（运动人体科学专业论文）不同强度运动对大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响.pdf

摘要 务研究滋经证鹅在发育、疾瘸帮运动等垒疆病理过程孛，骨骼瓤 细胞会发生凋亡，假是凋亡的机制并不清楚，本研究试图通过比较不 同强度运动对大鬣不同类爨骨骼腿缩穗凋亡的影响，磷究氧囱由基和 线粒体摄取貔2 + 在骨骼肌细胞凋亡中所起的作用，以探寻运动导致骨 髂肌缁胞确亡的祝铺。 研究方法：成年雄性s d 大鼠3 0 只随机分为安静对照( c ，n - l o ) 、 中等强度运动组( m e ，酾l o ) 和大强度运动组( h e ，n = l o ) 。m e 组跑螽速度沟1 9 3 煳m i n d ( 相当于7 6 。) ，运动至力竭，h 飘 组跑螽速度为2 6 8m m 馘1 ( 相当于9 2 3 讥2 。) ，运动至力竭。寂 静组和运动鳃大鼠分别予安静状态和运动后即刻断头处死，颈部取血 3 m l ，制各m 清，取大鼠盾肢比目鱼肌和胫骨前肌分别制备暾镜检测 标本、石蜡切片、组织匀浆渡积线粒体匀浆渡。测定斑清、缎织匀浆 的s o d 活性和m d a 含量以及线粒体中的c a l 2 + 含量。石蜡切片进行 霹燃l 标记后在光穗下观察凋亡腿细胞拔。电镜下溅察腿缨腿接的 超微结构变化。 磷究结果：( 1 ) 安静对照组的骨嚣腿孛未梭溯裂糊n e l 隧性缨 胞核，m e 组大鼠胫骨前肌未出现细胞凋亡，6 只大鼠的比目鱼肌出 魏孺亡缨毖核，硪l 缀各鸯2 只大鼠鳇照营蓠腿_ 帮比强鱼飘式现烫亡 细胞核； ( 2 ) 电镜下囊察到撰亡觏缨怨核出现染色覆凝集剿孩貘边缘， 细胞核呈现不规则形态； ( 3 ) 酝嚣缢串，魄蠢鱼飘s 0 b 活链与安静缀裙院增蕊了3 9 ( p o 0 1 ) ，同时也鼹著高予胫骨前肌( p o 0 1 ) 。腰组中，比目鹤 臃帮胫骨前骶的s o d 活性都有新增攘，警差异并不显著( p o 晒) 。 运动组血清的s o d 活性与安静组相比下降了，且差异非常显著，佩 不同强度组闷盼差茹不显著； ( 4 ) 两芹中强度的力竭运动后，胫骨前肌和比目鱼肌的m d a 含 ( 3 )m e 舯u p s s o d a d i v i t yo f s o l e u si n c r e a s e da b o u t3 9 m o r et h a n c o n t r o l 孕o u p ss 0 1 e u s 佃 o 0 1 ) ，如di sa l s o 叩p a r e n t l yh i 曲e rt h a n t h a to ft i b i a n sa n t e r i o ri nt h es a m eg r d 叩( p o 0 1 ) 罚es o d a d i v i t i 龉i nh e 鬻0 1 叩a r ei i l c r e a s es l i g h t l yb u tt h ed i 自j r e n c ei sn o t s i g n i f i c a m t h es o da d i v i t yo f s e m mi sd e c f e a s e da f t e re x e r c i s e ， b u tt h e r e i s s i g n i f i md i f 6 e r e n c eb e t w e e nd i 丘b r e ti m e 船i t y e x e r c i s eg r o u p ( 4 ) m d ac o n t e n to fs o l e l l s 柚dt i b i a l i sa n t e r i o ra r eb o t hi n c r e a s e d s i g n i f i c a m l ya f t e rt w ot y p e so f e x e r c i s ei n t e 璐i 吼b u tm d ac o n t e n t d i 丘e r e n c eo fs 0 1 e u sa n dt i b i a l i sa n t e r i o fi nt h es a m e 掣o u pi s o t s j 印询c a m ，n e j t h e r d o e st h a td i 疵r e n c eb e 钾e e n 舸oe x e r c i s e g r o l | p s m d a m e n to fs e r u mi sd e c r e a s e do b v i 0 1 l s l ya k r e x e r c i s e ，w h