（药物化学专业论文）琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究.pdf

琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 摘要 琼胶是一种从江蓠、石花菜等红藻中提取出来的水溶性多糖，主要 由琼脂糖和硫琼胶两部分组成。琼脂糖是由交替的3 o1 3d 半乳吡喃糖 和4 o 3 ，6 内醚q l 半乳吡喃糖连接而成的链状中性糖。琼胶寡糖则是 琼脂糖降解得到的低聚寡糖，其中b 琼胶酶裂解琼脂糖的b 1 ，4 糖苷键， 生成新琼寡糖系列，酸和a 琼胶酶裂解琼脂糖的仅1 ，3 糖苷键生成琼寡 糖系列。研究表明新琼寡糖具有耐受消化酶，抑制细菌生长等功能，琼 寡糖也有抑制癌细胞及治疗炎症类疾病等多种活性。 本文分别利用b 琼胶酶和盐酸降解琼脂糖，得到新琼寡糖和琼寡糖， 采用柱前衍生技术，与衍生试剂1 苯基3 甲基5 吡唑啉酮( p m p ) 反应， 生成的衍生物具有很强的紫外吸收。利用毛细管区带电泳一紫外检测技术 分别对新琼寡糖和琼寡糖进行分离分析研究，优化了衍生条件，并考察 了电泳介质浓度、p h 值及工作电压对分离的影响。结果表明：新琼寡糖 在柱温2 5 ，电压3 0k v ，p h9 0 ，2 0m m o l l 的硼砂缓冲溶液中实现了 最佳分离；琼寡糖在柱温2 5 ，电压3 0k v ，p h1 0 0 ，3 0m m o l l 的硼 砂缓冲溶液中实现了最佳分离。 本论文首次利用高效毛细管区带电泳模式进行了琼胶寡糖的分离分 析，并建立了较为系统的分离分析方法。该方法也可借鉴于其它低聚寡 糖的研究，丰富和发展了寡糖类的分析方法。 关键词：1 苯基3 甲基5 吡唑啉酮；琼胶寡糖；高效毛细管电泳； 紫外检测 ， s e p a r a t io na n da n aiy siso fa g a r o 一 0lig o s a c c h arid e sb yh ig hp e r f o r m a n c ec a piiiar y eie c t r o p h o r e sis a b s t r a c t a g a li sak i n do fw a t e rs o l u b l ep o l y s a e c h a l i d ee x t r a c t e df r o mr e da l g a e l i k ec r r a c i l a r i a , i ti sc o m p o s e do fa g a l o s ea n ds u l f u r i ca g a l a g a l o s ei sa l i n e a lc h a i nc o m p o s e do fa l t e r n a t e l ya r r a n g e d3 一o l i n k e d p - d g a l a c t o - p y r a n o s e a n d4 - 0 一l i n k e d 3 , 6 - a n h y d r o - a - l - g a l a c t o p y r a n o s er e s i d u e s 1 3 - a g a l a s eh y d r o l y z e s3 - l ，4l i n k a g e so fa g a l o s ey i e l d i n gn e o a g a l o - - o l i g o s a c c h a r i d e s ，w h i l et h ea c i da n da - a g a l a s eh y d r o l y z e sq - l ，3l i n k a g e sy i e l d i n g a g a r o o l i g o s a c c h a r i d e s r e s e a r c hs h o w st h a tn e o a g a l o o l i g o s a c c h a r i d e sh a v e t h ef u n c t i o no fd i g e s t i v ee n z y m et o l e r a n c ea n ds u p p r e s s i n gt h eg r o w t ho f b a c t e r i a a g a l o o l i g o s a c c h a i d e s c a nr e s t r a i nt h ec a n c e rc e l l sa n dc u r e i n f l a m m a t o r yd i s e a s e s i nt h i sp a p e ra g a r o s ei sd e g r a d e db o t hb yb _ a g a l a s ca n dh y d r o c h l o r i c a c i d ，t h ed e g r a d a t i o np r o d u c t sa r es e p a r a t e l yn e o a g a r o o l i g o s a c c h a r i d e sa n d a g a l o o l i g o s a c c h a l i d e