（遗传学专业论文）可得兰多糖（curdlan）发酵工艺及分子结构的研究.pdf

中文摘要 可得兰多糖( c u i d l 锄) 鼹微生物发酵生产的直链无分枝的b 一( 1 - 3 ) 一葡聚糖，具有 力热形成凝胶的特殊性质，在食品、轻工、医药、保健摊领域有广泛的应用开发前景。本 论文鞋诱交、簿这褥到戆融避黟黯囊硪酝 纽a 艿蘩椽梵生产蘩糠，磷究e 1 2 5 蘩株产 c i 】i d l m 的发酵特性，应用蛹应面法优纯了发酵培葬基静缀成和发酵培养条 牟；研究黼后 q h l m 狮的提取、纯化和分离工艺；分析分离纯化得到的n 玎d l 觚c 口3 样品的分子结构并对 其进行初步的分子结构改造研究。主要的研究内容如下； 1 ) 对蘩抹1 2 5 培养静擎因素实验磷究表葫蘩蔫耱、蔗糖、耱蜜鞫酉溶往淀粉作为发 酵的碳源都可以生产c u r d l a n ，但以葡萄糖为最佳碳源，适宜的加入爨为4 5 9 p ；酵母粉 为菌株c 1 2 5 的最佳氮源，邋宜的添加量为8 5 9 l _ 1 ；加入适量的碳酸钙( 2 5 9 。| 1 ) 不仅可以 挺进& 砖l 瓣夔发蘸生产，露显妻够维持发酵液载簿豹稳定。 正交实验表明碳源和氮源对c u r d l a n 发酵嫩产的影响黧著，混合蠢机盐 ( k 2 h i u + s 强) 有较显著影响，柠檬酸钾冠显著影响：诞交实验优化的发酵培养基缀合为 ( g l 1 ) ：甍蘩糖4 0 ，酵母粉8 。5 ，混合茏枫盐2 o + o 。2 ，柠檬酸钾o 2 ，其e u r d l a n 产量荧 筠2 2 晷l - j 。溅瞳啶和k 嘲。对落株e 1 2 5 发酵生产c u r d l a n 有较大静彩镌，氍添麴浓度 为2 9 l _ 1 ，尿嘧啶的添加量不能低于o 3 9 一。 利用响成颜法获得的墩优培养基组含为( g l | 1 ) ：黼萄糖，的5 、酵母粉，7 。6 4 、尿 瀵睫，0 ，3 2 、羚 蕊+ 2 豫鬻瞄) i 娲，l 。1 6 。鞋往稼戆壤葬基缝会发辩5 参霹，掰缮兹 c u r d l a n 产爨为2 5 0 3 9 。菌株c 1 2 5 菌体生长与产c u r d l a n 为部分偶联，发酵前期是菌 体对数生长阶段，没有c u r d l a n 产出，在氮源基本消耗党后菌体才开始产c u r d l a n 。 2 ) 单因索实验表骧q 嬲嗽发酵种予波适宜鲍耱龄秘接静量分另g 为l 潍秘1 0 ：攫魏 装液量秘籍涞转速分秘为5 0 0 越摇 瓣凌l 一1 2 5 畦培养簇帮2 0 峨n ；勘溶氧翔p p e 和菜 油可以改善发酵液的溶氧水平，有助于提高q l i d l a i l 的发酵产量，而用h 2 q 作助溶氧剂则 不可取；合邋的发酵温度焱3 0 3 2 ：发酵培养基合逡的初始p h 为6 5 ，发酵周期为 努巍。 应用嗣威丽设计优化的q 砌髓发酵的培养操作条f 辞：为：种龄9 9 h ，接种量9 8 ，摇 床转速2 0 8 r l 黼，发酵培养慕初始p h6 1 ，发酵时间9 3 9 h ，在优化的培养条件下，发酵生 产c l 疆覆越，褥至4 茨发酵多糕产量走2 4 嫠礁。 3 7 l 自动发酵罐实验袭孵院亿的培养蒸组成和培养条件适宜避 予罐发酵，可以此为基 点继续优化；考察罐发酵过程中c i 埘蛔浓度与发酵液粘度的变化趋势相两者的关系，得到 用发酵液粘发颚钡c u l d l 锄产量浓度的模型方程，简化了发酵过程c i 列b 吸浓度的梭澳手段 及簿发酵条 每豹控裁。 3 ) 用不同方法研究c u r d l a n 的提取工艺，结果表明醇析法和酸碱法是c 删a i l 粗多 糖较合适的提取工艺。经优化的提取工艺为：醇析法添加乙醇3 5 倍( v v ) 、醇析次数3 次；酸碱法加等体积1 m 的氢氧化钠溶液，使碱的终浓度在0 5 m 以下，2 m h c l 调节p h 至 中性使q d l m 沉淀，然后离心和醇洗。 q d l 觚粗多糖用s e v a g e 法脱蛋白5 7 次，流水逆向透析得q d l m 半纯品c d - 2 样 品，c d 啦样品用s e 曲a d e ) 【g 1 0 0 ，s e p l l a d 麟g 2 0 0 分离和纯化得到q d 加c d 3 样品； s e d h a r d 鼢( - 2 0 0 和紫外光谱检测表明c d 0 样品为高纯度的q d l 匝；c d _ 3 样品为白色粉 末，理化实验表明具备q d l m 的特性。 4 ) 纸层析和高碘酸钠氧化实验确定c d - 3 是种以1 3 葡萄糖苷键连结的单糖组份 单一的多聚葡萄糖；s e p h 啪s e x 2 0 0 柱层析求得c d 3 的分子量为4 5 7 0 0 d a l ；刚果红实验表 明c d 3 在稀碱溶液中( 浓度娜4 n l o l 肚1 ) 存在三股螺旋构象。