i c hi sq u i t es i 驴i f i c a mw i t ht h ec o m r o l 乎o u p ，w r h i l e t h ed e 危r e n o eb c t w e e nt w oe x e r c i s eg r o u p s 缸n o ts i g h i 丘丑t ( 5 ) 1 1 1 em i t o c h o n d 血lc 矿i n s o l e l l si si n c r e a s e d b y5 3 n e rm i d d l e i m e 船i t ye x e r c i 辩q 0 0 5 ) ，w h i l e t h e 聆w e r e o n l ys l i g h ti n c f e 舾ei n t h e0 t h c rg r o u p s ，a n dt h ec o m p a r i s o no ft h a tw i t hc o n t m lg r o u ph a s n o s i g i l i 丘c a n c e c 伽d 璐i 蛐s l o w 帅i t c hm u s c l em o r ep r o t oa p o p t o s i sm e r aa c u t e m i d d l ei n t e n s i t ve 】【i l 叫s t i v ee x e r c i s e 觚t em i d d l ei m e 璐i t yo fe 劝柚s t e x e r c i s e t h ep o s s i b l em e d 擒n i s mi st h e 目弓a ta c c u m u l a t i o no fc a 钟i n m i t o c h o n d o n t d g g e rt h e 叩o p t o s i cp r o g r a m ，删c h r e s u h si nt h e k e y w o r d s ： e 耻r c i s e ； s k e l e t a i m 吣d e ；a p o p t o s i s ；f r a m i c a l ； m i t o c h o n d r i a lc a l c i 砌 l 前言 缁藏孺亡是蓦魏生命奉萼学稻医学领域静研究热点，但是对予骨骼 肌细胞凋亡的研究，尤其是生理状态下骨骼肌细胞凋亡的研究并不 多，其中可能有一部分原网是由于骨骼肌细胞怒多核细胞，因此其凋 亡鳇表现形式与零核缨魏凋亡会骞爨区别，它鳇检测难度也更大一 些。而随着绷胞凋亡研究的进一步深入，各种形态学、生化、细胞生 物学检测方法的完善，骨懿脱细脆凋亡的神秘蕊纱逐渐被入们揭开。 过去人们认为运动造成灼肌凌损伤是由于炎症和骨骼胍缨胞坏 死引起的，而近来阑外的动物实验研究驻示，运动后无论是在正常肌 肉还鼹病理状态下静蔑琵离审，骨髂舰缎臆都盘现7 凋亡。餐零同强度 运动对骨骼肌细胞凋亡影响的差舜还没谢系统的论述。 同时，越来越多的研究认为线粒体在高等哺乳动物细胞凋亡过穰 中起饕中心终用。艇b 珏f 辫s s 等的研究1 壤】发现，骨熬舰腿浆孛缺乏 a p a f 1 ，因此认为骨骼肌与其他组织相比更难于发生线粒体介导的 细胞璃亡。究竟线粒体在运动导致的细藏凋亡邋程中起着什么样的作 耀? 运动导致骨骼肌缨胞凋亡究竟是通过什么信号途径介导的? 这 些机制都还不清楚。而众所闰知快、慢肌的差异中有一个重要特征就 是，蠖矾毙恢腿含存更丰鬻的线粒体，因茈对抉、慢飘缨艟撼亡熬揍 况进行比较分析，有助于了解线粒体在骨骼肌细胞凋亡中的作用。氧 自由基和胞内c a 2 + 水平是与线粒体功能密切相关的两个指标，同时它 翻也与缨飕凝亡有羞密不霹分的联系，为了了解它们在运动诱导的缨 胞凋亡中所起的作用，本研究通过对骨骼肌中的s o d 活性、m d a 含 量戬及线粒体曙+ 含量这凡个搔标测定来反应大鼠雷髂蕊纤维的蠢 出基水平和钙代谢状态。 大鼠的比目鱼肌是典型的慢肌( 8 7 为i 型肌纤维) ，胫骨前肌则 是快肌的代表( 只含1 2 的i 型肌纤维) 【2 】，因此本研究采用不同强 度的运动模型，以这两块肌肉为研究对象，研究运动对大鼠快、慢肌 细胞凋亡、自由基水平和钙代谢的影响，期望可以揭示运动导致不同 类型骨骼肌细胞凋亡的机制，为运动训练提供科学的理论依据。 2 研究对象与方法 2 1 研究对象及运动模型 2 1 1 研究对象 成年雄性s d 大鼠3 0 只，由中南大学湘雅医学院动物学部提供， 为清洁级实验动物。体重2 1 9 2 1 9 5 9 ，分笼饲养，自由饮食，国家 标准啮齿类动物饲料饲养( 中南大学湘雅医学院动物学部提供) 。