（发酵工程专业论文）绿色木霉内切葡聚糖酶高产菌株的诱变及组分Ⅱ基因的克隆表达.pdf

摘要 摘要 本研究以实验室保藏的一株酸性纤维素内切葡聚糖酶( e n d o 1 ，4 - 1 3 d g l u c a n a s e ，e g ) 产生菌绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) w l0 5 1 2 ( 酶活性2 4 1 1 1u g 干曲) 作为原始出发菌 株，通过自然分离筛选出一株产酶较稳定的”1 3 ( 酶活性2 5 6 5 0u g 干曲) 作为诱变 出发菌株，将t v n 1 3 菌株用真空微波和甲基磺酸乙酯( e t h y lm e t h a n e s u l f o h a t e ，e m s ) 逐级诱变处理，获得了一株高产、稳产内切葡聚糖酶的突变株e 6 6 。该菌株产内切葡聚 糖酶活性达4 6 5 9 1u g 干曲，是原始出发菌株w l0 5 1 2 酶活性的1 9 3 倍。通过对固态 发酵培养基的初步优化，使突变株的产酶能力提高了1 4 1 ，达到5 3 1 6 3u g 干曲。对 e 6 6 所产内切葡聚糖酶进行最适反应p h 和p h 稳定性实验，结果显示其为酸性酶。 根据g e n b a n k 报道的来源于木霉属的内切葡聚糖酶i i 基因序列的保守区域设计引 物，采用r t - p c r 方法扩增得到绿色木霉突变株e 6 6 和出发菌株t 、悄1 3 的内切葡聚糖 酶成熟肽基因e g i i 和曙刀的c d n a 序列，分别构建重组质粒p t g l 9 一t - e g i 和 p t g l 9 t - 曙仃，测序发现两序列同源性为1 0 0 。e g l i 全长11 9 4b p ，编码3 9 7 个氨基 酸，理论分子量为4 2 2k d a 。利用b l a s t 软件进行同源性分析，发现昭刀的氨基酸序列 同编码木霉属内切葡聚糖酶的氨基酸序列同源性最高达到9 4 ，将该基因序列提交 g e n b a n k 数据库( 登录号e f 6 0 2 0 3 6 ) 。 将内切葡聚糖酶曙口基因序列插入大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 表达载体p e t 一2 8 “+ ) 的n c oi 和h i n d i i i 酶切位点之间，得到重组质粒p e t 2 8 “+ ) e g 口，将该质粒分别转入 大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 和r o s e t t a ( d e 3 ) 中进行i p t g 诱导表达。s d s p a g e 分析显示，重 组菌b l 2 1 ( d e 3 ) e g 口胞内胞外均未无明显特异性蛋白条带；r o s e t t a ( d e 3 ) e g 乃胞内出现 分子量约为4 2k d a 特异性蛋白条带，且随着诱导时间的延长蛋白表达量增大，但很难 检测到内切葡聚糖酶活性。 将内切葡聚糖酶曙口基因序列插入毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 穿梭质粒p p i c 9 k 的 e c o ri 和n o ti 酶切位点之间，得到重组质粒p p i c 9 k e g 仃。将该质粒经n c oi 线性化 后电击转化入毕赤酵母g s l l 5 中。经甲醇诱导，内切葡聚糖酶在重组毕赤酵母中实现了 分泌表达，摇床水平上培养9 6h 酶活性达到1 5 4 8u m l ；胞内表达酶活性约为胞外的 十分之一。s d s p a g e 分析显示，胞外目的蛋白分子量为4 8k d a 左右，胞内目的蛋白 分子量则为4 2k d a 左右。酶学性质分析表明：该酶作用的最适p h 为4 5 ；p h3 5 6 0 范围内5 0 保温1h ，酶活性仍保留在8 0 以上；最适作用温度为5 0 ；5 5 以下酶的 稳定性较好。 关键词：绿色木霉内切葡聚糖酶诱变育种基因克隆异源表达 a b s t r a c t a b s t r a c t as t r a i nh i g h - y i e l d i n ga c i d i ce n d u g l u c a n a s e ( e g ) ，t r i c h o d e r m av i r i d e1 、悄一13 ( e n z y m e a c t i v i t y ：2 5 6 5 0u gd r yk o j i ) ，w a si s o l a t e db yn a t u r a ls e p a r a t i o nf r o mt h ep a r e n ts t r a i nw l 0 512 ( e n z y m ea c t i v i t y ：2 411 1u gd r yk o j i ) a f t e rm u t a g e n e s i sb yv a c u u mm i c r o w a v e i r r a d i a t i o na n de t h y lm e t h a n e s u l f o n a t e ，ah i g h e r - y i e l d i n ga c