s t h eo l i g o s a c c h a r i d e sa l ed e r i v a t i z e db y1 - p h e n y l - 3 - m e t h y l - 5 一p y r a z o l o n e ( p m p ) 谢t l ll l i g hu l t r a v i o l e ta b s o r p t i o n i nt h e p r e c o l u m nd e r i v a t i z a t i o na n dd e t e c t e db yc z e u vt h eo p t i m i z a t i o ns t u d i e so f d e r i v a t i z a t i o n , b u f f e rc o n c e n t r a t i o n ，b u f f e rp hv a l u ea n dw o r k i n gv o l t a g e h a v eb e e np e r f o r m e dw i t hr e s p e c tt ol a b e l i n ga n ds e p a r a t i o nc o n d i t i o n so f o l i g o s a c c h a l i d e s t h er e s u l ts h o w st h a tt h en e o a g a r o o l i g o s a c c h a r i d e sr e a c h t h eb e s ts e p a r a t i o ni nt h es o d i u mt e t r a b o r a t ed e c a h y d r a t eb u f f e ro fp h9 0 ，2 0 m m o l la t2 5 cu n d e rt h ew o r k i n gv o l t a g eo f3 0k v , w h i l et h ea g a l o - o l i g o s a c c h a r i d e ss e p a r a t eb e s ti nt h es o d i u mt e t r a b o r a t ed e c a h y d r a t eb u f f e ro fp h 10 0 ，3 0m m o l lu n d e rt h es a m et e m p e r a t u r ea n dv o l t a g e t h eh p c em e t h o di sf i r s t l yu s e di nt h es e p a r a t i o na n da n a l y s i so f n e o a g a r o o l i g o s a c c h a l i d e sa n da g a r o - o l i g o s a c c h a r i d e si nt h i sp a p e r i tc a n a l s ob eu s e di nt h er e s e a r c ho fo t h e ro l i g o s a c c h a r i d e s ，a n de n l a r g e dt h e a n a l y s i sm e t h o d so no l i g o s a c c h a r i d e s k e y w o r d s ：1 - p h e n y l - 3 - m e t h y l 5 - p y r a z o l o n e ；a g a r o - - o l i g o s a c c h a r i d e ；h p c e ； u l t r a v i o l e td e t e c t i o n 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王薪钕签字日期：狮岳年月石e t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：蔓勋敏 签字日期：细g 年6 月日 导师签字： 墨 ，勺 参等 签字日期：魄年6 月6 日 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 - j l _ 一 月l j 吾 糖是生物体内普遍存在的一类化学物质，几乎存在于所有的有机体 中，包括动物、植物、微生物( 细菌和真菌) 及海藻。它们是植物和动 物的能量来源，而且在很多生命过程中起重要作用。2 0 世纪7 0 年代以来， 随着免疫物质、生物膜及多种生物活性物质的研究表明，糖类在生物体 内具有各种关键的生物学功能，因此糖类的研究成为人们关注的焦点。 大量的药理实验表明，多糖类化合物具有免疫增强与调节、抗肿瘤、抗 病毒、抗凝血、抗放射、抗衰老等作用i l j 。日本自2 0 世纪8 0 年代以来， 已有数种多糖应用于临床。糖和糖缀合物在生物体内起着很重要的生理 功能，如调节生物体的免疫系统，参与细胞和分子的识别等过程。尤其 是糖蛋白中的寡糖链，它参与蛋白质的靶向、细胞识别以及抗体一抗原 相互作用等重要生命过程1 2 1 。糖的结构和功能研究成了继d n a 、蛋白质 之后的一个重要课题而倍受人们重视p j 。 