室 温2 0 ，2 4 ，光照时间为7 ：0 0 1 9 ：o o 。 2 1 2 运动方式 将3 0 只大鼠随机分为安静对照( c ，n - 1 0 ) 和运动( e ，n = 2 0 ) 两大组，运动组又分为中等强度运动组( m e ，肛1 0 ) 和大强度运动 组( 骶，n - 1 0 ) 。安静对照组大鼠不运动，运动实验组大鼠进行三天 的运动跑台适应( 速度为1 0 m m i n _ 1 ，时间为1 0 m i n d 一，坡度为0 。) 后休息两天，第6 天进行正式实验。正式实验时，跑台坡度为1 0 。， 运动强度依据b e d f b r d f 3 】所建立的运动负荷模型，中等强度运动组以 1 9 3m m i n 1 ( 相当于7 6 b 2 m 。) 的速度运动至力竭，大强度运动组 以2 6 8m m i n - 1 ( 相当于9 2 3 讥z n l 。) 的速度运动至力竭。运动时使 用声音刺激及小木棍刺激动物尾部，必要时采用一定的电刺激，使动 物保持在跑道前1 3 处，以保证运动强度。 2 1 3 力竭标准 到运动末期，动物未能坚持原跑速，先后滞留跑道后1 3 处达3 次以上，刺激驱赶无效，停跑后体征表现为呼吸急促，神情倦怠，腹 卧位，对刺激反应迟钝。 2 2 实验仪器与试剂 2 2 1 仪器 ( 1 ) j e m l 2 3 0 透射电子显微镜日本电子公司 ( 2 ) 8 2 0 轮转组织切片机美国a 0 公司 ( 3 ) n i k o ne 6 0 0 显微照相图像采集系统日本尼康公司 ( 4 ) 7 2 2 型光栅分光光度计上海第三分析仪器 ( 5 ) p t 跑台浙江省杭州立泰科技有限公司 ( 6 ) a e 2 6 0 s 电子分析天平梅特勒托利多仪器( 上海) 有限 公司 ( 7 ) s h h w 2 1 6 0 0 型三用电热恒温水箱天津市莱斯特仪 器有限公司 ( 8 ) h h b s t _ 1 a 型恒温培养箱长沙医疗器械厂 ( 9 ) m l l 6 c 台式高速离心机湖南星科科学仪器有限公司 ( 1 0 ) s k 1 快速混匀器江苏中大仪器厂 2 2 2 试剂 ( 1 ) 原位末端标记细胞凋亡检测试剂盒：产自德国i 强d 公 司，购于深圳晶美生物工程有限公司； ( 2 ) s 0 d ，m d a ，蛋白定量，c a 2 + 试剂盒皆购于南京建成 生物工程有限公司； ( 3 ) 甲醇，无水乙醇，冰醋酸，3 0 h 2 0 2 ，二甲苯，磷酸 氢二钠，氯化钠，磷酸二氢钾，h c l 等分析纯分别产自上海化 学试剂厂及湖南师范大学化学试剂厂。生理盐水产自湖南科伦制 药。 2 3 标本制备 2 3 1 血清制备：大鼠断头颈部取血3 m l ，室温静置1 小时后， 以3 5 0 0r - 1 1 1 i n 1 离心1 0 i n i n ，取上清液即血清。 2 3 2 组织取样：对照组和运动组大鼠分别于安静状态和运动后 即刻断头处死，取后肢胫骨前肌和比目鱼肌，左后肢样本上部用于电 镜观察，下部投入3 7 的福尔马林缓冲固定液中固定禾8 h 后进行常 规石蜡包埋。取右后肢样本0 2 9 左右，剪碎后按1 ：9 的比例加入9 的冰生理盐水，用玻璃匀浆器在冰水浴中进行匀浆，匀浆液 3 0 0 0 r m i n 1 离心1 嘶i n ，提取上清液，即为1 0 的组织匀浆液。 2 4 指标检测 2 4 1 细胞凋亡检测 2 4 1 1 原位末端标记 采用- r u n e l 法进行细胞凋亡检测，标记物和显示系统为链卵白 素( s t r 印t a v i d i n ) 标记的辣根过氧化物酶( h r p ) 和显色底物d a b ， 正常细胞核由甲基绿复染。5um 厚的石蜡肌肉组织横切片常规脱蜡、 水合后按照试剂盒说明书进行染色，参照制造商的说明书，用双蒸水 代替t d t 酶，同法制备阴性对照组切片，然后染色，在普通光学显 微镜下，可以看到凋亡细胞核呈棕色或棕褐色着染，细胞核形态不规 整，大小不一致。而正常非凋亡细胞和阴性对照细胞核被甲基绿复染 成绿色，核相对较大，形态大小较为一致。t u n e l 标记切片用n j k 叩 e 6 0 0 显微照相图像采集系统进行照相。 2 4 1 2 电镜观察 组织取材后，立刻投入2 5 的冰戊二醛中固定2 h 以上，磷酸缓 冲液清洗后在1 的锇酸溶液中固定1 h ，然后按常规电镜样本制备方 法脱水、渗透、包埋、超薄切片，在透射电子显微镜下观察肌细胞核 及线粒体等细胞器的形态变化。 2 4 2 砸染色 5 | lm 厚的石蜡肌肉组织横切片常规脱蜡、水合后用h e 染色法 度组织蛋自食量 血清的m d a 含量( 衄o l m l - 1 ) = ( 测定管吸光度一测定空白管 蔽光度) ( 标准管吸光度一标准密自管吸光度) x 标准晶浓度 2 4 。