒酵母被广泛认为是一种理想的用于生化和遗传学研究的真核微生 物，作为一种模式生物在实验系统研究方面具有许多内在的优势。首先，酿酒酵 母是一种单细胞生物，能够在基本培养基上生长，使得研究人员能够通过改变物 理或化学环境条件控制其生长1 3 1 。其次，酿酒酵母在单倍体和二倍体的状态下均 能生长，并能在实验条件下较为方便地控制单倍体和二倍体之间的相互转换，对 其基因功能的研究十分有利。如在单倍体状态下，只需一次基因替换，就能得到 某个特定基因缺失的菌株；而对于一些缺失后致死的基因，人们可以在二倍体菌 株中对其中一个等位基因进行基因替换，获得杂合子( h e t e r o z y g o t e ) 1 4 。此外， 酿酒酵母繁殖一代大约需要2h ，很适合用于遗传学分析。更重要的是，目前已 发展了一些非常有效的技术使得酿酒酵母基因组中6 0 0 0 个基因中的任何一个基 因均能被突变的等位基因取代，甚至从基冈组中完全缺失，这种方法具有很高的 效率和准确性p j 。 酿酒酵母作为高等真核生物特别是人类基冈组研究的模式生物，其最直接的 作用体现在生物信息学领域。当人们发现了一个功能未知的人类新基因时，可以 迅速地从酿酒酵母基冈组数据库中检索与之同源的功能己知的酿酒酵母基因，并 获得其功能方面的相关信息，从而加快对该人类基因的功能研究。研究发现，有 许多涉及遗传性疾病的基因均与酿酒酵母基因具有很高的同源性，研究这些基因 编码的蛋白质的生理功能以及它们与其它蛋白质之间的相互作用将有助于加深 对这些遗传性疾病的了解1 6 卅。此外，人类许多重要的疾病，如早期糖尿病、小 肠痛和心脏疾病，均是多基因遗传性疾病，揭示涉及这些疾病的所有相关基因是 一个困难而漫长的过程。酿酒酵母基因与人类多基因遗传性疾病相关基因之间的 相似性将为我们诊断和治疗这些疾病提供重要的帮助。 随着更多高等真核生物遗传信息的获得，人们将会发现有更多的与高等真核 生物基因具有同源性的酿酒酵母基因，因此酿酒酵母基因组在生物信息学领域的 作用会显得更加重要，这同时也会反过来促进酿酒酵母基因组的研究。与酿酒酵 母相比，高等真核生物具有更丰富的表型，从而弥补了酿酒酵母中某些基因突变 没有明显表型改变的不足。 酿酒酵母作为模式生物的作用不仅是在生物信息学方面，它为高等真核生物 基因提供了一个可供检测的实验系统，即通过同源基因与酿酒酵母基因的功能互 补来确证该同源基因的功能【l0 1 。在酿酒酵母中进行功能互补实验无疑是一种研究 人类基因功能的捷径。如果一个功能未知的人类基因可以补偿酿酒酵母中某个具 有已知功能的突变基因，则表明两者具有相似的功能。而对于一些功能已知的人 类基因，进行功能互补实验也有重要意义。例如与半乳糖血症相关的三个人类基 因g a l k 2 ( 半乳糖激酶) 、g a l t ( u d p 半乳糖转移酶) 和g a l e ( u d p 半乳糖异构酶) 第一章文献综述 能分别补偿酿酒酵母中相应的g a l l 、g a l 7 、g a l l 0 基因突变。在进行互补实 验以前，人类和酿酒酵母的乳糖代谢途径都已十分清楚，对有关几种酶的活性检 测方法也十分健全。随着人类三个半乳糖血症相关基因的克隆分离成功，功能互 补实验成为可能，从而在遗传学水平进一步确证了人类半乳糖血症相关基因与酿 酒酵母基因的保守性。人们又将这一成果予以推广，利用酿酒酵母系统进行半乳 糖血症的检测和基因治疗，如区别真正的突变型和遗传多态性，在酿酒酵母中模 拟多种突变型的组合表型，或筛选基因内或基因间的抑制突变等i l 。这些方法也 同样适用于其它遗传病的研究。 利用同源基因与酿酒酵母基因的功能，还能使酿酒酵母成为其它生物基因的 筛查工具。通过使用特定的酿酒酵母基因突变株，对人类c d n a 表达文库进行筛 选，从而获得功能互补的克隆。j t l t u g e n d r e i c h 等利用酿酒酵母的细胞分裂突变型 ( c d cm u t a n t ) 分离到多个在人类细胞有丝分裂过程中起作用的同源基因。利用此方 法，人们还克隆分离到了农作物、家畜和家禽的多个基因1 12 1 。为了充分发挥酿酒 酵母作为模式生物的作用，除了发展酿酒酵母生物信息学和健全同源基因在酿酒 酵母中进行功能互补的研究方法外，建立酿酒酵母最小基冈组( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a eb a r em i n i m a lg 色n o m e ) 也是一个可行的途径。