i d i ce n d u g l u c a n a s es t r a i ne 6 6 w a sg a i n e d t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs t r a i ne 6 6w a s4 6 5 9 1u gd r yk o j i ，w h i c hw a s1 9 3 t i m e so ft h a to fs t r a i nw l0 512 t h r o u g hp r e l i m i n a r yo p t i m i z a t i o no ft h ec u l t u r em e d i u mo f s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ( ss f ) ，t h ee n z y m ea c t i v i t yo fs t r a i ne 6 6i m p r o v e db y14 1 ，w h i c h w a s5 316 3u gd r yk o j i t h ee gp r o d u c e db ys t r a i ne 6 6w a sp r o v e dt ob ea l la c i d i ce n z y m e n l em a t u r ep e p t i d e se d n ae n c o d i n ge gi io fs t r a i n se 6 6a n dt v n 一1 3w e r ec l o n e d t h r o u g hr t - p c r , 诵mp r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n gt oc o n s e r v e ds e q u e n c e so fe g i ir e p o r t e d i ng e n b a n kd a t a b a s e t h e yw e r er e s p e c t i v e l yn a m e de gi ia n de g1 i ：t h e nr e c o m b i n a n t p l a s m i d sp t g l9 0 e g i ia n dp t g l9 玉吨gn w e r ec o n s t r u c t e df o rs e q u e n c i n g s e q u e n c i n g r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n d e m i t yo ft h et w os e q u e n c e sw a s10 0 t h eg e n ee gnh a dal e n g t h o f119 4b p ，a n dt h em o l e c u l a rw e i g h tw a s4 2 2k d a i te n c o d e dad e d u c e da m i n oa c i d s e q u e n c eo f3 9 7r e s i d u e s ，s h a r i n g9 4 i d e n t i t i e sw i t hg e n ee n c o d i n ge g i io ft r i c h o d e r m a s p r e p o r t e di ng e n b a n kd a t a b a s e 诋s e q u e n c ee gnh a sb e e na c c e s s e db yg e n b a n kd a t a b a s e ( a c c e s s i o nn o e f 6 0 2 0 3 6 ) s e q u e n c ee gl i w a si n s e r t e di n t op l a s m i dp e t - 2 8 敲qb e t w e e nm u l t i p l ec l o n i n gs i t e s h i n d l i ia n dn c oi r e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t - 2 8 a ( + ) - 昭仃w a se x p r e s s e di ne s c h e r i c h i a c o l is t r a i n sb l 2 1 ( d e 3 ) a n dr o s e t t a ( d e 3 ) i n d u c e db yi p t g r e s u l t so fs d s p a g es h o w e d t h a tt h e r ew a sn oe x t r a c e l l u l a ro ri n t r a c e l l u l a ro b j e c t i v ep r o t e i nf r o mr e c o m b i n a n ts t r a i n b l 21 ( d e 3 ) p 譬刀jb u ta t li n t r a c e l l u l a rs p e c i