红外光谱和核磁共振图谱 分析证明，c d - 3 具备标准q d k m 的分子结构。 采用低取代度法和s p c 法制备得到c 删锄硫酸化衍生物( c d l 迟) ，有效改善了 c u r d l a n 的水溶性，红外光谱显示c d r s 有硫基( 旬s 0 3 ) 的吸收峰和b d 一( 1 3 _ 卜葡聚糖 的特征吸收峰。 制备得到q d l 孤羧甲基化衍生物( c m c d ) 样品，能够溶解于水且保持热凝胶性 能，取代度为o 5 。红外图谱显示羧甲基的吸收峰和b d 一( 1 - 3 _ 卜葡聚糖的特征吸收峰；核 磁共振图谱显示在q | i d l a n 的c 2 和c 4 位置的羟基( 0 h ) 被羧甲基取代( 扰h 2 c o o h ) 。 关键词：产碱杆菌c 1 2 5 突变株可得兰多糖响应面发酵提取纯化分子结构 v i i i a b s t i 曩c t c 啦龇i sab a c 妇瑚p o 啪蕊对函d ec o i n p o s e de n 盘e l yo f ( 1 3 冲啦妇璐l d 把酗k a 窜苣p d e db y 缸删o n o f f r i i 唧n - 啪o m o f t h e 啡彻舡i 螨0 f c t i | d l 矾i s 衄a q 啪峭驰碑嘣o n s 啪b e 佩咖 i n d i l c e d t o 觚b j 毋吲萨h 棚廿l i sh a s 删妇融擞岫o f 岫枷碱啡u 出姗u 螂 n l e d i c 妇a n d k 妯删0 r l 如t | l i s 斑晦船p f o d 撕1 1 9 蜊n 一一妇豫榭脚胁a 乃跏痈 w 碴i 【l d e d 绷d s c r e e d 锄d 缸d 1 越咖妇q 】i d l a t l 删哪o n w 硒姗i e d q 加聪m e d l u n l 锄d c o r 蹦o n s 0 f 缸m 蹦碰锄w 撼o p 也砸捌b y 瞄p o n ds l 咖er n 叫| o d o l o 酬r s m kt h e 阳) g e s so f 渤o 玛p 证五c 商0 n 删 p a m 虹0 n0 f c ：u l d l 锄删y s c 1 1 a 删e 丘_ c 哪向舶翎碰o nb r 叫1 w 鲒s n i d i e d t i l cs 虹咖o f 血e 弘h i 删c l d l 锄 p r o d u c t ( c 口3 ) 州c h 、榴ss e p 删a n dp 吲匝e d 舶m 向t n e l i 嘲嘲1 、垤s 册a l 删刊趣s 仨慨 m o d i 丘c 撕w a s a l s o m l d i 。d t l e m a i l l i 斑u b w e 咒越f 0 1 i o 、v i n g ： n g l u c o s e s l 嘲嘴m m 嬲a 1 1 d 鲥l 】b 蛳曲砌1 c 锄a l lb eu s e da s i b o n 摊峨协珥o d u c e c m 姆 s m 翻e 自c t o r 麟p e 痂触b y 爿c 盘碱脚扣e 出船隐( 乃册嘲h o 、 ，e v 茸l 黼w 笛协e 叩b n l a l c a r b o ns o a n d 缸触o o n 眦4 5 ；y 瞰e 删t h e 删删妇蛳蚴a n d 如俐n g c o n 溅 w 雒8 5 舀l 1 ；r e a s o r 洲e c a l c i u r nc a r b 眦瞳( 2 5 吕l j ) 酬d 似o | l l y 脚n l e c 咖岫州d b m a 1 s 1 ) 脚呲曲廿1 e p h o f 向m e i i 呲i o nb 舳 c a i b o n 涨a n d i i j 哪酬t h e c 蜘f 蝴自础咖b y 蜊t e s i ，a n d m i x i i 科目n j cs a l t ( k 2 i 司叼d + m 萨0 4 ) 岫u 咖e dc 呻田锄危册删喇s 谤i i 五c 删yi 瞄吐m 砖姗n b u t 蹦啪c i 廿a l eh a d l l t 硝g n 墒c 烈吐i i l 丑u c e ，q l 蛔砖m c d i u f n 叩嘶l 捌w 曲删t 唾；0 删啪s ( 昏l 1 ) 捌u o o s e4 0 ；y e a s t 咖_ a c i8 5 9 l - 1 ；m 酗罾枷cs a l t2 + o 2 ，b u 咖c i 盱眦眈1 kc u i d i 锄y i e l d w 酷2 8 2 2 吕l 1i 1 1 叩血l i z e dm e d j 啪 u 删l d k h 2 p 0 4c o l 埘a l s o a 腩c t c u l d l 锄p f o d u 舐锄眦a d d i l 