6 组织线粒体c a 2 + 测定 钙离子在碱性溶液中与甲基百熙香酚蓝( m t b ) 相结合，生成蓝 色络合物，透避跑色与弱样簸理懿锈标准遴行毙较，毒计算逡钙麓含 量。取1 0 的组织匀浆液o 2 m 1 以8 0 0 0 1 0 0 0 0 r m i n - 1 离心1 5 分钟， 弃上清，取沉淀加入冰生理盐水，弗l 成线粒体悬液。计簿公式为： 钙( 越趱o l 韶f o l 1 ) = 测宠管吸光度对照管吸光度2 。5 m 璐0 1 l _ 1 蛋白含量( 窖u 1 ) 2 5 统计学分析 盘清、骨髓肌组织s o d 活性和m d a 含量以及线粒体c a 2 + 含量 络果以均数标准差裘示。组间差辨采用方差分析法，并使用酣凯法 ( 抛虹y ) 遴嚣多重毙较，显著性承乎为p o 。0 5 。所有数据均使用 s p s s l 0 o f o r w j n d o w s 软件进行分析，用e x c e l 软件作图。 3 实验结果 3 1 大鼠运动情况 运动组的2 0 只大鼠都较好缝完成了运动，熬个运动过程中基本 来出现掇跑熬现象，中等强度运动组的力竭运动时阀为2 3 4 6 6 0 0 5 m i n ，大强度运动组的力竭运动时间为9 2 4 士3 4 6 1 n 洫。 3 。2 骨骼艉细胞满亡及缝缀学改变 3 2 。l 虱烈驵阳性标记细胞核结果 细胞凋亡时，d n a 双键断裂或只要一条链上出现缺口而产生的 一系列玲n 矗酶3 o 嚣宋藕，就哥褒聪下静捧翅一f 。耨麟氧核糖核营 酸和h r p 形成的衍生物标记刹d n a 的3 末端，该物质与d a b 发生 显色反应，使援亡豹缨臆核呈现浅棕色，薤正常的缨魏核会被甲基绿 复染为绿色( 见附录图1 ) 。使用t u n e l 法对凋亡细胞核进行标记， 结采发现在安静获态下，羟骨静| l f l 与眈酱鱼飘中都来检测到删l 阳染细胞核：中等强度力竭运动詹即刻，有6 只大鼠的比目照肌中融 现了散在的h 烈e l 阳染细胞核，胫骨前肌中未发现；太强度力竭运 动蜃鬻蘩魄罄鱼飘襄胫嚣蘸鼹枣捡测到纲腹壤亡懿丈鬣都舞2 只。中 等强度比目鱼肌的细胞凋亡阳性率高于其它组( 见表+ 1 ) 。 表l 不同强度运动对大鼠脆骨前肌和比目鱼肌细胞凋亡的影响 ( 瓢，n e l 鞭凝倒数曲 测捌数) t a b klt k 漱莲除糟撼如耙麟t y o f e 聪埘o 珏黼扣哦l c l 嚣ia p 。p l i 。s i s 抽s o l e l 裕a 娃娃b 叠l 主s a 枷e f i o f 3 2 ，2融镜观察结栗 在邀镜下蕊察飙纤维的超微缝构，黧点蕊察细胞核及线粒体的变 化。难常肌细胞核为长椭圆形，含有弥散的染色质，熟位置紧靠质膜 下，擞据电镜鬣察到质膜下缁胞棱懑瑶独特的蠲亡特征，藏可菝确定 为肌细胞核凋亡。凋亡肌绷胞核呈现出不规则的形状，高度擞缩的染 色质沿核膜内表面分布，丽凋亡细胞核所在的肌纤维疑有正常的超微 结构。飘纤维骥完整，线粒毒誊完好无损。在安静鼹照缀的大鬣骨髂瓿 中未见到具有凋亡特征的肌细胞核，而在运动组的大鼠骨骼肌中，观 察到了这种艇有嘲鬣凋亡特征的细胞核( 冤圈1 ) 。 阁1 大鼠正常和凋亡骨骼肌细胞核电镜形态 鞘鼬f el 嚣l e c l f 0 8 糠渤掣嚣辩o f a p 0 群。l 耙8 f 惑抽。翔篮l 埘弦n 醛穗辔b 融蠢蘸撇鲥器。f 精捃 a ；正常肌细胞核摄椭圆形，染色质弥散均匀分布，1 5 0 0 0 ； b ；凋亡肌细胞核染色质在核内膜边缘凝集，并开始碎裂，1 5 0 0 0 ： e ：凋亡簸缁貔核染色痿在该肉簇建缭凝集，形状交褥誉撬嚣，1 5 鼢： d ：凋亡肌细胞核染色质在横内膜边缘凝集，1 5 0 0 0 。 3 2 3h e 染色结果 对虢组织横切片遴行确l 染色斡结巢发王燕，安静对照缰大鬣的骨 髂肌纤维排列整齐，纹理清晰。但经过一次力竭运动后，中等强度组 和大强度组的比目鱼肌和胫骨前肌都出现了不简程度的肌纤维间隙 增宽、肌纤维排列不规则的情况( 见附录图2 ) 。 3 3 快、慢肌及血清s o d 活性 安黪状态下。太鬣毙曩鱼腿的s 0 d 滔性裹予羟骨前瓿，毽差异 并不显著。经过不同强度运动后，两种组织的s o d 活性都增加了， 键只有跑蛋鱼腿的s 0 d 活性在一次孛等强度力竭运动詹，罐趣了 表3 不同强度遮动对大鼠血清s o d 活性的黪响 登篷i ：；黧! 堡垒蹩! ! 墨! 唆壁竺兰! ! 型兰黧翌至! 壁! 兰! ：垫! ! 