酿酒酵母最小基因组是指 允许酿酒酵母在合成培养基中生长所需的最小基因数目的基因组1 1 3 ，1 4 】。人类 c d n a 克隆与酿酒酵母中功能已知基因缺陷型进行遗传互补可以确定人类新基因 的功能，但是这种互补实验可能会受到酿酒酵母基因组中其它丰余基因的影响。 如果构建的酿酒酵母最小基因组中所保留的基因可以被人类或者病毒的d n a 序 列完全替换，那么替换后的表型则完全依赖于外源基因的功能，这将成为一种筛 选抗癌和抗病毒药物的分析系统。 1 2t o r p r o t e i nk i n a s e 雷帕霉素( r a p a m y c i n 或s i r o l i m u s ) 是从s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s d p 分离到的 大环内酯类次级代谢产物，最初是以抗真菌白念珠菌( c a n d i d aa l b i c a n s ) 的药物被 筛选出来，随后的研究发现它还具有免疫抑制活性能抑制t 淋巴细胞的生 长和繁剧1 5 j 。 t o r ( t a r g e to fr a p a m y c i n ) 是r a p 进入细胞后的靶物质，是最早从酿酒酵母细 胞中发现和鉴定的蛋白激酶，它在真核细胞中高度保守。在酿酒酵母中，由f p r l 基因编码的胞质蛋白f k b p l 2 ( f k s 0 6 b i n d i n gp r o t e i no f1 2k d a ) 是r a p 的直接受体， 它与r a p 形成一个复合物，这个复合物然后结合t o r 并抑制t o r 的活性。胞质蛋 白f k b p l 2 是一种脯氨酸异构酶，缺少f k b p l 2 的酿酒酵母表现出对r a p 的抗性。 第一章文献综述 在酿酒酵母细胞中存在两个t o r 的同源基因t o r l 和t o r 2 t 怕】，而拟南芥植物 ( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 和哺乳动物细胞中只存在一个t o r t l 7 】。在哺乳动物细胞内， r a p 也是先结合胞质蛋白f k b l 2 后再去结合抑匍 m t o r ( m a m m a l i a nt o r ) 。所以 r a p 的作用方式在酵母和高等真核细胞中是高度保守的【1 8 】。 酵母细胞中t o r 以两种不同的复合物形式存在_ t o r c l ( t o rc o m p l e x 1 ) 和t o r c 2 ( t o rc o m p l e x2 ) l 】刿。t o r c l 参与r a p 敏感的信号转导途径，它由 t o r l p 或者t o r 2 p ，以及k o g l p ，l s t s p ，a n dt c 0 8 9 组成。当r a p 进入细胞中后，与 由f p r l 基因编码的胞质蛋白f k b p l 2 ( f k 5 0 6 b i n d i n gp r o t e i no f1 2k d a ) 形成一 个复合物，这个复合物然后结合t o r c l ，从而抑制t o r 的活性【2 0 1 。 t o r 能对多种信号做出反应，例如细胞的营养状态、外界各种胁迫压力和生 长因子等。在酵母细胞中t o r 对细胞的调控主要集中在一下几个方面：1 t o r 对 细胞生长的调控。外界营养条件如碳源和氮源能刺激细胞的生长。研究显示，酵 母t o r 信号转导途径可以对这些外界营养条件产生应答。同时缺失t o r l 和t o r 2 的突变株或r a p 处理过的细胞，都表现出营养缺乏或停止在g 0 期的细胞特征【2 1 1 。 这些细胞特征包括蛋白质和核糖体合成水平的下降、细胞自噬( a u t o p h a g e ) 的增 加和依赖泛素的蛋白质降解活性的增加、转译引发的m r n a 降解等t 2 2 1 。同时缺 失t o r l 和t o r 2 的酵母细胞与r a p 处理后的细胞表型相似，这表明t o r c l 参与 r a p 敏感的信号转导途径，负责与生长相关的营养应答。2 t o r 对蛋白质合成和 稳定性的调控。酵母t o r c1 通过激活蛋白激酶s 6 k 1 和转译起始因子e l f 4 e ( 也称 为帽子结合蛋白) 来控制蛋白质的合成【2 3 1 。