f i cp r o t e i nb a n da b o u t4 2k d af r o mr e c o m b i n a n t s t r a i nr o s e t t a ( d e 3 ) e g1 1 t h e r ew a sn oe n d u g l u c a n a s ea c t i v i t yd e t e c t e d s e q u e n c ee gnw a si n s e r t e di n t op l a s m i dp p i c 9 kb e t w e e nm u l t i p l ec l o n i n gs i t e s e c o ria n dn o ti r e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c 9 k - 曙口w a sl i n e a r i z e db yr e s t r i c t i o ne n z y m e n c oi ，a n dt r a n s f o r m e di n t op i c h i ap a s t o r ig s1 15b ye l e c t r o p o r a t i o n w i t hm e t h a n o l i n d u c t i o n , t h er e c o m b i n a n tp l a s m i de x p r e s s e de x t r a c e l l u l a r l ya n di n t r a c e l l u l a r l yi np p a s t o r i s t h ee x t r a c e l l u l a rp r o d u c t i o nh a da ne n d o g l u c a n a s ea c t i v i t yo f15 4 8u m li ns h a k ec u l t u r e w h i l et h ei n t r a c e l l u l a rw a so n et e n t ho ft h a t r e s u l t so fs d s - p a g es h o w e dt h ee x t r a c e l l u l a r s p e c i f i cp r o t e i nb a n da b o u t4 8k d aw h i l et h ei n t r a c e l l u l a ra b o u t4 2k d a t h eo p t i m u mp ha n d t e m p e r a t u r e o ft h er e c o m b i n a n te n z y m es e c r e t e d b yp p a s t o r i sw a s4 5 a n d5 0 。c ， r e s p e c t i v e l y n l ee n z y m ew a sq u i t es t a b l eb e t w e e np h3 5t o6 0 ，a n dt h er e l a t i v ea c t i v i t i e s w e r er e m a i n e do v e r8 0 i tw a sa l s os t a b l ea tt h et e m p e r a t u r eb e l o w5 5 。c ，a n dt h er e l a t i v e a c t i v i t i e sw e r er e m a i n e do v e r9 0 k e y w o r d s ：t r i c h o d e r m av i r i d e ；e n d u g l u c a n a s e ；m u t a g e n e s i s ；c l o n i n g ；h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机柏的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名：日期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进, f - i - g t 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且举人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 纤维素酶概况 纤维素酶是水解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的一组酶的总称，是由多种水解酶组 成的一个复杂酶系。自上个世纪初首次发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到 了国内外学者的极大关注，取得了很大的进展。目前己有许多国家在进行纤维素酶的研 究，其中美国、日本和德国等国发展比较快，以纤维素转化成糖为主要目标。 