（遗传学专业论文）利用gal4uas系统在果蝇中研究人类基因功能.pdf

型旦鱼叁l ! 型s 丕煎盘墨蝇史婴煎厶耋基固功能 摘要 人类基因组草图基本完成，大量的新基因只有确定的序列及基因组定位信 息。新的焦点是要阐明这些基因的功能，果蝇对此起重要作用。 本研究利用转基因果蝇和g a l 4 - u a s 系统初步鉴定功能基因。首先建立了 源于1 1 个人类基因的共5 8 个转基因果蝇品系，然后用6 种不同的g a l 4 诱导这 些转基因在果蝇中过量表达。两个人类基因过量表达时会导致果蝇表型异常。其 中过量表达l v 一1 6 ( 与延伸因子1 口1 t r a n s l a t i o ne l o n g a t i o n f a c t o r1a l p h al ，e 川a 一 门编码相同的开放阅读框) 的转基因果蝇表现出异常背板和糙眼；m o r c l 4 8 过量 表达则导致果蝇背板异常和背部刚毛脱落表型。这些结果表明在果蝇中基因过量 表达策略可用于人类功能基因的初筛，从而为大规模研究人类基因的功能提供了 一种新手段。 统计结果表明，m o r c l 4 8 基因过量表达引起的刚毛脱落随着果蝇年龄增加 而日益严重。通过序列分析发现，m o r c l 4 8 基因编码未知功能的蛋白，包含两个 潜在的功能区：w h 2 功能域和c a a x 框序列，且该基因的5 端与部分的f h 2 结 构域同源。早期报道显示w h 2 结构域和f h 2 结构域可与细胞骨架相互作用，而 且果蝇刚毛发育异常可能与细胞骨架被破坏相关，这些预示了m o r c l 4 8 基因过量 表达可能影响了细胞骨架结构，从而引起刚毛发育异常。为确定其功能，我们在 人类胚肾上皮2 9 3 细胞表达m o 愆1 4 8 基因融合蛋白( 荧光蛋白标记) ，发现转染 该基因的细胞形态发生变化。 另外我们通过定点突变和p c r 引物设计对两个区域进行了突变，以后将在 果蝇中观察起过量表达情况，以便确定其相关的功能结构。 关键词人类基因功能，过量表达，g a l 4 一u a s 表型，e f la - ，m o r c l 4 8 剩旦q 曼! ：坐s 垂统垄墨蠛生婴窟厶娄茎里功能 a b s t r a c t m a n y h u m a n g e n e sd e t e c t e db yg e n o m i cs e q u e n c i n gh a v eo n l yf e wi n f o r m a t i o n a b o u tt h e i rf u n c t i o n s t o 最l lt h i sk n o w l e d g eg a p w ec h o o s et h ep o w e r f u l d r o s o p h i l a g e n e t i c sa sam o d e lt oe l u c i d a t eh u m a ng e n ef u n c t i o n se f f e c t i v e l y b yu s i n gg e r m l i n e t r a n s f o r m a t i o n t o g e t h e r w i t hg a l 4 一u a s s y s t e m ，w es t u d i e d t h e p o s s i b i l i t y o f e x p r e s s i n ga n df u n c t i o n a l l yc h a r a c t e r i z a t i o no fh u m a ng e n e si nd r o s o p h i l a f i f t y - f o u r t r a n s g e n i cf l yl i n e sc o r r e s p o n d i n gt o 1 0h u m a ng e n e sh a v eb e e ne s t a b l i s h e d w h e n e x p r e s s e di n d i v i d u a l l yb yc r o s s i n gt oa na r r a yo f6d i f f e r e n tg a l 4d r i v e rl i n e s ，o n eo f t h e s eg e n e s ，t h et r a n s l a t i o ne l o n g a t i o nf a c t o r 1 1 ( e f l 口j ) ，r e s u l t e d i na b n o r m a l n o t u ma n dr o u g he y ep h e n o t y p e s t h i ss t u d yi m p l i e st h ef e a s i b i l i t yo f s y s t e m a t i c a l l y s c r e e n i n g h u m a n g e n ef u n c t i o n sb yo v e r e x p r