竺茎：篓i o 寻 台 ； = 薯 盛 岛 j ， c 鬻3 不黼强度运动对大鬣血清s o d 活往静影晌 f i 9 3 t 吣e 蝈f e d so fd i 他r e l i m 黜画y e 黼r d s e o n s o da c h “t y i n f u m o f f a i s 3 4 快、慢飘及盔清m 酣含鬟 安静状态时，胫骨前肌和比目鱼肌中的m d a 含量基本相网。一 次中等强度力竭运动后，膝骨前肌的m d a 含量院安静维增加了 1 1 2 ，差异非常显著( p 0 0 1 ) ，疑：弱鱼觏增长了8 8 ，差异显著 ( p 0 0 5 ) 。一次大强度力竭运动后，胫骨前肌的m d a 含量比安静组 增加了镉，麓异显蔫( “蛰菸) ，褥魄譬焦飘增长了l 鹪，差巽棼 常显著( p o 0 1 ) 。但同一运动组比网鱼肌和胫骨前肌m d a 含量的差 髯并没商显著意义，不同强度运动组之间的差异也不鬃备显著意义 ( 见表4 ，图4 ) 。 袭4 不阉强度运动对夫鬣臀髓觚m 玲a 含量静澎酶 1 塑! ! 。! 兰! 氅曼! 壁查黧竺竺磐! ! 盟：蜊兰竺型竺唑磐垫! 望堡燃! ! 鲤! 悠：! ! ! 删黼 胫骨= 德善 蚕喜姗蝴蚕圣鼢咖黜渤。 0 。3 o 2 5 o 2 o 1 5 o 1 o 0 5 o c髓he 圜 图4 不同强度运动对犬鼠骨骼肌m d a 含爱的影响 嚣9 4t k # 瓣o f 蠛豫斑i 瓣蝴馥y 斛嘲峨辩。聩期n a 。o 哦翱l 趣矗砖e t t l 盥晒如o f 稳据 中等强度运动和大强度运动后即刻舡清的m d a 含量与发静组相 魄分掰下降了饕帮2 4 ，差算嚣常显落，不隧强度缝阀麓麓异苓鬣 著( 见表5 ，图5 ) 。 表5 不同强度运动对大氯血清m n a 含蠹的影响 如娅5 髓e e 粼s o fd i | 融e 撼姐蹦啦锚目d 辩雌洒a 删执靶m 越o | 鹏 c 墼5 苓羁强发运动露天鬣盘瀵氧 a 含爨翡彭璃 f i g 5t ke 位d so f d i 脑r e m 白呲e i t yc x 眈d o nm n a c o m 伽ti n 辩r u o f 船f s 1 1 一苫h曩乓_to矾)p器苫o垦 如勰嬲m o 一【_【o星一蔷暑o。口墨 3 5 快、幔舰线粒体e a 2 + 含量 安静状态时，比目鱼肌线粒体中的钙离子含餐略高于胫骨前肌， 讴其差舞不其霄统计学意义。在一次中等强度力鳎性运动后，魄强鱼 肌线粒体锈含爨增长了5 3 锡，与对照组棚比有鼠落差异( p 轨0 5 ) ， 筋同组麟骨前肌线粒体钙离子含量相比，差异显著( p o 0 5 ) ，同时 穗箍著离子大强度运动缱磁嚣鱼麟线粒髂豹锈离子含鬈。在大强发力 竭运动膳，比圈鱼肌线粒体钙含量只有轻微的增加，与对照组棚比差 肄不显著。雨脆骨前胍线粒体率静锈含量缀过中等强度或丈强艨盼力 竭运动籍，都只有少量豹增翔，没肖显薯意义( 煲庆6 ，圈6 ) 。 袁艿不彝强琰运动对犬嚣夤嚣航线鞍体貔“窘蘩鹩彭嫡 t 拍l e6 弧ee 戤l so f d i 彘删艟i n h 商t ye x e i c i s eo n 血t o c b 0 蝴越c 礓知i ns 妇l e 城n m s c 酶f 如 e 圈6 不丽皴运囊辩太鬣器鹩翳线羧搭镪“禽爨懿影骥 f 弛6 1 e 舱c t so fd i 船n t i n t e n s i i y e x e 托i s e 0 啦蕊妣h o n d l i a l o 拂i n s k e k 埘舭媾d e o f r 黛t s 蛳躺瓣撼s o 一苫-盆v【ouu)兰。暑8 +n时u一对州h叼岳。盎oop叫茸 4 讨论 4 1 逶动对夭鼠嚣骼曩琵纲脆凋亡豹影晌 早期的研究已经证实在哺乳动物的肌肉发育过程中，细胞凋亡是 调节骁纤维数耄和形态的主要茵素，雨近来大量的研究关注予成j l 琵l 纤 维的凋亡情况，人们已经发现在某些刺激因素的作用下，如肌营养不 良、缺m 荐灌注、去神经肌萎缩、废用性肌肉萎缩及慢性心力寰竭等 情况下，骨骼魏缨胞会出现凋亡【4 恻。一些磺究也发现运动过糕孛伴 随着骨骼肌细胞凋亡降1 5 】。b 0 f f i 等对纯种马进行了三个月的跑台训 练，在肌肉活梭串，使耀t u n e l 法；辩d n a 琼膳糖凝羧电泳，谴们 发现运动训练组的肌细胞凋亡显著性高于对照组( 氏o 0 0 1 ) ，并推测 正是新生的更熟生命力的细胞不断代替凋它的异常肌细胞这一过程， 燕诩练是致落栽增长黪机制。恧趣轴l 对大鼠麴谬 究发现，运动后霹 刻和运动后4 8 小时对大鼠肌肉进行活检，其肌细胞凋亡率都显著高 予写# 运动缝( p o 0 5 ) 。金其贺对大鬣透往8 两的慢性力竭性诩练， 发现经过8 周龅运动训练后，力竭训练组中，大鼠骨骼肌组织书发现 有散在的凋亡臂骼肌细胞，丽l 小时训练组和对照组束发现细胞凋 亡，置力竭灏练缝丈鼠发生纲臆凋亡的靼熬率显蔫离子l 小对调练组 和对照组。