1 1 1 纤维素酶系的组成及作用机制 国内外学者根据纤维素酶的底物及作用的位点和释放的产物将其分为三类： ( 1 ) 内切p 葡聚糖酶( e n d o 一1 ，4 - 1 3 一d - g l u c a n a s e ，e c3 2 1 4 ) ，简称e g ，又称c m c 酶，这 类酶不能水解晶体纤维素如棉花和微晶纤维素等，而主要作用于非结晶纤维素和一些可 溶性的底物如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，随机地水解纤维素链内d - 葡萄糖苷键使其 粘度迅速下降及还原性基团增多，并产生葡萄糖、纤维二糖和各种不同大小的短链纤维 葡聚糖： ( 2 ) 纤维二糖水解酶( 1 ，4 - 1 3 一d - g l u c a n c e l l o b i o h y d r o l a s e 或e x o - 1 ，4 - 1 3 一d g l u e a n n a s e ，e c 3 2 1 9 1 ) ，简称c b h ，又称外切葡聚糖酶，可以水解无定型纤维素和微晶纤维素，对棉 花有很弱的作用，对羧甲基纤维素无作用，该酶每次从底物的非还原端切下一个纤维二 糖单位； ( 3 ) p 一葡萄糖苷酶( d d - g l u c o s i d a s e 或p - d g l u c o s i d e g l u c o h y d r o l a s e ，e c3 2 1 2 1 ) 简称b g ， 这类酶将纤维二糖水解为葡萄糖分子，也可以从短链纤维葡聚糖的非还原端切下葡萄 糖。 对纤维素降解机理的研究存在多种假说，尚无统一结论。由于天然纤维素的结构复 杂需多种纤维素酶协同作用才能高效降解，一般认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的 非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还 原端切下纤维二糖单位，d 葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位，形成葡萄糖【2 j ，作用机制 见图1 1 。另外，还有其他的观点认为天然纤维素首先在一种非水解性质的解链因子或 解氢键酶作用下，使纤维素链间和链内氢键打开，形成无序的非结晶纤维素，然后在三 种酶的协同作用下水解为纤维糊精和葡萄糖【3 1 。近年来，人们应用凝胶过滤、离子交换 层析、凝胶电泳以及等电聚集等生化分离分析手段，发现纤维素酶非常复杂，内切葡萄 糖酶、纤维二糖水解酶及d 葡萄糖苷酶均存在2 5 个同功酶，因此纤维素酶解机理还有待 进一步研究。 江南大学硕士学位论文 孓一乒覆蔷一 恤 ，一。、w 7 迄多 _ c h o _ ) ；琶a p 】- 一一 ) ”p 1 一_ 二p c ，口 h c 、， 竺擘二三 固 图1 - 1纤维素酶水解纤维素的作用机制 f i g 1 一i m e c h a n i s mo fc e l l u l a s ec a t a l y s e 1 1 2 纤维素酶的来源及性质 纤维素酶分布广泛，在许多微生物、植物及昆虫中都有它的存在。真菌、细菌、放 线菌等在一定条件下均可产生纤维素酶【4 】。近年来，随着人们对纤维素酶研究的深入， 发现纤维素酶不仅存在于微生物和植物中，某些动物也存在内源性纤维素酶【5 6 】。但是 细菌纤维素酶的产量较低，主要是葡聚糖内切酶，且大多数对结晶纤维素没有活性，所 产生酶是胞内酶或吸附在菌壁上，很少能分泌到细胞外，增加了提取纯化难度，因此在 工业上很少应用【7 j 。放线菌中研究较多的菌种有链霉属放线菌、玫瑰色放线菌、纤维放 线菌等，但由于放线菌产纤维素酶的能力较低，所以很少受到人们的重视 8 】。 大多数商业纤维素酶生产研究集中在真菌，己报道产纤维素酶的真菌包括里氏木霉 ( t r i c h o d e r m ar e e s e o 、绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 、康宁木霉( t r i c h o d e r m ak o n i n g i o 、黑 曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、斜卧青霉( p e n i c i l l i u md e c u m b e n s ) 、嗜热毛壳菌( c h a e t o m i u m t h e r m o p h i l e ) 和嗜热子囊菌( t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s ) 等【9 j ，最近国内有学者发现草菇 ( v o l v a r i e l l av o l v a c e a ) 也能大量生产纤维素耐1 0 】。丝状真菌木霉属是最重要的纤维素酶生 产菌，研究也最为广泛，其产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素 底物，故常用于饲用纤维素酶的生产 1 1 】。利用丝状真菌生产纤维素酶具有诸多优点：产 生纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；产酶效率高，产生纤维素酶的酶系结构较 为合理；可同时产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等【1 2 1 。