一、琼胶寡糖的生物活性 琼胶是海洋中含量较为丰富的一类多糖，是从红藻类海藻中提取出 的天然多糖胶体，琼胶主要由琼脂糖和硫琼胶两部分组成。琼脂糖是由 交替的3 0 b d 半乳吡喃糖和4 - 0 3 ，每内醚q l 半乳吡喃糖连接而成的 链状中性糖。琼胶寡糖一般是指聚合度( d p ) 为2 1 0 的低聚糖，包括琼寡 糖( 还原端为3 ，6 内醚半乳糖) 和新琼寡糖( 还原端为半乳糖) ，其中琼寡糖 是由酸和仅琼胶酶裂解琼脂糖的a l ，3 糖苷键生成，而新琼寡糖是p 琼 胶酶裂解琼脂糖的b 1 ，4 糖苷键生成。 寡糖又称低聚糖( o l i g o s a c c h a r i d e ) ，是一类由2 1 0 个单糖经脱水缩 合形成糖苷键连接成的直链或支链的聚合糖1 4 1 。寡糖具有低热、稳定、 安全无毒、无残留等理化性质，能够抑制细菌、真菌，同时对肿瘤细胞 有抑制作用，在疾病诊断与预防、营养与保健、畜牧养殖、植物生长调 节及抗病毒等方面的应用具有巨大潜力【5 1 。琼胶寡糖是一种来源于海洋 的寡糖，由于海洋环境比较特殊，尽管海洋中的糖类资源并不十分丰富， 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 但其组成与结构却非常有特色，目前已经得到广泛研究的海洋寡糖主要 有四种：几丁寡糖、褐藻寡糖、卡拉胶和琼胶寡糖。 研究发现琼寡糖具有多种生理活性，不同聚合度的琼寡糖展现出不 同的活性。d p 在2 - 4 的琼寡糖可以抑制前列腺素e 2 ( p g e 2 ) 和肿瘤坏死因子 ( t n f a ) 的产生，从而抑制癌细胞的发生；可以通过阻止可诱导性n o 合 成酶( i n o s ) 的表达来抑制过量n o 自由基的产生，从而消除n o 过量造成 的损伤；治疗一些炎症类疾病，如关节炎等嘲；而d p 在6 8 的琼寡糖则在 植物生物工程方面起到一定的作用，是植物特别是藻类防御体系中重要 的激发子，当高等植物受到外界因素侵扰时，琼寡糖会作为信号去激发 植物体内的防御系统，增加分子氧的消耗量，释放过氧化氢【7 1 。由此可 见琼寡糖在作为药物方面具有很大的潜力，并且在植物的病害防御研究 方面也起着很重要的作用。徐强等【8 】通过正交实验确定了盐酸水解琼胶 的最佳方案，经h w - 4 0 凝胶柱层析后得到了琼胶低聚糖各寡糖组分，并 用化学发光分析法比较了琼胶、琼脂糖水解液在抗坏血酸一c u 2 + 酵母悬浮 液鲁米诺h 2 0 2 体系中清除羟基自由基的能力。陈海敏等【9 】用活性炭柱对 琼寡糖进行纯化，利用a 葡萄糖苷酶活性的检测，探讨以琼二糖为主的 琼胶寡糖对糖尿病小鼠的血糖及其氧化抗氧化效应的影响。结果表明， 在2 0 0 4 0 0m g k g 的剂量范围内，琼寡糖可明显降低糖尿病小鼠的血糖含 量及各氧化指标。马红辉等【l o 】利用抗霉素a 诱导肝细胞内的活性爆发， 通过二乙酰基2 ，7 二氯荧光素检测细胞内的氧化状况，并利用荧光显微镜 和流式细胞仪记录荧光变化情况。结果表明琼六糖能够有效地抑制肝细 胞内活性氧的进一步爆发，并减少细胞的氧化损伤。 新琼寡糖是由琼胶或琼脂糖经p 琼胶酶降解生成的以3 , 6 一内醚q l 半乳糖作为非还原性末端，p d 半乳糖为还原性末端的系列中性寡糖， 目前对于新琼寡糖生理活性的研究相对较少，有研究表明新琼二糖具有 美白和保湿的功能，b i nh u 掣l l j 通过体内体外两方面实验的研究，证明 了新琼寡糖能够耐受消化酶的作用，可以明显改变肠道菌群的结构，促 进双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖，抑制有害菌的生长，是一种新型的潜在 益生元。 2 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 二、糖类的分离分析方法 多糖种类繁多，组成与结构相当复杂。多数多糖类化合物既没有光 吸收基团，又没有生色团，因而使糖的检测十分困难。关于糖类化合物 的分析方法虽已有许多报道，但很多检测手段灵敏度低，不能达到检测 的目的。如常规的菲林法、二硝基水杨酸法等化学分析方法只能测定总 还原糖，不能测定各种糖的含量【1 2 1 。混合糖的分离鉴定及其组成的分析 方法一般采用纸色谱【1 3 1 、薄层色谱法及柱色谱法【1 5 _ 1 6 1 ，这些经典的 层析法分辨率低，分析时间长，定量测定困难。近年来糖组分分析方法 主要以气相色谱法、高效毛细管电泳法【1 7 】和高效液相色谱法为主。 1 气相色谱法( g a sc h r o m a t o g r a p h y , g c ) 气相色谱法( g c ) 测定糖类始于1 9 5 8 年，具有选择性好、样品用量少、 分辨率高、快速准确、灵敏度高等优点，近年来在国内外得到了广泛应 用。采用气相色谱法测定糖类，遇到的主要困难是糖类本身没有足够的 挥发性，必须将其转化为挥发性衍生物才能进行g c 测定。对于多糖需 要首先降解为结构简单的单糖，然后将其衍生成易挥发、热稳定的衍生 物，通过对降解糖的衍生物的定性、定量测定，可得到多糖的单糖组成 1 9 - 2 2 o 糖类物质g c 检测衍生物主要分为下列2 种：( 1 ) 硅烷化衍生反应 三甲基硅烷化方法是糖羟基衍生化的主要方式之一，糖和六甲基二硅氨 烷、三甲基氯硅烷在溶剂如吡啶中反应，生成具有挥发性的三甲基硅醚 衍生物，同时产生氯化铵沉淀。