m p o d h o r s k a 0 k o l o w 等发现成年小鼠经过1 2 小时的钢笼 肉自发憨后，运动后辩粼缨燕核弼亡率最离，6 夺辩后穗徽育廓下海， 9 6 小时后凋亡攀大幅度下降，同时在停跑后的前期和后期，电镜观 察显示卫星细胞出现细胞凋亡，但数量较少且秃统计学意义。b i m l 的研究认为正常腿肉褒裹心运动孛的过度披 串，会使一些腿缨臌膜蛋 白的丢失，这会导致骨骼肌细胞凋亡或坏死。s a n 嫩i 等的研究结粜显 示，m d x 小葳在经过爨发运动后，脊骼茬蓬缁施穗亡增加。 本研究发现，未进行运动的大鼠骨骼肌中没有凋亡的细胞核，而 进行一次c i 笛强度力竭运动聪，6 只大鼠的比哥鱼肌 b 觋了散在分布 豹啜烈嚣l 引染鳇纲胞核，疑骨前撑l 孛未检测到璃亡纲臌核。恧大强 奏攀露猕彳囊静隧氢鹾剌引麴翱；霎萋i 抹薷尊骈茗羹弹怒耙正蓉本研究 蠢鍪塞蝈诫强“i 焉擎i i ；叁融鲋稀酋；蕊笺羔i 岔管辖骊窜翥诱导匕臼萝韶 黝酯雾塞羹当蓉j 非懿副； 毒- 了篾糯潍器饪棒臻。蜀羹蘧晦埔醺弦鞠她鞠翼鍪副誉藕翔斟戮 薹蠹誊两谰睡国终蚕：薹警霍蟊撼耩罂鬓囊副篓訾剥薹i 蠡挣弛蚕善瞄 垒裂墼寨誊鬲i 创并引撕引雾蠕南甬蓄犁篙秘e 髫雪耋引。麴雾塞鎏 囊萤副郭e 荫雨程蚰蔷督蓄i 亓：】攀窭塞霈姥眩目裙趁塑蝤篱j | | i i 在长蠡萋 需羹攀孽羹手吾蟊再j 霪蓉器钟羹薹霉薹篓苎：葫篓夔裴碲翻霜掣 萋萋挂明臻螨掳薹瑟嘉謦肇曼篓徭挂龠釜首委璧鸳譬i 蔼 | - 晏玛美 臻竖垂蓍穗礤博i 。戮霎竖霜绷拨萋墼档鬈纠蹦臻臻祷揭墟蔼； l l ；。懿 霎榭矍霪掳攀停奎錾可例茎誊囊髦需目毫罐嘱嚆孺嵩像；氪f 静毛 灞蕊币奏垂羹薹酆鞋融拳“戥雕镛利鎏蚕蚕鲥：秀一争烈基孽e 霎量 薹旃奔算集对凋誊硫藏陵囊：蠹驻冀羹霎圆睡绻蟀羹；输一脯砌埽 瓒姜誊耋摧甥暂睦强浦鏊均氇魂糖，强莲霎i ；i i 湛蹭川麴蔷瞠瞪喂鲤 咄哩瑾塑哩赛囊茔蠡鐾擢懋渤；削鄯戥冁掣孳猷酗静酗蛔曰蠹羹攀汐 吲夏羹希粪蘑m 黼i 翳趵两睡蝤伸陇瞄墓i 蠢答萼型赢囊雾篓蓁翠仝 g 事霪堡鋈谨馒博哦嗣篓霎豢；丽鞘制甾冀蒌辛蠢鬟露篓耄掴藩眵 量创雾罐w 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是对运动后不周类型肌纤维脂质过氧化水平的差异的研究结槊不尽 相同，有些研究诀为不同类毯之阔没有蓑异，有麓螽l 认爻运动愆快腿 纤维的艟质过裁化水乎惑子幔腿。面有关运动后骨骼肌s o d 活性改 变的研究结果差异就更大了，有的研究认为一次力竭逛动对骨骼肌 s 0 d 活性的影响差异并不显著【3 删，有些研究认为运动会导致骨骼肌 s o d 活性下降【蚺蜩8 j ，另外一些研究( 邶娼柏j 则认为急性运动后即刻骨 骼肌s o d 活性会上升。 我们的研究结果发现，中等强度运动和大强度运动后即刻骨骼肌 s o d 活性都增加了，中等强度运动时比目鱼肌中的s o d 活性显著地 高于胫骨前肌，大强度运动中两块肌肉间的差异并不明显。而s 0 d 的催化活性在很大范围内随超氧负离子的浓度增加而增强【4 1 】，这表明 中等强度力竭运动中，慢肌产生了更多的自由基，而m d a 含量则表 明中等强度胫骨前肌的脂质过氧化水平高于比目鱼肌( 虽然在统计上 并无显著差异) ，这说明慢肌对氧自由基的防御机制要强予快肌。而 中等强度运动后肌肉中的s 0 d 活性要高于大强度运动，尤其是比目 鱼肌中的s o d 活性显著地高于大强度运动组，这一方面可能是因为 中等强度运动时间持续时间长，产生的自由基水平更高，另一方面可 能s o d 活性的增长有一定的延时性。吉力力1 4 2 】等人也认为运动持续 长时会有更高的s o d 激活率。本研究反映中等强度运动组的比目鱼 肌自由基水平最高，其细胞凋亡率也最大，因此自由基水平与细胞凋 亡之间可能存在着密切的关系。而血清的s 0 d 活性和m d a 含量与 骨骼肌组织呈现出相反的变化，其原因不甚清楚。 4 3 线粒体c a 2 + 含量与骨骼肌细胞凋亡的关系 q 2 + 被认为在收缩、分泌、受精、增殖和代谢等许多重要细胞功 能中起着信号传导的作用【4 3 】，胞内c a 2 + 浓度的变化会引发各种生理、 病理活动出现，而c a 舢- 浓度的稳态是细胞保持正常功能的必要条件。 众所周 芏钡脑习 萎雾鲤蹦拦螋疆强疆眭嚼朔型三鐾经i毋珈|蓁薹幅jfli隧汤【陪毓 耋囊阚霾搬留培薹耄赶：副鞫姗蓬翻羹培j甬衙臻的ca2+大量释放出 来，扩散到肌浆中，使得肌浆caz+浓度迅速上升增加约loo倍， s 0 d 活性的影响差异并不显著【3 删，有些研究认为运动会导致骨骼肌 s o d 活性下降【蚺蜩8 j ，另外一些研究( 邶娼柏j 则认为急性运动后即刻骨 骼肌s o d 活性会上升。 