激活的s 6 k i 磷酸化4 0 s 核糖体蛋白 s 6 ，从而导致含有5 端寡聚嘌呤m r n a 的转译增加。t o r c l 直接磷酸化e l f 4 e 结合蛋白1 ( 4 e b p l ) ，从而让4 e b p l 释放e l f 4 e ，游离的e l f 4 e 可以结合e l f 4 g 一起促进蛋白的转译起始。t o r 通过抑制自噬和依赖遍在蛋白的蛋白质降解来维 持蛋白质的稳定性1 2 4 】。3 t o r 对转录的调控在酵母中，t o r 通过控制多种营养应 答转录因子的核内定位来负向调控特定饥饿基因的转录。t o r 通过把普遍胁迫转 录因子m s n 2 p 和m s n 4 p 隔离于细胞质中从而负向控制胁迫应答基因的转录 2 5 】。4 t o r 作为蛋白磷酸酯酶调控因子t o r 信号转导的一个重要机制足对2 a 型蛋白磷 酸酯酶( p p 2 a s ) 的调控。t o r 的许多下游效应物，例如酵母中磷酸化的n p r l 和 g l n 3 ，在经过r a p 处理后会迅速去磷酸化。t o r 对蛋白磷酸酯酶和蛋白激酶的 调控保证了t o r 能迅速合理地对营养缺乏作出应答。 1 3s o d l 昶c c s l 超氧化物岐化酶( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ，s o d ) ，是生物体内重要的抗氧化酶， 第一章文献综述 广泛分布于各种生物体内，如动物、植物、微生物等。在原核生物和真核生物细 胞中都有丰富的超氧化物歧化酶存在。原核生物中有两种s o d s ，一种是f e s o d ， 另一种是m n s o d 。真核生物中也有两种s o d s ，分别是存在于细胞质内的 c u z n s o d ，和存在于线粒体内的m n s o d 。s o d 具有特殊的生理活性，是生物 体内清除自由基的首要物质。它们将0 2 催化成h 2 0 2 和0 2 ，h 2 0 2 进一步被过氧化 氢酶催化分解成h 2 0 和0 2 ，使细胞免受超氧基的损害1 2 6 1 。 酿酒酵母中存在s o d l p 和s o d 2 p 两种超氧化物歧化酶。s o d l p 为c u z n s o d ， 主要位于细胞质内，而s o d 2 p 是m n s o d ，位于线粒体内。 s o d l p 的活性状态是由两个s o d l p 亚基组成的二聚体，每个亚基含有一个c u 2 + 和一个z n 2 + c c s l p 是s o d l p 的铜离子伴侣蛋白，为活性的s o d l p 二聚体提供c u 2 + f 2 7 2 8 j 。当细胞突然遭受氧化胁迫时，最初是通过c c s l p 激活细胞内无活性的s o d l p 蛋白，在持续的氧化胁迫刺激下，细胞内s o d l p 蛋白表达量上升，且通过c c s l p 激活，从而对外界环境做出应答1 2 9 1 。 s o d i 和s o d 2 是最早鉴定出来与细胞寿命有关的基因【3 们。缺失s o d l 基因 或同时缺失s o d l 和s o d 2 基因会显著的缩短细胞的c h r o n o l o g i c a ll i f e s p a n ( i 口g o 期细胞存活的时间) 和r e p l i c a t i v el i f e s p a n ( 即细胞可以最多可以出芽的个数) 。 而过表达_ s o d l 和s o d 2 可以延长细胞寿命但是不影响细胞的代谢率1 3 0 1 。 人们在酿酒酵母中过表达s o d l 来研究过表达s o d l 是如何影响细胞寿命 的。研究发现，与野生型细胞相比，过表达_ s o d l 可以延长细胞寿命，而同时过 表j p 2 s o d l 和c c s l 可以使细胞寿命有更显著的延长 3 1j 。 而在细胞内过表达有活性的s o d l p 蛋白要么需要高浓度的c u 2 + ，要么需要同 时过表达c c s l 。这是因为c c s l p 是s o d l p 的铜离子伴侣蛋白，为活性的s o d l p - - 聚 体提供c u 2 + 。同时过表达s o d l 和c c s l 可以使s o d l 的活性上升6 8 倍，使细胞 寿命延长2 倍以上。进一步研究表明同时过表达s o d l 和c c s l 可以减少稳定期 细胞内的蛋白的氧化损伤。