e s s i o n i nd r o s o p h i l a a c c o r d i n g t ot h es e q u e n c e a n a l y s i s ，m o r e l 4 8c o n t a i n st w op o t e n t i a lf u n c t i o n a l r e g i o n s ：aw h 2 d o m a i na n dac a a xb o x ，a n di t s5 s e q u e n c ei ss i m i l a rw i m p a r t i a l f h 2d o m a i n p r e v i o u s s t u d yi n d i c a t e d t h a tw h 2d o m a i na n df h 2d o m a i n m a y i n f l u e n c ea c t i nc y t o s k e l e t o na n ds o m em u t a t i o n si nb r i s t l em o r p h o l o g yi nd r o s o p h i l a w e r ec a u s e db yap e r t u r b e da c t i nc y t o s k e l e t o n t h u si m p l i e db yt h er e s u l t so fb r i s t l e l o s s ，s o m ec o m p o n e n t si n v o l v e di nd e v e l o p m e n to fb r i s t l e sm a yb ed i s r u p t e di n d r o s o p h i l at h a to v e r e x p r e s s i n gm o r c l 4 - 8 t h e nw e t r a n s f e c t e dm o r c l 4 8i n t oh u m a n 2 9 3c e i ll i n e sa n df o u n dt h a tt h ec e l ls h a p ew a s c h a n g e d i n a d d i t i o n ，b y s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i sa n dp c r ，t w om o r c l 4 8m u t a n t c o n s t r u c t sw e r eo b t a i n e df o rf u r t h e rs t u d i e s k e y w o r d sh u m a n g e n ef u n c t i o n ，o v e r e x p r e s s i o np h e n o t y p e ，g a i a - u a s ， e f io i m o r c l 4 8 2 第一部分 利用g a l 4 - u a s 系统在果蝇中研究 人类基因功能 前言 2 0 0 1 年初自然和科学杂志上相继发表了人类基因序列草图“，草 图表明人类基因组约有3 0 ，0 0 0 - 4 0 ，0 0 0 个蛋白编码基因，已知基因只有2 ，0 0 0 个左右。现阶段面临的问题就是如何研究这些只有明确序列和染色体定位的人类 基因的功能。 目前研究基因功能有多种方法，如细胞水平转基因、基因剔除、r n a i 以及 分子水平的酵母双杂交系统和p u l l d o w na s s a y 等等。但由于高等生物中基因产 物之间的相互作用可能非常复杂，这些仅仅停留在体外或细胞水平上的方法很难 从整体上研究分子之间的作用，此时人们往往借助于模式生物。目前为止，多种 模式生物基因组测序已经完成，包括酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 3 、线 虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 、黑腹果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 、 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) c 6 等，而小鼠( m u sm u s c u l u s ) 的全基因组序 列也预计在2 0 0 5 年完成。模式生物方面的研究对获得基因信息起重要作用，但 目前没有利用模式生物大规模研究人类基因功能的相关报道，本研究将利用 g a l 4 - u a s 系统在果蝇中研究人类基因功能。 模式生物一果蝇 作为重要的遗传学研究模式生物之一，黑腹果蝇( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) 已有近百年的研究历史，m o r g e n 选择果蝇主要是因为它的成本低 廉，易于实验室培养，生活周期短( 2 5 。