我们的研究结果发现，中等强度运动和大强度运动后即刻骨骼肌 s o d 活性都增加了，中等强度运动时比目鱼肌中的s o d 活性显著地 高于胫骨前肌，大强度运动中两块肌肉间的差异并不明显。而s 0 d 的催化活性在很大范围内随超氧负离子的浓度增加而增强【4 1 】，这表明 中等强度力竭运动中，慢肌产生了更多的自由基，而m d a 含量则表 明中等强度胫骨前肌的脂质过氧化水平高于比目鱼肌( 虽然在统计上 并无显著差异) ，这说明慢肌对氧自由基的防御机制要强予快肌。而 中等强度运动后肌肉中的s 0 d 活性要高于大强度运动，尤其是比目 鱼肌中的s o d 活性显著地高于大强度运动组，这一方面可能是因为 中等强度运动时间持续时间长，产生的自由基水平更高，另一方面可 能s o d 活性的增长有一定的延时性。吉力力1 4 2 】等人也认为运动持续 长时会有更高的s o d 激活率。本研究反映中等强度运动组的比目鱼 肌自由基水平最高，其细胞凋亡率也最大，因此自由基水平与细胞凋 亡之间可能存在着密切的关系。而血清的s 0 d 活性和m d a 含量与 骨骼肌组织呈现出相反的变化，其原因不甚清楚。 4 3 线粒体c a 2 + 含量与骨骼肌细胞凋亡的关系 q 2 + 被认为在收缩、分泌、受精、增殖和代谢等许多重要细胞功 能中起着信号传导的作用【4 3 】，胞内c a 2 + 浓度的变化会引发各种生理、 病理活动出现，而c a 舢- 浓度的稳态是细胞保持正常功能的必要条件。 众所周知在肌肉收缩的过程中，肌浆网对胞浆c a 2 + 浓度的调节起着关 键作用，当神经冲动传导到肌纤维上时，肌浆网内贮存的c a 2 + 大量释 放出来，扩散到肌浆中，使得肌浆c a z + 浓度迅速上升增加约l o o 倍， 随后触发肌肉收缩，当刺激终止时，肌浆网上的钙泵作用加强，不断 将肌浆中的c a 2 + 回收到肌浆网中，肌浆中的c a 2 + 浓度下降，肌丝构型 发生交化，腿凌蟹张。嚣线粒体是纲胞重要的呼吸器宦，它除了具有 氧化代谢、生成体内需要的衄t 外，也媳有摄取、释放、调节胞浆 魏2 + 浓艘的佟照。当莠篷细慈受裁激兴奋时，胞浆q 嗽度瞬时增攘， 在刺激细胞产生各种生理效巍后，增加的部分主要被肌浆网摄墩，或 通过细胞膜上的c 泵转运至细胞外以维持细胞正常的胞浆渤“浓 度，当浆些骧因造残缎毙c a 2 + 内流增多或终滚减少、胞浆c a “浓度持 续性增加时，线粒体主动摄c a 2 + ，并以磷酸盐的形式贮存于线粒体， 缓冲胞浆c a 孙浓度的过分增船，线粒体掇锈除缓冲胞浆浓度增加戮 夕卜，自身的氧化代谢也发生变化，线粒体钙聚积，通过抑制氧化磷酸 化过程，减少舢限生成，进而造成细胞钙代谢紊乱。d a v i d l 瓤l 对蜥 甥的运动神经终扳进行电刺激，使耀荧光染色法来溅定腿痰胞浆和线 粒体基质内的c a 2 + 含遵，发现当电刺激增长到一定幅度后，胞浆内的 c a 岭爨稳定程一个平台，箍这种稳定状态是由子线粒俸摄镊作用造 成的，缎是无论采取多高电位的刺激或改变刺激的形式，在线粒体持 续摄钙的过程中，线粒体基餍内的仇2 + 含麓从未超出过l m 的较高 水乎。焱裁激停止屡，线粒体基矮的c a 2 + 水平会较长时闽地( 1 0 m i n 左右) 维持在最初的较高水平上，之后才恢复到基础水平。这种平台 翔帮延逡可麓楚由于冒遂熬形成不溶蛙钙薤的孤因造成酶。这种视裁 允许线粒体摄取大量的钙，但是线粒体基质内的c 一含量可以维持在 足以保证线粒体钙依赖性的脱氢酶的活性，僵却低于逶透性转换孔的 激活瘩乎。因菇线粒体钙含爨在一定程度上可反跌胞浆c 娃2 + 浓度豹变 化，所以本研究对运动后大鼠线粒体c a 2 + 浓度改变进行了测定，观察 线粒钵摄钙箨糯在运动诱导懿绥臆凋亡过程中髫起露终耀。 本研究发现，经过急性力竭运动后，大鼠快慢肌线粒体的c a 2 + 浓度都上升了，其中中等强度力竭运动膝眈目惫臃( 漫就) 线粒体 q l 函浓度增加最多，舆骞显著意义，网时我们观察到中等强度力运运 动后比豳鱼肌中骨骼肌细胞发生凋亡的比例也是最高的，这似乎表明 线粒体聚钙与细胞凋亡之间存在饕某静联系。已经有大量的磷究速实 细胞内钙失衡是启动细胞凋亡的关键因素，但是关于细胞内c a 2 + 浓度 发垒慧样静交纯时才会痿动缨瑰漩亡鹣瓣遂，帮出现了不同鲸骚究维 果，大多数研究认为细胞内钙离子浓度的升高会启动细胞凋亡，也有 研究发现在莱些情况下细胞内钙离子浓度升离可抻潮细胞凋亡，p a n 等1 4 5 1 鲍研究则发现细胞内钙存贮的耗竭是导致细胞死亡的原因。