综上可以看出，细胞寿命最终是受制于氧化损伤1 3 。 而当外界没有c u 2 + ，或者没有同时过表达c c s l 时，过表达s o d l 会产生一 系列有害的影响。如细胞的c h r o n o l o g i c a ll i f e s p a n 和r e p l i c a t i v el i f e s p a n 都减少，细 胞表现出异常高水平的内源性的氧化胁迫，导致高频率的自发性突变。而过表达 c c s l 可以抑制这些有害影响1 3 。 1 4 鼠) d j 和胁迫应答 s o d l p 的作用是清除超氧阴离子，使细胞免于氧化损伤。故f f a s o d l 缺失后 细胞对氧化胁迫高度敏感。比如在含有能产生超氧化物的药物如百草枯的培养基 第一章文献综述 上表现出明显的生长缺陷。过表达一些基因可以抑制s 0 口j 缺失造成的氧化损伤。 过表i 迭_ a t x l 或翻脚，或者缺夕g p m r l 或者b s d 2 可以通过调节细胞内金属离子 的平衡而抑制氧化损伤，而过表达t k l l 可能是通过增加戊糖磷酸途径中产生的 n a d p h 而实现保护作用1 3 2 j 。 s o d l p 除了在氧化胁迫中发挥作用外，近年的一些研究显示，s o d l p 也参与 其他的一些应激响应。 a d r i a n ag a m y a r r o y o 等在2 0 0 3 年发表的文章中指 3 3 1 ，s o d l p 对细胞抗高 渗胁迫是必须的。s o d l 缺失株在含1 0m 的n a c i 或者2 0m 的s o r b i t o l 的培养基上 有明显的生长缺陷。 我们实验室前期文库筛选实验显示，酿酒酵母c c s l 和s o d l 的缺失株分别对 r a p 显示出较强的抗性。在最近的一篇文章中，t a a v ik 等指t 3 4 1 ，当s o d l p 缺失 后，细胞内活性氧增加，使t o r c l 发生改变，阻止了它与f k b p l 2 ：r a p a m y c i n 复 合物的结合，最终导致细胞对r a p 的抗性。 1 5m s n 2 4 p m s n 2 4 p 是两种胁迫转录因子，可以调节多种胁迫应答相关基因的表达，包 括热激，高渗胁迫，氧化胁迫，碳源缺乏，低p h 值等1 3 5 】。在木霉菌以及白念珠 菌中都发现了与酿酒酵母m s n 2 4 类似的基因【弧3 8 】，但是白念珠菌q b m s n 2 4 p 类 似蛋白在胁迫应激中似乎并没有发挥重要作用1 3 引。 酿酒酵母m s n 2 p 和m s n 4 p 是两个功能很相近的蛋白，且它们的氨基酸序列具 有4 1 的相同性例。单独缺失删或者m s n 4 没有很明显的表型，而m s n 2 m s n 4 双缺失株对一系列的胁迫条件如碳源饥饿，热激，高渗和氧化胁迫等高度敏感。 过表j p 妣i s n 2 氟j m s n 4 基因可降低细胞对饥饿和高温的敏感性【删。 受m s n 2 4 p 调节的基因其启动子部分都含有一个或几个s t r e ( s t r e s s r e s p o n s ee l e m e n t ) 元件( 5 - c c c c t - 3 ) ，或者p s d 元件( 5 - c c c t - 3 ) 。当外界存 在胁迫压力时，m s n 2 4 p 结合于这些s t r e 或者p s d 元件上，从而调节相关基因的 表达 3 5 , 4 1 】。 在非胁迫条件下，m s n 2 p 和m s n 4 p 存在于细胞质中。m s n 2 p 和m s n 4 p 在细胞质 中的定位部分依赖于t o r 。t o r 可能通过促进m s n 2 p 和m s n 4 p 与细胞质蛋白 b m h i 和b m h 2 的联合达到将m s n 2 p 和m s n 4 p 隔离于细胞质中【25 | 。在胁迫条件下， m s n 2 4 p 高度磷酸化，进入细胞核内，然后在细胞核和胞质间进行穿梭运动，调 节相关蛋白的表达【4 引。 在m s n 2 4 p 的n 端，含有转录激活区域和核输出序列【4 3 1 。在c 端，含有一个锌 第一章文献综述 指结合区域，这个结合区域可以识别s t r e 元件【堋。 图1 - 1 表示的是受m s n 2 4 p 调控的一些基因，其启动子部分s t r e ；元件( 黑色 箭头所示) 和p s d 元件( 灰色箭头所示) 所在的位型4 1 1 。 