c 时，7 - 1 0 天左右) ，后代众多。果蝇作 为遗传学研究还有其他的优势：如只有四条染色体，每条染色体都有人工构建的 相应平衡染色体，抑制重组并便于基因的平衡定位；巨大唾腺染色体可直接观察 染色体畸变，雄性果蝇不会发生减数分裂重组；具有丰富的外在表征如刚毛、翅 脉和复眼等，它们都会因为基因突变而改变，在体视镜下可以容易地观察1 。经 4 型且g l 型s 垂鱼垄墨蛆空婴宜厶娄基国功鹾 过前人多年的研究，果蝇遗传学方面积累了强有力的技术经验i s 。 研究表明，一些重要的生物进程及参与其中的功能基因在果蝇和人类中都是 非常保守的，如初级体轴的形成、器官发生、细胞增殖的控制机制等等 9 ” 。通 过选择人类2 8 9 个致病基因在果蝇中比较发现，1 7 7 个有保守同源区域，其相似 性不仅体现于蛋白水平上( 覆盖了转录因子、结构蛋白、信号蛋白等) ，还涉及 到更复杂的机制诸如发育、行为、生理反应等n “。 果蝇中有多种成熟的遗传筛选系统和方法可供选择。传统的遗传筛选即采用 e m s ( e t h y lm e t h a n es u l p h o n a t e ) 诱导产生点突变 1 2 ；而通过增强子和抑制子 筛选73 可以发现一些传统遗传筛选遗漏的基因；还可以利用f r t f l p 系统 1 3 3 进 行镶嵌克隆筛选以及利用g a l 4 一u a s 系统进行错误表达筛选。但是传统遗传筛选， 增强子和抑制子筛选主要用于研究果蝇自身基因功能，它们并不能有效地筛选外 源基因( 如人类，小鼠的基因) 。本研究中我们利用g a l 4 一u a s 系统，初步鉴定了 一些从人类e d n a 文库中随机挑取的基因的功能。 g a l 4 u a s 表达系统 g a l 4 来源于酵母的转录因予，专一识别u a s ( u p s t r e a ma c t i b a t i o n s e q u e n c e ) 启动子并诱导其下游基因表达f 1 4 og a l 4 蛋白共有8 8 1 氨基酸，包括 如下功能域：n 端的d n a 结合域：转录激活区域；g a l 8 0 结合区；核定位信号区。 u a s 是g a l 4 蛋白的结合位点，其相互作用与方向和距离无关，有点类似于高等 生物的增强子序列。每个u a s 含有数目不同的结合单元，一个结合单元为1 7 个 碱基，顺序为c g g a g ( c ) g a ( t ) c a c a g g ( c ) a g g c 。该序列为回文对称，可结合双体g a l 4 蛋白分子。 为了便于构建目的基因和驱动基因的转基因品系，b r a n d 和p e r r i m o n 构建 了一系列的载体 。a w b 是基于p 一因子建立的可以表达g a l 4 蛋白的载体，包 含g a l 4 基因，h s p t o 终止子。通过在g a l 4 基因上游插入特异的启动子，利用转 基因技术可以构建一系列在不同时期，不同组织内表达g a l 4 蛋白的果蝇品系， 5 型旦鱼l ：必s 丕统廷墨蝗虫亟塞厶羞基固奠能 目前有6 0 0 多种g a l 4 品系可供使用。而p u a s t 也是基于p 一因子的载体，可供插 入目的基因，并受g a l 4 蛋白调节。包含5 个u a s 重复片段，h s p 7 0 启动子，多克 隆位点，以及s v 4 0 小t 内含子和p o l y a 序列( 图1 ) 。目前有两种形式的u a s 品 系，1 ) 研究外源基因：在多克隆位点插入外源目的基因，利用转基因技术就能 得到相应含有目的基因的u a s 果蝇品系；2 ) 研究果蝇自身基因：把u a s 启动子 通过p 因子介导转座随机插入果蝇基因组中，如果其正好位于某一内源基因上游， 该基因的表达就可以受g a l 4 调控( 图2 ) 。 图2 g a l 4 - u a s 系统 r o r t h 1 6 1 成功地在果蝇中引入g a l 4 - u a s 系统，利用组织特异性g a l 4 诱导u a s 下游基因在某一特定组织中错误表达或过量表达，如果该基因导致出现某一特表 型或与某一己存在的突变类似的表型，则此基因可以被筛选出来。 6 型目鱼丛型叁s 丕统垄墨蝇虫班塞厶煎茎固功篷 g 虬4 _ u a s 系统的应用 g a l 4 一u a s 系统由于具有以下优点而使得遗传筛选方便可行：目前有6 0 0 多 种g a l 4 果蝇品系已经建立可供使用：建立目的基因的转基因果蝇品系的操作易 于掌握而且这些转基因品系可以重复利用；g a l 4 品系和u a s 品系是相互独立的， 只有当两者交配时，u a s 启动子下游的基因才能表达，因此利用特异的g a l 4 蛋白 可以控制目的基因在不同组织不同时期表达，并能研究过量表达致死的基因：另 外由u a s 品系构建过程可知，该系统可以研究外源基因的功能。 