( 2 ) 乙酰化衍生反应糖类物质的乙酰 化衍生物性质稳定，衍生化过程简单，因此乙酰化衍生方法在检测糖类 物质方面已得到广泛的应用。 由于糖的异构化，在某些衍生物的制备过程中，会产生衍生物的异 构体，使色谱分析时每种糖产生几个峰，影响组分的分离和测定【2 3 1 ，因 此在分析糖类样品时应选择适宜的衍生物制备方法和适宜的固定相。常 用的衍生物有糖的三甲基硅醚衍生物、糖醇三氯乙酸酯衍生物【2 4 】和糖腈 乙酸酯衍生物。用于糖类分析的固定相从非极性、中等极性到极性都有 应用。硅烷化衍生物常用中等极性的色谱柱，酰基衍生物可用极性较强 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 的色谱柱分离【2 5 1 。 2 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 高效液相色谱法是2 0 世纪6 0 年代末以经典的液相色谱为基础，引 入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固 定相及在线检测等手段发展而成的分析、分离方法。高效液相色谱法作 为一种高效、快速的分离分析技术，以其灵敏度高、选择性好、可分析 微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域应用最广、发展最快 的现代分析技术之一【2 6 】。 糖的高效液相色谱法分析在7 0 年代就开始研究，是糖类研究方法学 中的重要组成部分，多年来已取得了较大的进展，它具有快速、方便、 分辨率高、分离效果好、重现性好和不破坏样品等优点，成为常量及微 量单糖和寡糖重要的分析分离方法之一，尤其适用于测定热不稳定的单 糖和低聚糖，效果较好。到目前为止，有两种通常采用的方法：一是使 用化学键合固定相，以乙腈一水或乙腈一甲醇一水作为流动相，单糖或 寡糖由示差折射检测器检测。为了提高检测的灵敏度和分辨率，糖类经 常有紫外或荧光标记的物质衍生化后，用硅胶做固定相，以正己烷一二 氧六环为流动相，在紫外或荧光检测器上检测单糖或寡糖；另一种方法 是以离子交换树脂或凝胶做固定相，水或盐溶液为流动相，用示差检测 器或采用柱后衍生化方法，用可见光、紫外光或荧光检测器检测，以提 高检测灵敏度。此外，h p l c 还可以测定多糖的分子量，可以对糖进行定 量分析【2 7 】。 3 高效毛细管电泳( h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，h p c e ) 毛细管电泳法( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ) 又称高效毛细管电泳，是8 0 年代问世的一种高效液相分离法，是经典电泳技术和现代微柱分离相结 合的产物。它一出现就引起分离科学界极大的关注。目前，它已成为和 2 0 世纪5 0 年代末、6 0 年代初出现的气相色谱( g c ) 以及2 0 世纪7 0 年代初出 现的液相色谱( h p l c ) 相媲美的一种分离技术，并被认为是当代分析科学 最具活力的前沿研究课题。 3 1 毛细管电泳技术的发展 4 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 毛细管电泳是在传统电泳技术的基础上逐步发展起来的。电泳技术 的出现可以追溯至u l o o 多年前。由于当时科学技术尚不发达等原因，电泳 技术的应用主要以区带电泳和凝胶电泳两种形式出现。在这两种形式中， 区带电泳遇到扩散和检测等难题；凝胶电泳有准确定量困难、使用寿命 短、难于实现自动化等缺点，推广应用受到限制。直到本世纪8 0 年代初， j o r g e n s o n 和l u k a c s 2 9 - 2 9 奠定了毛细管区带电泳的基础理论后，电泳技术 才开始重新得到发展，出现了毛细管电泳( 亦称高效毛细管电泳) 。在毛 细管电泳中由于采用了毛细管等新技术，克服了传统区带电泳的热扩散、 样品扩散和凝胶电泳灵敏度低等问题，将传统电泳的高分辨能力同高效 液相色谱的速度有机地结合起来，大大提高了分离效率和分析速度。 8 0 年代初，第一次展示的毛细管区带电泳装置，使用的是内径为 7 5 p m 的毛细管，在线荧光检测器3 0 k v 电压下成功地分离了氨基酸和多肽 类物质，塔板数高达4 0 万。此后各种有机自由区带电泳技术和装置得到 了进一步发展，同时，针对自由区带电泳( c z e ) 技术只能分析带电粒子而 不能分析中性分子的缺陷，f e r a b e 3 0 】等人于1 9 8 4 年提出了胶束电动毛细 管色谱( m e k c ) ，从而使毛细管电泳技术的应用范围扩大至中性分子。 近年来，毛细管区带电泳与毛细管等速电泳等的联用技术也得到了 发展【3 1 0 5 1 。近两三年，国外杂志如a n a l c h e m 和上c h r o m a t o g r 等发 表了许多有关高效毛细管电泳的研究论文和综述，所涉及的内容有分离 效率、分离机理、进样、样品浓缩、灵敏度放大技术、精密度、准确度、 选择性研究、检测、联用技术和热影响等等。我国学者在h p c e 方面的 研究较为全面，有些成果达到国际先进水平。