l | 玛_ _ - - 一 ll 巧一a l e ) 2 _ _ _ - - _ _ _ - _ - - _ _ - l - l _ _ _ _ _ i - _ _ _ a d h 3 - - - 一i l l l l l l l l l d。一e i , g l k l ( 1 p p 2 。- 一 h $ p 一 i i x k l 只嵫i l l 一一 s o d 2 s s 3 卜- 一 s s - - _ _ - _ _ _ - _ - - - _ _ - _ i _ _ _ _ _ _ - - - _ - _ _ - 弹s 1 一i 一一 t k i 2 v l & r 1 4 图1 - 1s t r e 元件所在位置 f i g 1 - 1s t r es i t e so nt h ep r o m o t o rr e g i o n so f m s n 2 4 p d e p e n d e n tg e n e s 已有文献报道s o d 2 的启动子部分含有s t r e ；元件，受m s n 2 4 p i 拘调控，作用 于s c h 9 下游，参与细胞寿命的调控等生物学过程 4 5 , 4 6 】。 1 6 本论文的研究内容和意义 酿酒酵母作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物，在实验系统 研究方面具有许多内在的优势。对酿酒酵母基因功能的研究将有助于其他高等真 核生物基因及相关信号转导途径的研究。 本课题从酿酒酵母s o d l 菌株对r a p 的抗性表型出发，从不同的角度对酿酒 酵母s o d l 基因在抗环境胁迫中的作用及其机制进行了研究，对进一步了解 s o d l 基因的功能，及深入研究真核细胞抗环境胁迫的机制有重要的意义。 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种及质粒 第二章实验材料与方法 本实验中用到的菌株及质粒见表2 - 1 ，表2 2 表2 1 本实验中用到的菌株 t a b l e2 1s t r a i n su s e di nt h i sw o r k 表2 - 2 本实验中用到的质粒 t a b l e2 - 2p l a s m i d su s e di nt h i sw o r k 8 - 第二章实验材料与方法 表2 - 2 本实验中用到的质粒( 续) t a b l e2 - 2p l a s m i d su s e di nt h i sw o r k ( c o n t i n u e d ) 2 1 2 主要实验仪器 本实验中用到的主要仪器见表2 3 表2 - 3 本实验中用到的主要仪器 t a b l e2 - 3 i m p o r t a n ta p p a r a t u su s e di nt h i sw o r k 第二章实验材料与方法 2 1 3 试剂 本实验中用到的主要试剂见表2 - 4 表2 _ 4 本实验中用到的主要试剂 1 a b l e2 - 4i m p o r t a n tm a t e r i a l su s e di nt h i sw o r k 药品名称生产厂家 氢氧化钠 氢氧化钠 无水氯化钙 e d l a 无水乙醇 异丙醇 盐酸 冰醋酸 葡萄糖 甘油 氯化钠 氯化镉 氯化锌 过氧化氢 酸洗玻璃珠 琼脂粉 p e g 4 0 0 0 蛋白胨 琼脂糖 酵母提取物 y n b 酵母氮源 s d s l i t h i u ma c e t a t e t r i sb a s e p c r 胶回收试剂盒 限制性内切酶 l i g a s e 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市光复精细化工研究所 天津市光复精细化工研究所 天津市光复精细化工研究所 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 上海y i t o 生物试剂有限公司 o x o i di t de n g l a n d g e n v i e w 分装 联星生物 s i g m a n o v o n 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 晶美生物工程有限公司 