早期研究中，g a l 4 一u a s 系统主要作为特定基因过量表达的研究工具；目前 它又在以下领域中快速发展“】：1 、通过增强予捕获( e n h a n c e rt r a p p i n g ) 技 术鉴定某一特定途径中的基因：2 、通过靶细胞嵌合技术( t a r g e tm o s a i c ) 分 析基因产物的细胞自主性：3 、在影响特定途径突变筛选进行细胞标记( u a s l a e z 或者u a s - g f p ) ；4 、当用细胞特异性启动子控制d s r n a ( d o u b l es t r a n dr n a ) 和负显性片段( d o m i n a n t n e g a t i v ec o n s t r u c t s ) 的表达时，可以研究特定基因 在不同器官中的功能。赫a r t i n e k 和y o u n g 通过g a l 4 - - u a s 系统来控制d s r n a 在果 蝇中的表达，实现了组织特异性控制r n a i ( r n ai n t e r f e r e n c e ) 的发生 j ”。5 、 在基因组水平筛选参与某一特定途径的基因，比较有代表性的例子如近几年来 a b d e l i l a h s e y f r i e d 等利用此系统成功筛选影响果蝇成虫外在感受器( e x t e r n a l s e n s o r yo r g a n ) 发育的基因” ：t s e n g 等在果蝇中筛选影响眼发育细胞周期进 程的相关基因 2 0 ；h u a n g 等鉴定影响r a s i 信号传导途径的基因n 门以及k r a u t 等对控制动力轴定向( m o t o ra x o ng u i d a n c e ) 和突触发生过程的基因的大规模 筛选2 。 7 型旦立竖：堕5 丕统查墨坦史盟宜厶袭基固麴筐 材料与方法 1 材料 1 1 菌种和载体 大肠杆菌d h 一5q ：由本实验室保存，基因型为s u p e 4 4 al a c u l 6 9 ( t y 8 0 l a c z a e l 彰 h s d r l 7r e c a le n d a lg y r a 9 6t h i lr e l a l p u a s t ：许田教授提供并由本实验室保存，有p 因子转座酶识别序列。 2 3 ：许田教授提供并由本实验室保存，编码p 因子转座酶，但没有转座 酶识别序列。i j a s t 和2 3 共同注射果蝇后，可将识别序列之间的片 段随机插入果蝇基因组中。 人类全长e d n a ：许田教授提供，p o t b 7 载体，c d n a 插在e c o r i x h o i 之间。 图3p o t b 7 和p u a 3 t 载体图谱 8 到目q 丛：堕s 丕筮垄墨蛆虫班宜厶娄基固功能 1 2 主要生化试剂及仪器 限制性内切酶& d r i ，肋d i 等b i o l a b s 公司 t 4d n al i g a s et a k a r a 公司 q i a g e np l a s m i dm i d ik i tq i a g e n 公司 p c r 仪m jr e s e a r c h ，i n c 高速冰冻离心机h e r a e u s 公司 显微注射仪，拉针仪n a r i s h i g e 公司 倒置显微镜，体视镜，荧光显微成像系统l e i c a 公司 本实验中所用l b 培养基及各种抗生素配置均参见分子克隆第二版 2 “， 寡聚核苷酸引物根据实验需要自行设计并由上海博亚公司合成，d n a 序列由博亚 公司测序 1 3 果蝇品系 本文中所用染色体和遗传标记描述参考l i n d s l e y 和z i m m ”1 著作，特殊 情况另有说明。 1 _ 3 1 一”。品系：白眼，用于显微注射。 1 3 2 平衡定位所用品系：聊庇仍懈和y w ；a d v c y o ；妨惝 1 3 3g a l 4 品系见表1 表1 实验中常用的g a l 4 品系 不同的g a l 4 品系果蝇中表达模式 a c c 抽一硎l 4 c y o ( i i ) 广泛表达2 ” p g g r - g a l 4 p 彻- g a l 4 ( i i ) 分化期的眼原基细胞中特异表达口” e y - g a l 4 c y o ( i i ) 增殖期眼原基细胞中特异表达“” p t c - 6 a l 4 p t c - g a l 4 ( i i ) 与翅膀，翅脉背板相关的原基细胞中特异表达口7 册r 硎4 t m 3 ( 1 1 1 )中胸背板，腹部中央原基细胞中特异表达” v g - 6 a l 4 c y o ( i i ) 翅膀特异表达1 9 查! | 崩鱼l ! 型s 丞煎垄墨蝇主班塞厶娄基旦功篚 1 4 显微注射主要试剂 果蝇培养基( 8 0 0 m l ) ：6 8 9 玉米粉，5 2 9 蔗糖，6 6 9 琼脂粉，8 9 酵母粉，最后蒸 馏水定容至8 d o t a l ，混匀，煮沸l o 分钟，温度降至6 0 。c 以下，加入对羟基苯甲酸甲酯( 1 9 2 9 ，事先溶于7 5 m l 无水乙醇中，作防腐剂用) 。 苹果培养基( 1 0 0 m l ) ：2 5 m l 苹果汁，2 9 琼脂粉，1 2 5 9 蔗糖，7 5 m l 蒸馏水。 显微注射缓冲液( 4 x ) ：5m m o l lk c l ，0 1m m o l ln a h 2 p 0 4 ，p h6 8 。 