从纤维素酶工业化制备及 其应用角度看，研究和采用丝状真菌产酶具有更大意义。 纤维素酶来源广泛，各来源的分子量差异也较大。真菌的内切酶和外切酶的分子量 一般在2 0k d a - 6 0k d a 2 _ 间，而细菌的内切酶分子量却高出1 0 0k d a ；3 - 葡萄糖苷酶的分 子量较大，均超过6 0k d a 。纤维素酶的各个组分大多是糖蛋白，含糖的比例很不相同， 纤维素酶的糖基化程度不同造成了纤维素酶的多态性。 丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，最适作 用p h 大多在p h 4 - 5 ，最适温度范围在4 0 6 0 c ，但某些d 葡萄糖苷酶的最适温度稍高，在 5 5 - 7 0 c ；纤维素酶各组分的热稳定性差别较大，一般内切酶热稳定性较好，外切酶和 p 一葡萄糖苷酶热稳定性较差 1 3 】。 2 第章绪沧 1 _ 1 2 纤堆素酶的分子结构与分类 1 9 8 6 年t i l b e u r g h 等用木瓜蛋白酶有限酶切里氏木霉的c b h1 分子得到两个独立的 结构域1 1 4j ：一个是具有催化功能的催化结构域( c a t a i y t i cd o m a i n ，c d ) ，另一个是具有结 合纤维素功能的纤维素结合结构域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 。图i - 2 为里氏木霉 c b hi 功能域结构示意图。c b d 在纤维素酶中位于氢基端或羧基端，它通过一段高度糖 基化的链接区( 1 i n k e r ) 与c d 相连。细菌纤维素酶的l i n k e r 富含p r o 和t h r ，真菌纤维素酶的 l i n k e r 富含g l y 、s e t 和t h r ；细菌纤维素酶的c b d 与c d 夹角为1 3 5 。，真菌为1 8 0 。；细菌纤 维素酶有两个酶切位点可将c b d 与l i n k e r 分别切去，而真菌纤维素酶一般只有一个酶切 位点可将c b d 与l i n k e r 一同切去【l “。t o m m e 等根据c b d 分子大小及氨基酸的相似性将己 知的c b d 分成了1 0 个家族。家族i 的c b d 包括3 3 4 0 个氨基酸残基，所有真菌的c b d 都 属于家族i ：家族i i 的c b d 包括9 5 1 0 8 个氨基酸残基，粪肥纤维单胞菌( c e l l u l o m o n a s f i m o 的c b d 都属于家族i i ；家族的c b d 位于那些能产生纤维小体的梭菌中【l “。真菌的c b d 序列和结构模型的分析表明，真菌c b d 的三维空间结构通常很相似。 图i - 2 里氏禾霉c b hi 功能区域结构示毒图 f i g1 2 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o n o f d o m a i ns t l u c t u eo f tr e e s e i c b hi 已报道在s w i s sp r o t e i n 数据库中有一百多个纤维素酶基因序列，根据这些序列的同 源性和疏水区分析，将这些序列分为1 1 个家族( 5 9 ，1 2 ，4 4 ，4 5 ，4 8 ，6 0 ，6 1 ) 【l ”。家族 5 是最大的一个纤维素家族，包含5 7 个基因，其中5 2 个编码内切纤维素酶，另外五个编 码外切葡聚糖酶，大部分家族5 的基因来源于细菌。分析家族5 蛋白的三维结构发现，均 包括一个“口桶折叠，但许多蛋白不具有纤维素结合域，所以不能降解晶体纤维素；家 族6 有9 个基因，包括来自真菌和细菌的内切和外切纤维素酶基因，研究了zr e e s e i 的 c b h i i 和褐色高温单孢菌( t h e r m o m o n o s p o r a f u s c a ) e g i i 蛋白的三维结构，它们均舍有一 个被修饰的“o - 桶折叠结构，而且二者均有两个l o o p 环覆盖在活性位点部位，使活性位 点呈袋状结构；家族7 仅包括真菌的内切和外切纤维素酶基因，其中研究了zr e e s e i 的 c b hi 的催化结构域，它的活性部位吉有一个特殊的b s a n d w i c h 结构，另外有很多环与b 折叠相连：家族8 有9 个基医，都来源于细菌的内切酶类，其中热纤梭菌( c l o s t r i d j u m t h e r m o c e l l u 呐的c e la 蛋白催化结构域的三维结构域比较清楚，活性部位含有一个( “b ) 。 结构。家族9 和家族4 8 与它有共同的结构域。其余几个家族只包含较少的基因，而且没 有得到相应的活性部位的三维结构，有待进一步研究，图1 - 3 为不同家族纤维素酶的催 化域三维分子模拟图。 江南大学硕学位论文 瓣舔酶鬻 盛椎：嘲。