0 删懈咖埘衄0 f 2 p 0 4 w 笛2 9 l _ 1a n d l 髓c 脚心越i o n w 鹊n 0 1 鼬m 柚0 3 吕l 1 t h e 唧o s i 6 0 no f 细如踟眦i 彻砌缸聆f i l e d j u r n 叩由位妞w 岫r s mw 瓠( g l 1 ) ：出u c e4 9 5 ，y e a s c 嘲蹦7 6 4 ，皿蛐0 3 2 l ( h 姻4 2 2 ，州h k 珊0 41 1 6 ；n 虻叫l a l ly i e l dw 龉2 5 0 3 班1 田9 5 hm 叩血n i 乃e d c u h 北m e d i u 驰s 蛐t o 也缸p i e d j 曲甜b y m o d d 1 1 1 eq 埘i 狮佃m 踟c e d 峙钉a mc 1 2 5 w 雒a s s o c i 砷甜p a n i a n y w c e n 目a w h t h e f 0 i m c r 搬o f q 蚵协向1 n e 丌t 商o n w 嚣1 0 9 a 棚1 i t l p 戤0 f c e u 可o w l l 卸dd i d n o t 印d u c e q n 哇胁p 0 舾a c c h 州d e t t l e 。d i sd dn o t 湖t t o p m d u c e c 曲a f i e r “锄l e r e d 嘲岫p h a s e ，咖ln i 啤l s o u 、燃a h 、o s te ) 出越l g 回。嚏 2 ) t h e0 p 白l a ic u i n j r ec o n d i i i o r i sf o rq d i n a 即d 删o n l e c t e db ys i r 叫e 风向幅懿p e i j i l l 俗、 臀a s f o u o 岍n g ：吐l ei n 。c u l u r na 寥a n dh 赋u l u h ls 函v 嘴靶l o ha n d1o v ，v 豫p 。甜v e l y ；廿抢o p t j l t m mc h a f 萨q 瑚n 畸 w a s1 0 0 。1 2 5 1 1 1 l c 叫t u 陀m e d i u m 缸5 l f l a 逝锄d t l e 叩t i f l l 帅t e m p e f 缸鹏3 0 钔d 蛐彤咖o n s 删，2 0 0 r p m ；“t i a lp h ，6 5 ；釉m e n 仨正o nd m e 、懈9 5 h p p e 锄d 豫po l i 峪e d 弱a 站酗n g d 豳i v e do 唧錾n 删垮i n tc 0 l 】1 d m o d 晦d i s s o l v e do ) 毋簪ni f l 妇向m 碰彻h 妯刹p f l d m o 幻q d l 锄p r o d u 嘶0 n b u th 2 q w 私u n 五拉e dt 0b e u s e da s a s s i s d n g d i s s o l v e d o ) 斜薛n 佗a g 朝l 1 1 砖郇l t i i t 】a l c 0 嘣6 0 芏l s f o r c u r d l a l l 讲o ( i l 蜘o n 州m r s m w a s ：m 。c u l u m a g e9 9 h ；加o c u l u ms 胁9 8 嘣v ) ；s h a k 盯m l 崩号p e e d2 0 8 r p m ：抽谴谢p h6 1a 1 1 dc d 矗l r e3 0 矗) r9 3 9 h c u r d l a l ld r o d u 甜o nr c h e d l l e m 删p o n 2 4 6 9 晷l _ 1 s i m i l a r t 0 廿陀r i l l t p t e d i 删b y m o d e l 1 t 皓o p c i m i 捌c 0 呷o s i 曲n o f c u t 眦m e d i u ma 1 1 d 吐砖。叫m 嘲c o n d 陋o n w e r e a d o p 矧幻p m d u c e q 州l r i a m3 7 l 蝴商s mf 嘶l e “时a n dc 0 “dc o r i 【n u et 0o 印m i z eu s i n g 铂ef b l l l l e rt 杈ma ss 瞄俯瞎p d i mt b e c o m e c c i o nk c w 。e nc u i d l 醐c o f l c 嘶呻a n dv i s c l o s 时o f 南m 他f i 僦i o nb 【0 1 、v e 犯s c l l d i e d 锄do 晰r l 。