显微注射液( 2 0 “l ) ：4 pl 显微注射缓冲液( 4 x ) ，州a s t e d n a 和2 - 3 的终 浓度分别为1ug ul 和0 8 ug ul ，最后加d d h 2 0 补足2 0 ul 。 2 方法 2 1p u a s t - c d n a 质粒构建 从人类e d n a 文库中随机挑取克隆，经e c o r i 和x h o i 双酶切构建于州a s t 载体上，流程见图4 ，具体构建方法参见分子克隆第二版。经5 端和3 端测 序挑取1 1 个全长e d n a 质粒显微注射果蝇。 2 2 转人类基因的u a s 果蝇品系的建立 2 2 1 果蝇显微注射( 参考标准果蝇显微注射方法 3 0 】并有改进) 拉针仪制备8 根注射用针，用毛细玻璃针在每根显微注射针尖端灌入1 “l 左右显微注射液；装好玻璃针，在倒置显微镜下轻撞玻璃针使其尖端开1 2 ，排出 气泡，针尖并浸于矿物油中备用。 在苹果培养基平板上收集在注射前4 5 分钟”果蝇所产的卵，浸于漂水中 处理9 0 秒去卵壳，蒸馏水洗净，将卵直线排列( 卵头尾方向一致) ，粘着于盖玻 片上后放入硅胶中干燥8 1 0 分钟，用矿物油将卵覆盖( 防过度脱水) ，在倒置显 微镜下从卵尾端注射( 极细胞所在位置) ，从卵处理至注射完成控制在l 小时之 i 0 刊旦鱼丛：堕s 丕堡查星蝇主婴嚣厶耋垂国功能 内。注射后果蝇卵静置于2 琼脂板上( 保湿) ，1 8 。c 培养；4 8 7 2 小时后挑幼虫 果蝇幼虫转移至果蝇瓶中，每瓶约5 0 只左右，2 5 。c 培养。 基e d n a l 嚣 p 0 1 8 7 哦体 赛基因c d 虿 i 。 图4p u a s t - c d n a 质粒构建 2 2 2 转基因的平衡与定位 及时挑出上述果蝇瓶中羽化的果蝇成虫( f0 代) 。注射雄蝇与一“8 处女蝇按 1 ：3 ，注射处女蝇与一m 雄蝇按l ：4 回交，2 5 。c 培养，在f1 代中挑红眼果蝇即为 转基因果蝇，并按照图5 进行平衡定位。 2 3 果蝇过量表达人类基因及其表型观察 平衡定位完成的转人类基因u a s 果蝇品系与多种g a l 4 品系交配( 见表1 ) ， 诱导转基因在果蝇特定组织中过量表达，放置2 5 。c 中恒温培养，约1 2 天后在其 后代中观察过量表达产生的表型。 型旦鱼班：坠s 亟筮查墨蝇虫班宜厶塞基旦功能 f m，i 射垃的泉蜒x - ， f 1 ，+ dx 早p 岬 却伽；躏跗i 丑 l 广 f 2 dx 早朋f i h 0 ，d ；s b t a 4 6 b 所有雌性阜蝇均膏自嚷 广 竹 南伽 i c i i * 0 j m o s o d i e i 妒n 彻。 巳平卉 s z m i c h 哪o o m e i m 卿。 巴平衡 图5 转基因果蝇平衡定位流程 “”代表人类c d n a ，由于随同m i n i w h i t e 基因一起转入，果蝇表现为红眼；“+ ”表示野生型 “圆”表示自交 1 2 聃 c 忤 w 。一。一。愀 型旦旦丛墨型s 丕盈查墨蝇生婴塞厶差基固功篚 结果 1p u a s t e d n a 质粒构建 构建1 1 个包含人类c d n a 的质粒( 表2 ) ，其中1 4 2 和1 4 8 由刘旭构建， l e - 3 4 由朱焕乎构建，2 n - 6 6 和2 n 一4 6 由丁旭构建。质粒双酶切结果表明所有质 粒构建成功( 图6 ) 。利用p u a s t 载体上的专用引物( u a s - r i 和u a s x b a i ) 进行 5 和3 端测序，发现所有c d n a 均为全长序列。测序结果在n c b i 网站上进行b l a s t ， 发现其中五个编码已知蛋白，但其并未在果蝇中研究过；其余六个则是未知功能 的基因( 表2 ) 。基因比对结果见附录。 图6p u a s t - c d n a 质粒屁o r i 肠d i 酶切电泳图 从左到右双酶切的质粒依次为：l ，i v 一5 0 ；2 ，l v 1 6 ；3 。1 y 一4 1 ；4 ，l v 一0 6 , 5 l v 一2 8 ；6 2 n 一4 6 ：7 ，2 n - 6 6 ：8 ，l v 一2 7 ；9 ，1 4 2 ；10 ，1 4 8 ；11 ，l e 一3 4 1m ，i k bl a d d e r 2 转人类基因u a s 果蝇品系的建立及表型鉴定 上述1 1 个质粒显微注射果蝇，得到5 8 个相应的转基因果蝇品系， 平衡定 位及其基因产物详见表2 。 从每个c d n a 的转基因果蝇品系中选取3 5 个品系，分别与6 种不同的g a l 4 品系交配来观察表型，并相应地重复3 次( 表3 ) 。其中1 v 1 6 和1 4 8 过量表达 导致明显表型异常。1 v 一1 6 编码已知功能蛋白一真核生物的翻译延伸因子1a1 ( e u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ne l o n g a t i o nf a c t o r1ql ，e f 一1a1 ) ，1 4 8 是一个 未知功能的基因，其它基因无明显表型。 