第二章实验材料与方法 表2 4 本实验中用到的主要试剂( 续) t a b l e2 - 4 i m p o r t a n tm a t e r i a l su s e di nt h i sw o r k ( c o n t i n u e d ) 药品名称生产f 家 c l a p 过硫酸铵 d t t t e m e d 聚丙烯酰胺 甲又一双丙稀酰胺 p 一巯基乙醇 滇酚兰 p r o t e i ns t a n d a r d 甘氨酸 甲醇 脱脂奶粉 i 吐温- - 2 0 一抗 二抗 显色底物 显影液 定影液 上海生工生物工程有限公司 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 b b l 分装 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 晶美生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 天津市光复精细化工研究所 雀巢脱脂奶粉 天津市光复精细化工研究所 天津润泰生物工程有限公司 天津润泰生物工程有限公司 p i e r s e 柯达 柯达 2 1 4 培养基 l b 培养基：蛋白胨1 0g ，酵母提取物5g ，n a c l1 0g ，溶于1l 双蒸水， 1m n a o h 调p h 至7 0 0 1m p a 灭菌2 0r a i n 。配固体l b 时外加1 2g 琼脂粉。 l b + a m p 培养基：ll l b 培养基中加入1m l5 0 m 【g m e 的a m p 母液。 y p d 培养基：蛋白胨2 0g ，葡萄糖2 0g ，酵母提取物1 0g ，溶于1l 双蒸 水。固体培养基外加2 0g 琼脂粉。0 1m p a 灭菌2 0m i n 。 s d - - l e u 培养基：酵母氮源6 7g ，葡萄糖2 0 0g ，加双蒸水至9 0 0 0m l ， 固体培养基外加琼脂粉2 0 0g o 1m p a 灭菌2 0r a i n 5 5 加过滤除菌的1 0 x a m i n o a c i dm i x - - l e u1 0 0 0m l 。 y p d + o 4m o l ll i c h 预先配制5ml i c i 溶液，高压灭菌。每1l 配好的 第二章实验材料与方法 y p d 培养基加入8 0m ll i c i 溶液，高压灭菌。 y p d + 1 5mn a c h 预先配制5mn a c i 溶液，高压灭菌。每ll 配好的y p d 培养基加入3 0 0m ln a c i 溶液，高压灭菌。 y p d + 1 5mk c i ：预先配制5mk c i 溶液，高压灭菌。每1l 配好的y p d 培养基加入3 0 0m lk c i 溶液，高压灭菌。 y p d + 2 0ms o r b i t o l - 每ll 配好的y p d 培养基加入3 6 4 3gs o r b i t o l ，溶解。 高压灭菌。 y p d + 3 0 0 “g m lc o n g or e d 预先配制2 0m g m l 的c o n g or e d 溶液，高压 灭菌。每ll 配好的y p d 培养基加入1 5m l c o n g or e d 溶液，高压灭菌。 y p d + 5m mz n c l 2 ：预先配制2 5mz n c l 2 母液，高压灭菌。每1l 配好的y p d 培养基加入2m lz n c i ：母液，高压灭菌。 ) d + 4m mh 2 0 2 ：将新鲜购买的1 5 的h 2 0 2 母液用0 2i t m o l l 滤膜过滤除 菌，每1l 灭菌后的y p d 培养基5 5 恒温后加入7 0 0 此h 2 0 2 母液。 y p d + 2 0n g m l 的r a p ：预先配制好2 0l a g m l 的r a p 母液。每ll 灭菌后 的y p d 培养基5 5 恒温后加入1m lr a p 母液。 2 2 实验方法 2 2 1 常用溶液与缓冲液的配制 2 2 1 - 1 核酸操作常用溶液 a m p i c i l l i n 母液( 1 0 0m g m l ) ：溶解lga m p i c i l l i n 于足量的水中，最后定容 至1 0m l 。使用0 2 2 岬滤膜、注射器在超净台上进行滤膜过滤灭菌。分装成小 份于2 0 贮存。 