国内也先后出版了中文毛 细管电泳专著【3 6 3 8 ，在一些相关的色谱技术专著中都将h p c e 技术列入 1 3 9 1 。此外，尚有许多专著发表【4 0 删。这些相关理论和技术的进展，使毛 细管电泳的灵敏度和分离效率进一步提高，检出限更为降低。 3 2 毛细管电泳基本原理【4 7 4 8 】 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样 品各组分之间的淌度及分配上的行为差异而实现分离目的的一类液相分 离技术。在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下， 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。 粒子在单位电场下的电泳速度称之为淌度。由于不同离子所带电荷及性 质的不同，迁移速率不同可实现分离。 石英毛细管柱，内充液p h 3 时，表面电离成s i o ，管内壁带负电荷 形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极 移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向 负极移动，这种现象称为电渗现象。在电场中带电粒子的迁移速度等于 电泳和电渗流两种速度的矢量和。对于正离子来说，两种效应的运动方 向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳 离子后流出；对于阴离子，两种效应的运动方向相反，当电渗流速度大 于电泳速度时，阴离子在负极最后流出。在这种情况下，不但可以按类 分离，除中性粒子外同种类离子由于受到的电场力大小不一样，也同时 被相互分离。 电渗现象是高效毛细管电泳中的基本现象之一，电渗流的速度约等 于一般离子电泳速度的5 7 倍，改变电渗流的大小和方向可改变分离效率 和选择性，如同改变l c 中的流速。电渗流的微小变化影响结果的重现性， 在h p c e 中，控制电渗流非常重要。 。 h p c e 中影响电渗流的因素有以下几点： 1 电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度 一定时，电渗流速度正比于工作电压。 2 毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的 电渗流大小不同；为加快分离速度、提高分离效率还可以用物理或 化学法使毛细管内壁改性【4 9 捌1 ，改变壁表面硅羟基数目，使壁表面 电荷特征变化，可明显改变电渗流的大小或方向。 3 电解质溶液性质的影响( 1 ) 溶液p h 的影响对于石英毛细管，溶液 p h 增高时，表面电离增多，电荷密度增加，管壁z e t a 电势增大，电 渗流增大。( 2 ) 阴离子的影响缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚 度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强 度增加，电渗流下降。 6 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 4 温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流 增大。 5 添加剂的影响( 1 ) 加入浓度较大的中性盐如k 2 s 0 4 ，电渗流减小。 ( 2 ) 加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向。( 3 ) 加入有机溶剂 如甲醇、乙腈，使电渗流增大【5 2 1 。 3 3 毛细管电泳的仪器装备 毛细管电泳仪器装置如图1 所示，一般由以下几部分组成：1 高压 电源；2 毛细管；3 在线检测器；4 电极及缓冲液；5 加样系统。 石英毛细管的两端分别浸在含有电解质溶液的贮液槽中，毛细管内也充 满同样的电解质。毛细管的一端安装在线检测器。若是光学检测方式， 毛细管本身可作为流动池；若是电导或电化学检测器，则可通过将电极 直接插入毛细管中检测等。 曲 s a m p l e b u f f e r b u f f e r 图lh p c e 结构图 f i g 1s t r u c t u r eo fh p c es y s t e m 如同柱子足色谱的心脏一样，毛细管柱也是毛细管电泳的心脏。有 关柱子的研究是当前毛细管电泳技术研究的热点之一【5 3 - 5 5 1 。目前商用毛 细管有两类，一类是管壁没有处理的，另一类是处理的。在p h 3 时， 在毛细管管壁上的硅醇电离，产生负电，因此带来了两个问题，一是电 渗流，另一个是吸附。电渗流是由贴近管壁的电介质阳离子和管壁中硅 7 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 羟基所带的负电荷之间的偶电层形成，其速度是泳流的若干倍，并且易 变；吸附则是由蛋白质表面的阳离子基团和电离的硅羟基的键合引起。 两种现象均能严重地影响毛细管电泳分析在定性和定量上的重复性。 对管壁进行处理是克服这两种现象的有效途径。