1 3 型周鱼l ：垡s 丕统查墨蝇主班塞厶装基围功能 表2 转人类基因平衡定位及其基因产物 “# ”表示转基因所在的染色体位置；a 。功能未知，在c d 3 4 + 血红干细胞中表达；b ，喹啉磷酸核糖 转移酶( o u i n o l i n a t ep h o s p h o r i b o s y lt r a n s f e r a s e ) ；c ，核糖体蛋白( r i b o s o m a lp r o t e i n ) s 2 d ， 与细菌和真菌质子共转运家族及哺乳动物葡萄糖转运家族同源 表3不同转基因品系表型分析 1 4 - 2 ( 4 ) 1 4 - 8 ( 4 ) l v - 4 1 ( 3 ) 2 n - 6 6 ( 5 ) 2 n - 4 6 ( 4 ) l v 一5 0 ( 4 ) l e - 3 4 ( 4 ) 1 v - 2 7 ( 2 ) l v 一0 6( 3 ) l v - 1 6 ( 4 ) 1 v - 2 8 ( 4 ) ? 一 o 一 0 一 一 注：括号中数字表示交配品系数；“+ ”表示该基因与此种g a l 4 品系交配时，会导致过量表达异 常表型；“一”则表示与对照组相比，无明显异常表型；“? ”重复交配实验结果不一致或只有个 别果蝇表型异常。 1 4 型且鱼坠型s 丕笪查墨蝇生婴窒厶娄基固功睦 3 舒qa1 ( i v 一1 6 ) 基因的过量表达表型 与p n r - 6 a l 4 品系交配后，过量表达e f l 1 蛋白的转基因果蝇表现为背 板异常，刚毛分布不均匀，比较典型的例子可见图7 。与对照组相比，表达较弱 ( 图7 b ) 的转基因果蝇的背板有轻微异常，而过量表达较强的转基因果蝇的背 板中央可见明显的刚毛间隙( 图7 c ) ，表达最强的转基因果蝇的背板中央凹陷， 将背板分成两半( 图7 d ) 。 图7 肝q 口1 过量表达导致的背板异常光学显徽图( i m r - 例, 4 诱导) 图中果蝇的基因型依次是：ap n r 6 a l 4 + , bp n r - 6 a l 4 七e 卜d 1 + ( 定位于i i 号染色体) ，c p n r - 6 a l 4 g f - i aj ( 定位于i i i 号染色体) ，dp n r - g a l 4 + ：j 弘j 口1 ( 定位于i i 号染色体) n 白色箭头表示背板中央刚毛的分布情况。 图8 盱q 口j 过量表达导致的糙眼光学显徽圈( 阳岍咧“诱导) 图中果蝇的基因型依次是：ap g m r - g a l 4 + ，bp g n r g a l 4 + ；厨1 _ j 口十，c 显示了正常果蝇眼 睛单眼间刚毛的分布状况，d ( 黑框区域) 显示刚毛增多，e ( 白框区域) 则表明了刚毛缺失。 1 5 型周鱼垒丛：婪s 丕缝垄墨蝇虫班塞厶耋基固功能 量卜口基因在果蝇眼中过量表达可导致果蝇复眼发育异常。用p g m r g a l 4 诱导占卜aj 过量表达，果蝇呈现糙眼表型( 图8 b ) ，单眼( o m m e t i d i u m ) 之间 的小剐毛数目有所变化( 图8 d 和8 e ) 。当与其它的几个g a l 4 品系( e y g a l 4 ，瞄一g a l 4 , a c t i n - g a l 4 和p t c - g a l 4 ) 交配时，后代中没有明显的表型变化。 41 4 _ 8 基因的过量表达表型 经p t c - g a l 4 诱导产生的后代中，1 4 - 8 基因过量表达的果蝇会产生背部刚毛 的缺陷( 图9 ) 。刚毛的缺失情况随成虫孵化后日益增多，刚羽化的成虫( 图9 d ) 刚毛数目正常，三四天后其背板的粗刚毛会脱落2 3 根( 图9 e ) ，随年龄增长果 蝇背部的大刚毛( m a c r o c h a e t e ) 几乎会全部脱落，小刚毛( m i c r o c h a e t e ) 也会 有部分的脱落( 图9 f ) ，面对照组的果蝇背部刚毛数目不会改变( 图9 a 、b 、c ) 。 本论文的第二部分将会对刚毛数随果蝇年龄变化进行具体地分析，并对该新基因 的功能进行更深入的研究。 图91 4 - 8 过量表达导致的背部刚毛脱落光学显张圜( p t c 删l 蒋录般措j 图中果蝇基因型依次是：ap t c - a l 4 + ( 刚羽化的成虫) tbp t c - f i a l 4 + ( 羽化三四天后的成虫) ， cp 幻删毫+ ( 羽化二到三周的成虫) ，dp t c - 6 a l 4 + ：删s j 型昭+ ( 时间同a ) ，ep t c - 6 a l 4 , u a s 一1 4 - 8 + ( 时间同b ) ，fp t c 吲砂t 删5 1 4 书十( 时间同c ) 。黑箭头指示出大刚毛的脱落 而白箭头显示小刚毛的脱落。 1 6 麴周鱼丛型s 丕筮查星蝇主班嚣厶娄基固功篚 p n r - g a l 4 诱导可以引起1 4 8 转基因果蝇表现出背板异常( 图1 0 ) ，其表型 与e f i a i 过量表达突变表型类似。即当转基因过量表达时，不同的转基因品系 表现不同程度的异常背板和刚毛分布，这可能与转基因插入的位点有关。 