器盘6 愀川蹴w ， 黧舞镪 一箸3 “ “m 5 图l - 3 不同家族纤维素酶的催化域三堆分子模拟图 f i g 1 - 3 3r i b b o nr e p 化s e n t i o n o f t h e m a i n f o l d o f t h ec a t a l y t i cd o m a mo fc e u u l a s e 1 2 纤维素酶的研究进展 产酶菌株的选育、基因的克隆与表达、纤维素酶蛋白分子的结构与功能研究是纤维 素酶研究历程的三个发展阶段，是获得高产纤维素酶、提高酶活性和稳定性、降低生产 成本和解决纤维素酶工厂化规模生产所存在的问题有着十分有效的途径，本论文将从这 三方面进行综述。 1 2 1 产醇菌株的选育 2 0 世纪4 0 5 0 年代国内外研究者开始对产生纤维素酶的微生物进行了大量分离筛选 工作，建立起较为完整的分离筛选方法。国内外许多专家对产纤维素酶的微生物进行了 大量研究，取得了很大的进展。 从2 0 世纪7 0 年代开始，国内外纤维素酶生产菌株的诱变育种开始成为研究热潮。国 内前期诱变的微生物集中在丝状真菌类，以木霉属、青霉属、曲霉属居多，9 0 年代末出 现芽孢杆菌( b a c i l l u ss p ) 等细菌的研究。四川省生物研究所、山东大学、华中农业大学 和中国科学院微生物所等单位较早研究这方面内容。无锡轻工大学从2 0 世纪9 0 年代进行 纤维素酶生产菌的诱变育种研究，其中余晓斌、邬敏辰等学者研究较多。国内外诱变育 种相关报道如下： 7 0 、8 0 年代，m a n d e l s 等通过直线加速器处理绿色木霉q m 6 a ，获得了酶活性比出发 菌株高一倍的突变株q m 9 1 2 3 【i8 】：芬兰国立技术研究中心( v 1 将里氏木霉q m 9 4 1 4 通过 亚硝基胍和硫酸二乙酯诱变处理获得纤维素酶高产株v 兀：d 7 8 0 8 5 ，将其用t 射线辐照后 筛得菌株v t t - d 一7 7 1 2 4 【l9 ；m o n t c n e c o u r t 等利用代谢阻遏抑制分离到高产纤维素酶里氏 木霉突变株r u t 3 0 口o i ；国外学者以q m 6 a 为出发菌株诱变得到一系列高产菌，如 r 硼正7 ( 紫外诱变) 、r u i n g 1 “亚硝基胍她氆等 1 9 1 ；四川省生物研究所纤维素酶组通过 紫外和亚硝酸复合处理绿色木霉菌株2 8 5 诱发变异，得到典型突变株4 0 8 - 2 ，其c m c 酶活 性和滤纸酶活性均比亲本菌株提高3 倍m 1 ；曲音波等将斜卧青霉( p e n i c i l l i u md e c u m b e n s ) 1 1 4 2 经紫外和亚硝基胍诱变处理后，滤纸、c m c 和棉花酶活性分别提高到3 3m g m l h 、 2 3 4 r a g m e h 和8 6 r e # m e2 4 h 1 2 】；陆准通过对纤维素分解菌黑曲霉s u - ( 9 7 ) i 构l 诱变处理， 第一章绪论 筛选到n 9 7 5 4 号高产突变菌株，其c m c 酶活性比出发菌株高1 3 1 【2 3 】。 9 0 年代，王丹敏等将芽孢杆菌x 6 菌株经甲基磺酸乙酯和紫外线复会诱变，选育获 得一突变株e v 2 3 ，其所产生的c m c 酶活性由原来的o 8 4u m l 提高到3 5 3u m e 2 4 ；余 晓斌等从土壤中分离获得碱性纤维素酶产生菌嗜碱芽孢杆菌s h y 8 1 ，经紫外线、亚硝 基胍、甲基磺酸乙酯诱变及反复的自然分离和压力选择，获得高产变异株s h y 8 5 7 2 5 ， 产酶量由0 8 9 8u m l 提高到1 5 2 0u m l t 2 5 1 ；邬敏辰等以里氏木霉w x r 8 为出发菌株，经 紫外和亚硝基胍诱变处理后，得到一株抗纤维二糖阻遏突变株r m 2 7 ，滤纸酶活性提高 了6 4 5 【2 6 】；崔福绵等将康氏木霉c p 8 8 1 0 5 经加热和亚硝基胍处理后，获得一株高产突 变株c p 8 8 3 2 9 ，以c m c 酶活性为4 8 8 0u g 干曲，以脱脂棉为底物酶活性为4 8 0u g 干曲， 产酶活性水平均为出发菌株的3 倍【2 7 j 。 2 1 世纪初，邱雁临等通过紫外诱变和亚硝基胍处理将绿色木霉耐高温菌株的c m c 酶活性和f p a 酶活性提高到2 9 6u g 干曲和1 2 9 6u g 干曲【2 8 】；谷海先等将黑曲霉菌株5 6 3 经紫外诱变得至i j f v - 4 菌株，c m c 酶活性达至u 1 8 0 0u g 干曲【2 9 】；芦敬华等采用离子束注入 技术对中性纤维素酶产生菌特异腐质霉( h u m i c o l ai n s o l e n s ) h 3 1 2 3 进行诱变， 经发酵筛 选获得较高酶活性且传代稳定的正突变菌株h 1 4 ，制备其原生质体后进行紫外诱变，筛 选后得到正突变菌株h 1 4 2 2 ，最终c m c 酶活性、f p a 酶活性分别达8 2 5 6u m l 和5 7 7u m l ， 较原始菌株提高了7 8 5 7 和1 0 6 8 1 t 川j 。 1 2 2 纤维素酶基因的克隆与表达研究 由于利用纤维素酶的降解作用进行纤维素的生物转化有着广阔的前景。近年来，随 着生物技术的发展，人们已经从4 0 多种细菌和数种真菌中克隆得到百余个纤维素酶的基 因。由于丝状真菌木霉属能产生大量的胞外纤维素酶，酶系较完全，并且对结晶纤维素 有较好的酶解活性，国内外研究者来对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量的研究，其中 里氏木霉是研究最多的木霉。 