现有的处理方法有 好多种，一种是先加r 甲基丙烯羟基丙酯三甲氧基硅烷，使之与管壁进 行共价连接，然后加入四甲基乙二胺和丙烯酰胺，在管子表面形成单分 子层；另一种是用吡咯烷酮代替丙烯酰胺；还有一种是采用磷酸盐，磷 酸盐在气相色谱中曾用来作为管子表面的湿润剂或减尾剂，可使活性吸 附中心饱和。在电泳中采用这种办法也可屏蔽吸附点，减小电渗，但是 它只能在低p h 下使用，最近r e , t i e r 等提出了在酸性条件下为正的聚乙烯 胺键合相涂料和非离子型的聚环氧树脂涂料，并指出为完全消除电渗流 的影响，涂层厚度必须大于3 0 a 。 检测器的问题也是毛细管电泳技术发展上的一个重要部分，其中的 技术关键是如何通过这么细的毛细管取得信号。毛细管直径非常小，溶 质通过时所产生的区带的体积也极小。如果是柱外检测，主要困难来自 于如何把极细的管子接在一起，通常情况下它会扰乱管内的流动，使谱 带展宽影响分离；若是采用柱内检测，则要考虑到无论是从通道的长度 还是体积来说都远远小于液相色谱，采用增加前后石英聚焦镜的办法看 来比较有效。相比之下，荧光检测在技术上更容易一些，但是被检测化 合物的范围却要窄得多。 目前应用的有激光一荧光检测、二极管列阵、电泳一质谱联用1 5 6 】等。 如果毛细管电泳一质谱联用能够成为常规手段，那么将使毛细管电泳的 使用价值有极大的发展。因为随着谱图里峰数目的增加，鉴定就将成为 极其重要的问题了。类似的问题在毛细管气相色谱里就是通过气一质联 用解决的。电泳一质谱联用有点类似于液相色谱一质谱联用，就分析范 围而言两者相当，它们的流动相也相似。当然，电泳通常是用电介质溶 液。目前的研究表明，只要电离程度足够小，毛细管电泳这样小的流出 量对于设计界面器来说不会带来特别的困难，事实上可能还要更方便些。 3 4 高效毛细管电泳的分离模式 8 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 ( 1 ) 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) c z e 是毛细管电泳中最基本的模式。目前，在所有基于毛细管电泳 的研究中有6 0 是运用此模式。适于c z e 分析模式的研究对象包括金属 离子、无机阴离子、小分子有机酸、有机碱、肽类以及蛋白质。应用c z e 模式的前提是分析对象必须或能够带有一定的电荷，这样才能使分析物 质在电场力的作用下泳动。 i ( 2 ) 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y ，m e k c ) t e r a b e 于1 9 8 4 年首次创建了毛细管电泳m e k c 分析模式【5 7 1 ，并且出 版了专著。与c z e 相比，其最大的不同之处是具有分离电中性化合物的 能力。m e k c 技术的关键所在是必须在运行缓冲液中加入表面活性剂。 当表面活性剂分子的浓度超过其胶束临界浓度时，该表面活性剂分子会 自然聚合而形成胶束相，起到准固定相的作用，由于带电荷化合物与电 中性化合物在胶束相中的分配系数不同而彼此分离。m e k c 模式具有特 殊的选择性，可用于分离各种离子，而其最大的优势在于分离带有相同 电荷和分子结构相近的化合物。这些化合物由于具有相同或非常近似的 电泳速度，运用c z e 无法将其分离。 ( 3 ) 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) c g e 分离分析是在聚丙烯酰胺或者琼脂糖凝胶填充的毛细管内进行 的，样品的分离是基于填充凝胶孔隙所产生的分子筛作用。此分析模式 主要用于分离蛋白质、寡聚核苷酸和d n a 片断。这些生物大分子多聚物 有其固定的荷质比，难以运用c z e 和m e k c 将其分离。从分离的高效性 和分析时间大幅减少的角度来说，c g e 毫无疑问将成为一种替代传统的 平板凝胶电泳和s d s p a g e 技术的新方法，但同时也面临一些有待解决 的问题，例如凝胶断裂、凝胶降解作用、进样末端的堵塞和毛细管使用 寿命缩短等。 ( 4 ) 亲和毛细管电泳( a 蕊n i t ) ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e ) t 5 8 】 亲和作用是指二个或者二个以上化学基团之间形成如氢键、静电作 用、疏水效应和范德华力等特殊的相互作用。人们将电泳过程中分析物 与缓冲溶液添加剂之间产生亲合效应而达到分离目的的技术称为a c e 。 9 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 最近几年有关a c e 的应用研究文章明显增加。a c e 主要用于确定某 些物理化学参数，如金属与蛋白质分子的键合常数、酶与抑制剂的相互 作用、碳水化合物分子的识别作用、d n a 与肽类分子的相互作用、抗原 抗体相互作用和蛋白质与药物的缔合作用等。有文章重点论述了应用 h a c e 分析模式确定蛋白质与药物之间的相互作用【5 9 1 。 ( 5 ) 毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i e f o c u s i n g ，c i e f ) c l e f 是在毛细管中形成稳定的p h 梯度，所有的分析物质经电泳迁移 停留在各自的等电点区域，然后将其从毛细管中顺序洗脱测定，或者在 它们各自的等电点区域进行在线检测。