图1 0p a r - 4 4 l 4 诱导的4 昭转基因过量表达导致背板异常 果蝇品系基因型依次是ap n r - 6 a l 4 + ，b1 4 - 8 - - 1 4 8 p n r g a l 4 ( i i i 染色体) ，c1 4 - 8 一十； p n r - 6 a l 4 + ( i 染色体) n1 4 - 8 1 3 1 p n r - 6 a l 4 + ( i i 染色体) ，e1 4 - 8 6 0 p n r - 6 a l 4 ( i i i 染色体) 。白色箭头指示背板中央刚毛分布情况。 当与其它的几个g a l 4 品系( o y g a l 4 ，v g - a a l 4 , a c t i n - 6 a l 4 和p t c - g a l 4 ) 交配时，后代没有明显的表型变化。 1 7 到旦垦丛：型s 丕统垄墨蝇主班塞厶差基固功能 讨论 1g a l 4 - u a s 系统研究人类基因功能的可行性 我们对利用g a l 4 一u a s 系统在果蝇中研究入类基因功能进行了可行性分 析。当用不同组织特异表达的g a l 4 蛋白诱导时，在随机挑选的1 1 个人类基因中， 两个基因过量表达时导致果蝇表型异常，这些结果显示g a l 4 - u a s 系统在大规模 筛选人类基因功能中的潜在可行性。通过该系统既可以鉴定一些已知基因，也能 发现新的人类基因的功能( h y p o t h e t i c a lg e n e ，1 4 - 8 ) ，这对大规模研究那些只 有序列和染色体定位的人类未知功能基因有很大帮助。 前人研究表明，大约会有2 7 的果蝇基因在特定组织、不同时期内过量表 达会引起突变表型 1 9 - 2 2 , “】；人类基因组和果蝇基因组测序相继完成后，同源比对 发现两者约有6 1 的序列同源口“。基于上述两点考虑以及许田教授多年从事果蝇 工作的研究经验，我们预期约有5 的人类基因在果蝇中过量表达可能会导致异常 表型。而事实上，在我们随机挑取的1 1 个人类基因中2 个出现突变表型，这可 能是由于我们所选用的g a l 4 品系与前人实验用的品系有所不同，也可能是人类 基因与果蝇同源基因之间的差异造成的。 我们选用了6 种比较常用的g a l 4 品系。其中之一为普遍表达( a c t i n - 6 a l 4 ) ， 而其余几个则具有组织特异性( 眼，翅，背板等) 。用这些g a l 4 诱导时，外源基 因可以在发育的不同时期，不同组织中特异表达；另外这些g a l 4 品系诱导基因 在易于观察的果蝇器官中表达，有利于功能基因研究的进行。 另外，人类转基因果蝇品系在建立之后可重复使用，与多种不同的g a l 4 品 系交配观察表型，这大大降低了劳动量。 总体而言，利用g a l 4 - u a s 系统的过量表达策略在果蝇初步研究人类基因的 功能是方便可行的。几乎所有的重要信号传导途径都是在果蝇或线虫中首次发现 的，越来越多的研究报道同样显示基本的生物学进程在人类和果蝇中是高度保守 1 8 型旦q 丛：型s 丕统查墨蝇生班塞厶差基国功能 的。当在果蝇中过量表达人类基因出现异常表型时，通常预示外源基因可能影响 一个或几个保守的信号传导途径。利用从果蝇中得到的线索，可以更有针对性的 研究这些基因的功能。 2g a l 4 一u a s 系统筛选的局限性 g a l 4 一u a s 系统由于具有高效，可筛选过表达致死基因而广泛应用于发育遗 传研究。但不论何种方法，都会有不足之处。首先从j ：t j a s t e d n a 质粒构建到最 终的表型观察，一般需要大约两个月的时间，历时较长。其次观察基因过量表达 表型时，有些表型不明显，需要仔细辨别才能确认，因此可能会遗漏一些有功能 基因。另外从e f - 1 口基因和1 4 8 基因过量表达表型的研究还可以发现，并不 是所有的g a l 4 品系诱导它们过量表达都能产生异常表型( 表3 ) ，所以在实验条 件允许的情况下，应尽量选用多种不同组织、时期特异表达的g a l 4 品系诱导， 从而获得更全面的基因功能信息。 3 野q 口1 基因表型分析 3 1 点卜ja1 基因与肌动蛋白细胞骨架 e f - 1ql 是一类高丰度的蛋白，属于典型的g 一蛋白，其活性与有无结合g t p 相关。它负责将氨酰基- t r n a ( a a - t r n a ) 转运到核糖体上，使蛋白链得以延伸。 除此之外，e f - iql 还影响其它途径如：病毒复制，c a l m o d u l i n 结合，肌动蛋白 结合和聚合等。 目前对于e 卜j aj 活性过高或其蛋白过量表达产生的影响知之甚少。在酵母 中占卜a 的过量表达会影响肌动蛋白细胞骨架的组装及功能，从而改变细胞形态 。3 3 “。另外早期研究发现果蝇刚毛的形态变化可能与细胞骨架的被破坏有关d ”。 因此在本研究中过量表达髟吖盯j 基因所引起刚毛缺失或丛生以及其在背板上的 不均匀分布( 图7 和图8 ) ，可能是由于该基因过量表达影响了肌动蛋白细胞骨架， 进而影响参与刚毛发育的因子，导致刚毛形态变化。