国外自2 0 世纪7 0 年代末就开始了木霉属纤维素酶基因的克隆与表达，国内9 0 年代开 始进行真菌木霉属纤维素酶基因的克隆与表达研究，已从里氏木霉、绿色木霉和康宁木 霉等克隆和表达了十余个基因，其中有些基因已在大肠杆菌和酵母中得到了表达，由于 大肠杆菌中表达纤维素酶基因不易提取和表达水平低，目前应用较多的是酵母表达系 统。 ( 1 ) 内切葡聚糖酶基因的克隆与表达 木霉内切葡聚糖酶己知的有五种同功酶：e gi 、e g i i 、e g i 、e g 和e g v 。 p e n t t i l a 等克隆得到里氏木霉e gi 基因，有两个内含子，大小分别为7 0b p 和5 8b p ， 等电点约为4 7 ，分子量约为5 4k d a ，成熟肽由4 3 7 个氨基酸残基组成【3 l j ；p e n t t i l a 等将里 氏木霉中克隆得到的e gi 和e g i j _ i 的c d n a 序列在酿酒酵母中进行表达，得到了不同程度 的分泌【3 2 ；s h i y a r o n 等克隆到将里氏木霉e g m 的基因序列，成熟肽由2 3 4 个氨基酸残基 组成，将该基因转入大肠杆菌和酿酒酵母表达，发现大肠杆菌表达的重组蛋白量非常低 团】；s a l o h e i m o 等克隆得到里氏木霉e g i i i ( 现代学者将其归入e gi i ) 基因并测序，基因长 度为1 8 4 9b p ，有一个大小为1 1 2b p 的内含子，e g i i i 的等电点为4 8 5 6 ，分子量约为4 9 8 5 江南大学硕士学位论文 k d a ，成熟肽的e g i i i 由3 9 7 个氨基酸残基组成【3 4 】；乔宇等采用外显子拼接的方法克隆出 里氏木霉e gi i ( 即s a l o h e i m o 等克隆得到里氏木霉e g i i i ) 基因的全编码序列，将其在毕赤 酵母中得到分泌表达【j 5 j ；s a l o h e i m o 克隆得到里氏木霉e g v 基因并测序，基因长度为 11 2 4b p ，有两个内含子，大小分别为5 9b p 和6 1b p 【3 6 1 ；c h e n g 等分别对绿色木霉h k 7 5 中 编码e gi 的基因进行了克隆，发现其编码一个含4 6 4 个氨基酸的成熟肽，与里氏木霉 e gi 的基因有9 3 8 的同源性【3 7 】；k w o n 等将绿色木霉h k 7 5e gi 的基因进行大肠杆菌 异源表达，发现形成了不溶性的包涵体【3 引。 ( 2 ) 纤维二糖水解酶基因的克隆与表达 木霉纤维二糖水解酶己知有两种同功酶：c b hi 和c b hi i 。 t a k a s h i m a 等克隆了里氏木霉c b hi 的基因序列，全长2 2 2 0b p ，有两个内含子，大 小分别为6 5b p 和6 3b p ，成熟肽由4 0 0 个氨基酸残基组成【3 9 1 ；c h e n 等克隆了里氏木霉 c b hi i 的基因，长度为2 7 7 4b p ，等电点分别为5 9 ，分子量约为5 3k d a ，成熟肽由4 4 7 个 氨基酸残基组成【4 0 j ；王建荣等利用里氏木霉的基因序列同源片段做探针，构建了绿色木 霉基因文库，克隆了c b hi 、c b h i i 的基因，并对其基因结构进行了研究【4 l ，蚓；祝令 香等克隆并测定了康宁木霉k 8 0 1 纤维素酶c b hi i 的基因序列，发现与里氏木霉已知序列 的同源性达到9 9 8 9 4 列；w e y 等利用康宁木霉g 3 9 高产菌株克隆了纤维素酶c b hi 基 因，并对其序列进行了分析，发现它与里氏木霉c b hi 基因仅在非编码区有六个碱基的 差异，因而可以编码相同的c b hi 畔】；g o d b o l e 等将里氏木霉c b hi 在毕赤酵母中成功 地转化并表达，发现该表达系统对里氏木霉c b hi 的定向诱变并不理想【4 5 】。 ( 3 ) 葡萄糖糖苷酶基因的克隆与表达 木霉葡萄糖糖苷己知有两种同功酶：b gi 、b g i i 和b g 。 t a k a s h i m a 等从里氏木霉中克隆得到的b g i i 的基因，等电点为7 5 8 5 ，分子量为 7 0 8 0k d a ，成熟肽由7 1 4 个氨基酸残基组成，还克隆到它的类似物b g 的基因，两者 有7 3 1 的同源性，均可以在曲霉中得到表达m 】；m a t h 等从里氏木霉中克隆得到b gi 的基因序列，长度为2 1 7 1b p 47 】；张梁等采用外显子体外拼接的方法获得了里氏木霉b gi 的e d n a 序列，将其转入酿酒酵母进行表达，得到的转化子能以纤维二糖为唯一碳源生 长 4 引。 这些克隆与表达研究结果表明，木霉属中不同种间同一纤维素酶基因的序列具有相 当高的同源性。 1 2 3 纤维素酶的分子结构与功能研究 纤维素酶的分子结构见1 1 3 。许多研究表明，c b d 能提高纤维素酶对不溶性底物的 亲和力及酶活性，但它并不影响酶对可溶性底物的活性，并且它的去除不会导致基本酶 学性质的改变【4 9 5 0 5 1 1 。以前的研究焦点通常集中在c b d 与催化区对纤维素降解的协同 作用，而这两个结构域之间的连接及相互作用却是理解纤维素酶功能的一个关键问题5 2 ， 5 3 ，5 4 o 关- y c b d 是如何吸附到纤维素表面、吸附后c b d 是如何与催化区相互作用降解纤维 素的问题目前尚未作出合理解释，因为它涉及到纤维素聚合物解链、解聚等超分子结构 6 第一章绪论 的变化。