该方法可以替代常规电聚焦和层 析聚焦技术来确定蛋白质的等电点( p l 值) ，y a o 等人应用c f 测定了酸性 和碱性蛋白质的p l 值【6 0 j 。 ( 6 ) 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 使用被球形固定相填充的( 填充c e c ) 或是用某种类型吸附剂在其内 壁上进行涂层( 开e i c e c ) 的熔融硅胶管。电渗流使样品和洗脱剂通过毛细 管，分离的产生是由于不同分析物的电泳迁移率不同及其在固定相和流 动相之间分配系数的不同。与压力驱动的色谱方法相比，其塞式电渗流 有助于提高分离效率，当容量因子极低时作用尤为明显。但是该方法也 面临着诸如产生气泡、重现性不好等问题。 以上为毛细管电泳技术六种基本模式，此外毛细管等速电泳、无水 毛细管电泳1 6 1 】等技术近年来也有较大的发展。 3 5 毛细管电泳的特点； 高效毛细管电泳技术是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大 进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，使单细胞分析乃至 单分子分析成为可能。和传统电泳技术及现代色谱相比h p c e 的突出特 点是： l 、仪器简单，操作方便，容易实现自动化。简易的高效毛细管电泳仪器 组成极其简单，只要有一个高压电源、一根毛细管、一个检测器和两个 缓冲溶液瓶，就能进行高效毛细管电泳实验。 2 、分离效率高，分析速度快。理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。 i 0 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 可在3 分钟内分离3 0 种阴离子；1 7 分钟分离1 9 种阳离子；4 分钟可分 离1 0 种蛋白质。 3 、操作模式多，分析方法开发容易。只要更换毛细管填充溶液的种类、 浓度、酸度或添加剂等，就可以用同一台仪器实现多种分离模式。 4 、实验成本低，消耗少。进样为纳升级或纳克级，分离在水介质中进行， 消耗的大多是价格较低的无机盐。毛细管长度仅5 0 7 0 c m ，内径2 0 7 5 1 x m ， 容积仅几微升。 5 、自动化程度高，作为新型分离技术，h p c e 具有高度自动化。 所有这些优点使得毛细管电泳迅速成为一种极为有效的分离技术。 近几年来，h p c e 受到分离科学界的极大关注，成为分析化学领域发展最 快的一种新型分离分析技术，在临床医药1 6 2 删、环境监测【6 5 1 和生命科学 1 6 6 - 6 7 1 中都发挥越来越重要的作用。 同时毛细管电泳技术在使用中也存在着一些问题，比如吸附引起电 渗变化，进而影响分离重现性，近年来各种不同的方法用来提高h p c e 的重现性，如张红医【6 8 1 提出在电流信号突跃辅助下的时间比法来提高毛 细管电泳的重现性：另外h p c e 进样量低，制备能力差；受毛细管狭窄内 径的限制，有效光程短，非高灵敏度的检测器难以检测出样品峰等。 3 6 糖类的毛细管电泳 糖是自然界和生物体中广泛存在的物质，早在1 0 0 年前德国著名的 科学家f i s c h e r 就开始对糖进行研究。近3 0 年来，随着分离、检测技术 的发展，糖类化合物再度引起人们的兴趣，特别是糖类的代谢产物的分 析、糖蛋白中寡糖链的结构和功能的研究、糖蛋白的微观不均一性都有 非常重要的意义。各种色谱技术及传统电泳技术均可用于糖的分析l 钞7 。 毛细管电泳( c e ) 技术是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一种新的分离手段， 已开始应用于糖的分离、结构测定、定性定量和活性筛选上【7 2 - 8 4 1 。糖是 多羟基醛、酮、醇及它们的衍生物，按其所含单元的数目可分为单糖、 寡糖和多糖，以下将分别介绍各个类型的糖的毛细管电泳分析方法。 3 6 1 单糖的高效毛细管电泳分析 单糖从结构上来说，它是多羟基的醛或酮，是组成糖类及其衍生物 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 的基本结构单元。单糖之间缩聚可以形成寡糖或多糖，还可以与非糖物 质结合形成糖苷。一般来讲简单的单糖是中性糖，需要将其转化成带电 荷的形式进行电泳。由于单糖i 拘p k a 值一般大于1 1 ，故需选用强碱性的 缓冲液( p h 11 ) ，使糖基上的羟基去质子而带负电，直接进行电泳分离， 用紫夕b ( 1 9 5n m ) 检测。也可以选用硼酸盐缓冲液，硼酸盐与糖基络合形 成带负电的络合物以进行电泳分离，用紫外检测。另外，采用紫外或荧 光衍生试剂，如2 氨基吡啶、2 氨基喹啉、8 氨基萘1 ，3 ，6 - - - - 磺酸( a n t s ) 等对单糖进行标记，既可以使糖带上一定的电荷，也可以增加检测的灵 敏度。 