5m 氯化钠( n a c l ) ：溶解2 9 2g 氯化钠于足量的水中，定容至1 0 0 0m l 。 l om 氢氧化钠( n a o h ) ：溶解4 0 0 0g 氢氧化钠颗粒于约0 9l 水的烧杯中 ( 磁力搅拌器搅拌) ，氢氧化钠完全溶解后用水定容至1 0l 。 1 0 s d s ( 十二烷基硫酸钠) ：称取1 0 0 0gs d s 慢慢转移到约含0 9l 的水 的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1 0l 。 lm 氯化镁：溶解2 0 3gm g c l 2 6 h 2 0 于足量的水中，定容到1 0 0 0m l 。 lm 氯化钾：溶解7 5g 氯化钾于足量的水中，加水定容到1 0 0 0m l 。 3m 乙酸钠：溶解4 0 8g 的三水乙酸钠于约9 0 0m l 水中，用冰乙酸调溶液 的p h 至5 2 ，再加水定容到1 0 0 0m l 。 1 0m g m l 溴化乙锭：小心称取1g 溴化乙锭，转移到广口瓶中，加1 0 0m l 第二章实验材料与方法 水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4 贮存。 t r i s 缓冲液：将1 2 1 0g 的t r i s 碱溶解于约0 9l 水中，加4 6 0m l 浓盐酸， 用水调整终体积至1 0l ，则p h8 0 ；加6 6 0m l 浓盐酸，用水调整终体积至 1 0l ，则p h7 6 。 o 5me d t a - 配制等摩尔的n a 2 e d t a 和n a o h 溶液( 0 5m ) ，混合后形成 e d t a 的三钠盐。或称取1 8 6 1g 的n a 2 e d t a 2 h 2 0 和2 0 0g 的n a o h ，并溶于水中， 定容至1 0 l 。 t e 缓冲液( 用于悬浮和贮存d n a ) ：lm l1mt r i s h c i ( p h7 4 8 0 ，2 5 ) ， 2 0 0r t l o 5me d t a ( p h8 o ) ，1 0 0m l 水。 5 0 x t r i s 乙酸( t a e ) 缓冲液( d n a 电泳用) ：t r i s 碱2 4 2g ，5 7m l 的冰乙 酸，2 0 0m l 的0 5me d t a ( p h8 0 1 ，用水补足1l 。 碱裂解液i ：5 0m m 葡萄糖，2 5m m i r i s c l ( p h8 0 ) ，1 0m me d t a ( p h 8 o ) 。溶液i 可成批配制，每瓶1 0 0m l ，高压灭菌1 5m i n ，储存于4 冰箱。 碱裂解液i i ：0 2mn a o h ( 临用前用1 0mn a o h 母液稀释) ，l s d s ( 每 次使用前新鲜配制) 。 碱裂解液i i h5mk a c6 0 0m l ，冰醋酸1 1 5 m l ，h 2 02 8 5 m l ，定容至 1 0 0 0m l ，并高压灭菌。溶液终浓度为：k + ：3m a c ：5m 。 s t e s ：0 2mt f i s c 1 ( p h7 6 ) ，0 5m n a c i ，0 1 ( m v ) s d s ，0 0 1me d t a ( p h8 o ) o s b b u f f e r ( 1 0 0 0 l ) ：lm l i a c2 0 0 灿；6 0 p e g6 0 0 灶；4 md t t 2 5 此； 1 0m g m ls s d n a2 5 此；d d h 2 01 5 0 皿( s s d n a 使用前1 0 0 煮5m i n ，冰浴5 m i n ) 。 重蒸酚：氯仿：异戊醇：2 5 ：2 4 ：1 体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助 于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积体积 = l ：1 混合上述饱和酚与氯仿即得酚氯仿( 1 ：1 ) 。酚和氯仿均有很强的腐蚀性， 操作时应戴手套。 氨基酸混合液10 x ( a m i n oa c i dm i x ) ：称取氨基酸混合物( 含a d e n i n e s u l f a t e0 2 g ，l - a r g i n i n e h c l0 2g ，l - i