蕊 对于线粒体的摄钙作用在细胞凋亡过程中所起的作用的研究很少。 澄经有犬量磺究证实，线粒体是纲魏内重要的q 2 + 贮存痒，线粒 体钙含量随胞浆c a 舢浓度的改变发生改变。而关于运动后骨骼肌线粒 体聚钙的研究并不很多，融从弧t c f 啊首次发现犬鼠力灞运动后骨骼瓶 线歉髂钙离子含量最著增加后，人们开始关注线粒钵摄钙对运动过程 中肌肉收缩功能的影响。田野【4 7 】的研究照示大鼠力竭性与非力竭性跑 台运溪嚣线粒体钙含量最著穗麓，覆显它运动矮熬交健特征与疲劳憋 发展过程极为相似，因此认为运动后线粒体聚钙可能与疲劳的发展密 切褶关。s e m b f o w i 拍盼研究f 4 s 】发现慢_ | l 惩线粒俸的摄锈髓力大子快飘， g i l l i s f 4 9 1 的研究则发现使用强有力的线粒体摄钙抑制荆不会减慢快腿 舒张的速度，但却会大大减慢慢肌的舒张速度，因此认为慢肌的线粒 俸摄锈 # 耀在腿肉箭张熬过程中起羞更积投熬作曩。褥本磷究选进一 步证嶷了慢肌的摄钙能力要强于快肌。 由蓠入的研究成采数及本研究酶结梁可淡推出翔下假设：长时闻 豹力竭运动导致肌浆网c a 。瑚r p 酶活性下降，肌浆网摄钙速度减慢， 摄钙能力下降【s 2 】，细胞内钙离子浓度升高，而线粒体为了维持细胞内 歪攀瓣钙离子浓凌嚣摄钙作翔翔强，在戴方瑟熳飘线粒傣的摄钙纷耀 更为明显，锻初这种摄钙作用可以减缓胞内钙离子的急剧上升对细胞 所造成酶损伤，餐怒当线粒体钙离子过载时，会导致线粒体膜毫使降 低，m p t p 汗放，a 1 1 p 合成减少，导致细胞死亡。黼细胞内钙过爨 会通过过度活化蛋白激酶c ( p k c ) ，c a 2 + c a 调蛋白依赖的骚自激酶 5 结论 5 1急性力竭运动后，慢肌比快肌更易发生细胞捅亡，其中中等 强度运动毙大强度运动更易予导致馒规缨戆凋亡； 5 2不同强度急性力竭运动后，中等强度运动组大鼠慢肌产生的 鑫亩麓水平簸高，蠢由基水平霹能与细藤凋亡密切穗美； 5 3慢肌线粒体的摄钙能力强于快肌，中等强度力竭运动后慢肌 线粒体钙离子含量酸高，线粒体内q l 的大量积聚可髓激活了细胞撼 亡的震动程痔，这酉能是运动导致骨髅肌细胞凋亡的关键因素之一e 参考文献 i l 】b l 罾黼sd h ，s 、他n s m ，d a n d r e 囊to m 咖dk ，h a m m a r q l d 刚f o r r e n i i l ss c o t g l 黼v e 俄， h 毽拍a 蝗d 拱越础l s c l ee 努。黼 sa f c 磕3 踟哆t o 锣档撕b a 特e d # p e 豇出盘a 蕊v a 蛙。珏斌t 弦h 铀单a 辩s 鼍蝴l a 矗a 粉释1 n 霸i e a l hd i 癌醣1 9 辩f 3 ) 潞6 - 6 l 。 【2 l 邓树勋，泱泰田，曹志发主编运动生理攀【m 】北京：高等教育出版社1 9 9 9 ，7 融b e 蘸疆哇了毽1 职强c 醚，跏奎暖铆嚆咿袋& g i s o l 鑫c 毡撼糠蛐嫩嗍谬琏 蚰船u n 掣师no f 豫t s 粕di 拈c h a n 窖茚w 虹hv a r i o l l se x p e i i m o 霸l a lp f o c o 幽s j 却p lp h y x 【1 9 ln o b 亿y n 丸g o 幅bj 雎e d0 fa 娜t ee x e f d o nt h e 娥咖to 妊e es p h i n g a i 雎扭n d 印毯矗窖滞妇嚣遗如f e 拜ls b k 滋蕊l s c l e l y 降 赫糟l 。| 差o f m 酗酗l 乏e s 2 0 8 2 鲫；3 垂( 国5 2 3 母 f 2 0 jd - 料删一瑙蚍g 出e e ，m u 中h y 脚，h d l | 】ej d ，q 盯l 。yc mp c i c 瑚nc 九a c i v 张i e d t e l i i 艳 珏s 自n t o 舶s l o 摊m y o n 驵c l 妊f 埘坩出甜i ns 出砒c o f dt r a 挝辩醴e d4 搬de 】l c i s 树抬扛a mjp h 粥i m 1 粥雪& p 1 2 7 7 0p | 1 ) ：c s 8 9 卯 1 2 1 】方敏，王晓寐细胞捅亡的线粒体通路北京火学学报( 医学版) 0 姒) 2 ( 3 4 ) 2 ：1 - 7 1 2 2 l a 溉赣dk 氧轴珏bsr ，弧l 强姆r j ，轴yrr 嚣d g e 娃0 噩v r 。p l 矗s 重i c 主耋y 。f 孵。翻e l 镩 矗m b e fj n 矗删f 。p h 鼢d a n d a 的p 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