岩峰等1 8 5 】在八种结构相近的单糖还原端接上对氨基苯甲酸乙酯，用 硼砂体系实现了毛细管电泳分离和高灵敏度检测，优化了分离条件，建 立了以p 吲哚乙酸为内标的定量方法，测定了定量线性范围；常理文等 8 6 1 将生物体中常见的9 种单糖经a 萘胺衍生化后，用5 0m m o l l 硼砂作为电 泳介质，实现了高效毛细管电泳分离，并以b 吲哚乙酸为内标，研究了9 种单糖毛细管电泳的定量方法；余兆楼等【87 】研究了单糖的毛细管电泳间 接紫外检测法，选用d 吲哚乙酸磷酸钠体系作为背景电解质，用于9 种 未经衍生的单糖进行毛细管电泳分离和间接紫外检测取得了满意结果， 对半乳糖、甘露糖和葡萄糖酸的检出极限为2 1 0p m o l 水平；茅庆文掣黯j 运用毛细管区带电泳( c z e ) 技术对n 2 吡啶糖氨化合物进行检测，分别用 p h1 0 的h 3 8 0 2 k o h 和p h3 5 的n a h 2 p 0 4 h 3 p 0 4 为缓冲液对麦芽糖、鼠李 糖、脱氧核糖、岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和甘露糖进行定性， 给出两种载液下的相对保留时间表；日本的h o n d a 等【8 9 】将一系列单糖转 化成它的氨基吡啶衍生物，对十一种单糖同时进行定量；车发云等凹】建 立了毛细管电泳同时分析1 1 种常见还原单糖的2 氨基吖啶酮胺化还原衍 生物的方法。衍生反应在4 5 进行5h ，用毛细管电泳分离，于波长3 6 4n i l l 在线检测单糖衍生物。单糖的化学衍生极限为1 0g m o l l ，单糖的浓度和 质量检测极限分别为0 6p m o l l 和1 7f m o l ；任吉存等【9 1 l 采用激光干涉检测 方法系统研究了单糖亚砷酸络合物的电泳行为，并考察了溶液 p h 值、 亚砷酸盐浓度对单糖亚砷酸络合物淌度的影响，从而建立了一种单糖毛 1 2 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 细管电泳分离及直接检测的新方法；由于糖缀合物具有较弱的紫外吸收， 林启山等【嘲采用了一种与单糖有高反应活性的新型紫外、荧光衍生试剂 芴甲氧羰基肼( f m o c h y d r a z i n e ) 和芴甲氧羰基氯( f m o c c 1 ) 对单糖进行 衍生，利用高效毛细管电泳( h p c e ) 对衍生产物进行了分析。结果表明以 上衍生试剂可用于f m o l 级单糖的测定；v i c t o r i ar u i z c a l e r o 等1 9 3 】以p h 4 5 ，10 0m m o l l 的醋酸盐为运行缓冲溶液，用间接激光诱导荧光检测法 测定了粘多糖酸解得到的经a p t s 衍生的单糖，结果表明方法的线性和精 密度良好，此方法还被应用于肝磷脂的酸解产物的分析。 3 6 2 寡糖的高效毛细管电泳分析 寡糖一般是由2 1 0 个单糖分子通过糖苷键连接而成的化合物。它广 泛存在于生命体内，主要是以糖蛋白、糖脂和糖肽等糖缀合物的形式参 与许多生命活动，而这些糖缀合物在发挥生物学功能的过程中起决定作 用的往往就是那些寡糖残基。因为寡糖有着多种重要的生物活性，加之 其在保健食品工业上的应用与发展，因此有关寡糖的研究及应用已成为 结构化学、分子生物学、医学和食品学的新兴研究领域。 在寡糖的毛细管电泳分析中，常用的络合剂为硼酸盐，它可作为缓 冲液使用。硼酸盐能与糖形成带电的络合物，这些络合物不仅能用c z e 方法进行分离，而且可以在紫外1 9 5a m 处进行检测，这在糖的电泳分析 中是一个很重要的领域。硼酸盐只与寡糖链的外周糖基作用，不与内层 糖基作用，而且与两个顺式一o h 形成络合物的稳定性远远大于与两个反 式一o h 形成络合物的稳定性，所以通过硼酸盐络合，能对具有不同外层 结构的寡糖链进行分析；而且由于硼酸与大小不一的寡糖形成络合物时， 仅只离子化硼酸的一个羟基，即每个络合物都只带一个电荷，故也能根 据分子大小进行分离。缓冲液中使用得很多的除硼酸盐外还有磷酸盐， 它们可以单独使用，也可联合使用。 寡糖的组成分析，则是通过酶解或化学方法水解糖分子，使成单糖， 经毛细管电泳分离分析，使用已知的单糖作内标，即可测定寡糖的单糖 组成及各组份的含量。 常理文等【舛】将麦芽二糖、纤维二糖、异麦芽三糖和异麦芽四糖经洳 琼胶寡糖高效毛细管电泳分离分析方法研究 萘胺衍生化后，用硼砂作为电泳介质，实现了高效毛细管电泳分离，比 较了毛细管区带电泳( c z e ) 和胶束毛细管电动色谱( m e c c ) 分离寡糖a 萘 胺衍生物的电泳行为，对影响分离度的诸因素进行了考察，选择了最佳 分离条件；车发云等【9 5 】将葡聚糖部分酸水解成寡糖混合物，经a n t s 胺 化还原衍生，在p h2 5 ，5 0m m o l l 磷酸缓冲液中，以及在p h9 3 ，1 0 0 m m o l l 硼砂缓冲液中用毛细管电泳分离衍生物，分别得到l 至2 1 和l 至1 8 个聚合度的衍生物电泳梯度图谱，并作出了准确定位的毛细管电泳 双向电泳图；黄刚良等【蚓将酸性条件下水解酵母葡聚糖得到的葡聚寡糖 混合物经低压柱层析分离，然后利用a n t s 衍生，利用f a c e 和毛细管 电泳两种方法对收集到的组分进行了检测。结果表明：毛细管电泳比 f a c e 的分离能力和灵敏度高得多，是一种理想的分析酵母葡聚寡糖的 方法；孙海红等【9 7 1 采用高效毛细管电泳法对酸解卡拉胶寡糖进行了分离 分析，利用柱前衍生技术，与衍生试剂8 氨基萘基1 ，3 ，6 三磺酸( a n t s ) 反应引入荧光基团，对衍生条件和电泳分析条件进行考察，结果表明在 p n2 8 ，2 5m m o l l 柠檬酸钠缓冲液中，运行电压2 5k v ，温度