但是这并不排除卜纠j 的 1 9 型旦鱼丛墨：坠s 丕箕垄星蛆虫班塞厶娄基因功篚 过量表达会影响其它信号传导途径的可能性，因为有报道显示介导n o t c h 和e g f 途径的信号也可能相应地抑制或促进刚毛的发育s “。以后可以通过遗传筛选等 方法进一步找到与其相关作用的因子，阐明它与以上信号传导途径之间的联系。 但是本研究中由于时间限制，主要对另一个人类基因1 4 - 8 的功能进行研究： 3 2 历吖口1 基因与f e l t y 综合征 d i t z e l 等人研究表明，e f - 1 nl 蛋白是一个新的自主性抗原，与f e l t y 综 合征( f e l t y ss y n d r o m e ) 有关 3 “。f e l t y 综合征又称为关节炎一粒细胞减少一 脾大综合征、类风湿性关节炎一脾大综合征、感染性关节炎。其病因不明，可能 为自身免疫性疾病。1 9 2 4 年f l e t y 首先报道成人慢性类风湿性关节炎合并粒细 胞减少及脾肿大，此后屡见报道，遂将具备上述三大主征的疾患称为f l e t y 综 合征。目前其致病机制尚不清楚，我们现在有点h a j 转基因果蝇品系，希望 对这个基因的进一步研究对f e l t y 综合征有所帮助。 2 0 到旦坠丛：坠s 丕箕垄墨塑主丛窭厶耋基固功能 第二部分 m o r c l 4 - 8 基因功能初步分析 ( 1 4 8 基因编码个假想蛋白，我们将它命名为m o r e l 4 - 8 ) 。 待剐山花烂漫时。 它在丛中笑。 2 1 l i 旦q l 型s 丕筮查墨蝇虫婴宜厶娄基国盐能 人类基因m o r c l 4 - 8 编码个假想蛋白，它的过量表达导致果蝇背部刚毛脱 落和背板发育异常等表型。在这一部分首先对它进行生物信息学分析，找到可能 的功能域并对其功能加以推断。我们主要发现几段潜在的功能结构：w h 2 结构域、 f h 2 结构域以及c a a x 框序列( 见图1 7 l w h 2 结构域 肌动蛋白是所有真核细胞骨架的主要组成成分，以单体( g 一肌动蛋白) 和多 聚纤维结构( f 一肌动蛋白) 两种形式存在。肌动蛋白细胞骨架在许多细胞生物学 过程中起重要作用，肌动蛋白纤维的动力学本质使得细胞可以对外界信号作出快 速反应。这些快速转变受到一些含有特殊结构域的舰动蛋白结合蛋白的调节，这 些结构域包括： c a l p o n i n 同源结构域( 只与纤维状肌动蛋白作用) ，a d f h 结构 域，g e l s o l i n 同源结构域和t h y m o s i nb4 w h 2 ( w a s p 同源结构域2 ) 口“2 h w h 2 结构域是一类约含3 5 个氨基酸的功能域，生物化学数据显示其与肌动 蛋白单体有相互作用。该结构域广泛存在于果蝇、线虫、酵母和人类中，序列分 析发现，w h 2 结构域n 端螺旋结构相当保守，c 端则差异很大。对t h y m o s i n sd 4 ( 含有一个w h 2 结构域) 的研究表明，n 端的螺旋结构对于肌动蛋白的结合是很 重要的，其中m e t 7 、i l e l o 、l e u l 8 和l y s l 9 四个保守残基起关键作用【蛆 ( 图1 1 ) 。 研究表明t h y m o s i n s0i 0 的表达会使细胞质中肌动蛋白单体表达水平下降， 抑制肌动蛋白聚合“ ：c i b o u l o t 则可以提高纤维裸露端胍动蛋白单体的组装 4 6 ； w i s k o t ta l d r i c h 综合征蛋白( w i s k o t ta l d r i c hs y n d r o m ep r o t e i n ，w a s p ) 的 过量表达会导致肌动蛋白聚集。说明其对肌动蛋白聚合有作用“。 到旦鱼! ：必s 丕统在星蝇生虹塞厶娄基固功能 图1 1 人类、线虫、果蝇、酵母蛋白中- 弛结构域多序列比对 “”显示与肌动蛋白结合起重要作用的残基，蛋白名称，数据库及登录号省略。由图可见人类、 线虫、果蝇、酵母等生物中分别有多种蛋白都含有w h 2 结构域。 f h 蛋白 目前人们对于细胞形态的调节机制知之甚少，实验表明f h 蛋白可能通过一 定的细胞信号传导引起细胞形态改变。f h 蛋白是一类很保守的蛋白质，在果蝇、 酵母、小鼠、真菌、植物、线虫中均有同源蛋白，长度约1 ，0 0 0 2 ，0 0 0 a a ，包含 f h i ，f h 2 ，f h 3 三个保守结构域，g t p a s e 结合域( g t p a s eb i n d i n gd o m a i n ，g b d ) ， 到日q l ! ：堕s 系统查墨鳗生班塞厶娄基垦功睦 c c ( c o i l e d c o i l ) 结构域和一段自主调节区域( a u t o r e g u l a t i o nd o m a i n ，a d ) c 4 7 ( 图1 2 ) 。其中f h i 大约有l o o a a ，富含脯氨酸，可以与p r o f i l i n ，s h 3 和聊结 构域结合5 2 1 ：而f h 2 约1 3 0 个残基，功能尚不清楚：a d 则可以与f h 3 和g b d 结 构域之间的区域发生作用，从而调节f h 蛋白活性】。 f h 3