这一问题的解决将会为新的纤维素酶蛋白分子的构建、经济利用纤维素打下基 础。 1 3 纤维素酶的应用 纤维素酶从被发现起就受到世界各国生物界的关注。现在纤维素酶的应用己扩展到 医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲 料等各个领域，其应用前景十分广阔，对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染 等问题具有十分重要的意义。 ( 1 ) 纤维素酶在食品工业上的应用 由于纤维素酶粗酶制剂一般含有半纤维素酶和果胶酶，因此可用于水果、蔬菜加工。 在无囊橘子罐头加工生产中，用纤维素酶处理可促进橘子脱囊衣：在果汁加工中可促进 果汁提取和澄清；在保鲜蔬菜加工中可加速脱水等；在速溶茶生产工艺中用纤维素酶处 理可缩短有效成分的抽提时间，提高速溶茶品位，又可提高其得率。另外，还可以用于 啤酒和白酒生产，提高出酒率，且酒的口感醇香，杂醇油含量低，用于酱油和食醋的酿 造及高营养、高品位饮料的生产等。近年来研究得最多的是1 3 葡萄糖苷酶在食品的风味 方面的应用【5 5 ，5 6 ，5 7 ，5 8 1 。由于1 3 葡萄糖苷酶能水解某些低p h 食品( 果酒、果汁等) 中的风 味物质的糖苷化合物并释放出这些风味物质，从而增强这些食品的风味，尤其是来源于 黑曲霉的d 葡萄糖苷酶，因为其表达菌的无毒而受到工业界的青睐【5 9 1 。 ( 2 ) 纤维素酶在畜牧养殖业中的应用 纤维素酶作为饲用添加剂，国外从2 0 世纪7 0 年代起较系统的用于饲料工业，我国近 1 0 年来也进行了开发性研究，取得了良好的效果。纤维素酶能够分解结构复杂的纤维素， 生成易消化物质葡萄糖，以便动物吸收，主要具有以下几方面效果【6 0 】：( 1 ) 补充动物内 源酶，在反刍动物中虽有一定的纤维素微生物，但毕竟有限，添加纤维素酶可提高动物 对粗纤维的利用率，改善动物消化道环境，使酸度增加，激活胃蛋白酶。( 2 ) 促进养分 的消化吸收。纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶协同作用可使细胞内容物溶解出来，淀粉 酶和蛋白酶进一步降解，提高养分的消化和非淀粉多糖的利用率。( 3 ) 消除抗营养因子。 果胶、半纤维素、d 葡聚糖和戊聚糖可部分溶于水中，产生粘性对内源酶而言是一种障 碍，添加纤维素酶可去除这一障碍，增加内源酶的扩散，提高酶与养分的接触面积，促 进饲料的良好消化。 大量的试验都证明了饲料中添加纤维素酶对猪、鸡、牛、羊、鱼等的饲喂效果十分 显著。在牛、羊、猪日粮中添加一定量的纤维素酶，可显著提高饲料的利用率、增加日 增重量、缩短育肥期、降低料肉比，同时可提高绵羊的产毛率和奶牛的产奶量，且牛奶 的乳脂率、乳蛋白、乳糖、乳中干物质略有提高或保持不变【6 l j ；同样，纤维素酶可显著 提高肉鸡、蛋鸡和肉鸭对饲料中干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和粗灰分的消化率， 并明显降低鸡鸭的死亡率和鸡蛋的破壳率【6 2 6 3 j 。 ( 3 ) 纤维素酶在洗涤中的应用畔，6 5 j 近年来，碱性纤维素酶在洗涤剂工业上的应用改变了传统的去污机制。碱性纤维素 7 江南大学硕士学位论文 酶是一种非全组分的内切葡萄糖苷酶，主要与棉纤维中仅占1 0 左右的非结晶区的纤维 素分子起作用，可选择性地吸附在棉纤维的非结晶区，使棉纤维膨松，水合纤维素分解， 胶状污垢脱落。酶洗工艺条件温和，耗能降低，减少了服装和设备的磨损，水洗效率高， 与传统的化学助剂整理工艺相比，酶洗工艺大大减少了污水排放，有利于环境保护。 ( 4 ) 纤维素酶在造纸工业上的应用【6 6 ，d 7 】 纤维素酶可以用于废纸脱墨、处理造纸废料和改善纸张性能等，能够提高脱墨率， 减少开支和环境污染并能改善纸张的印刷适性。 ( 5 ) 纤维素酶在纺织工业中的应用盼】 纺织品的天然纤维素纤维结构复杂，结晶度高，利用纤维素酶对纤维素纤维织物进 行生物整理后，可使纺织物膨松、柔软、表面光滑，毛羽、棉结明显地被清除，织物光 泽和色泽鲜艳度明显改善。 1 4 本论文的研究目的扣意义 纤维素是年产量巨大的可再生性资源，地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质 中，纤维素占了近一半。将这一年产量巨大的可再生性资源转化为人类急需的能源、食 物和化工原料，对于人类社会的可持续性发展具有非常重要的意义。目前纤维素酶对纤 维素的降解效率还比较低，成为大规模推广使用的制约因素，因此利用各种手段提高酶 的降解效率成为人们共同关注的一项重大课题【6 9 1 。 本论文着重研究纤维素酶系组分内切葡聚糖酶，先进行基础性的菌株选育工 作，将新的诱变方法真空微波诱变结合化学诱变处理绿色木霉以提高原始产酶菌株产酶 能力，粗酶制粒后可以用于饲料等工业；由于绿色木霉所产的酶类酶系复杂、纯化难度 大，考虑到纤维素酶在其他行业的应用可能需要较纯的酶制剂，本论文利用分子生物学 方法克隆诱变后绿色木霉内切葡聚糖酶主要组分e gi i 的基因，并尝试将其进行异源表 达，为进一步建立多种纤维