d t h em o d e l e q 嘣o n 吐l 砒u s e d 惦s 时o f 向1 t l e m 血0 nb r d i lt 0f b 嗽a s 【c u l d i a l lp ，d d u c c i o nd 晡n g 向m 哪叫o np p o c e s so f c u 棚a n p o l y s a c c h 鲥d e s o j t 、v a ss h p l e t o i n s p 。c t c u r d l a n p | d d 删o n 如d c o n h d l m e c u h c o 删0 1 1 s 0 f c u 坩l a l l 铀e m a l i o np m c c s s 3 1n w 笛f o u n d l l l 砸m e m o d0 f 甜1 a n o ip r e c - p i 倒0 na n d m e 【 湖0 f i d a l i ( a l i w 西右r 培t o i s o l a t e 廿1 e c n l d ec u 删a np o ly s = 戤枷d eb ya 1 1 a l 归甜a n dc o m p a r e dd i 丘蹦i n tm e 岫i d s t l e 叩6 m a le x 昀甜1 1 9t e c h n o l o 纠o f 饥j d ec u i d l a l lp 0 驴a c l 出崩d ew 船：p r e c i p t 雠e d3 血n e sw - 仇廿f o 】dv o l 咖e9 5 甜拼向mm e n l o do f e 吐1 黝j p r e c i p i t a d o n ；a d d e de q u a lv o l 咖el ms o d i 啪h ，d 删d e 协m a k e c o n c e n 龇i o no f s o d i 啪崎删d eu n d e ro 5 m ， 吐煳删删c e dp h t 07b y2 m h c l t 0p m c i p 砘a l ec m d e c u r d l a np o l y s a c c h 撕d e ，脚c e i 州船e d 赴a 1 1 de x 昀c t e d c u 删a n b y 甜1 0 1 t h es e 】 i l i _ p u 曲c dc u l d l 锄p o d y s a c c l l a l j d 郇a m p i ec d _ 2 ) w 鹊s e l 蝴删a f 时r e r i l o v i n gp n m i n mc m d e c 删a np o 蜘a 。吐甜池b y 嘶a g e 州湖n b 龆m p l ec 口3w a s 删矗e d 怕m 吐也p d 吣b y 洲咖啪 c 1 1 m 胧岫驴曲y o ns 印h a d e ) g - 1 0 0 觚ds e p i 】a d e xg - 2 0 0 1 h e 叫i y 0 f 廿l e 鞠r n p l ec d - 3w 鲢i d e l l 右五e db yn l e s 印h a d e xg - 2 0 0 ，姗d1 l e u 1 仃；埘0 l c t s p 。咖埘s h o 、v e d 衄廿i e 姗p l ec d - 3w a sau m q u e ，i 埘n p 印e o u s c o m p 0 懈惬t h es a m p l ea 阻3w 雒a 删t ep 0 础a 喇h a dp h y s i c a ja n dc l l 朗缸c a 】p r o p 鲥e so f d l e 砌r a i d c u r d l a l l p o l y 删葩 4 ) p a p c rc h m 】瑚l o i 尹即h y a n do x 砬岫蚵h 连由i o d i ca c - ds o d j 啪c 0 曲m 捌也缸廿硷c 【 s 锄p l e u 】a sa 1 ，3 茸u c 甜曲1h a ds i n g l e 唧n e r 】t 1 km o l e c u l a rw e g h to f 廿世c d 0s 锄p l ew 越4 5 7 0 0 d a l 如幢肌i n e db y s e p h 啪0 0c h 咖瑚1 0 争a p h ynw 如i l l u n l i 衄吲缸吐惋c d 0 涮l 叫eh a dn j p l 甜d i ) 【c o n f o m 斟加删u 虻a l l ( a l i s o h 蝣o n b y o m 印r e d t e s i ；l t w 越c e n i 蠡c 锄e d 也趾廿虻c 卜3 鞠n 悯e h a d m o l e c u l a r 曲啦眦o f 雠s i m d a r d c u r d l a n p o l y s a c c i l a l d eb ym ei n 翻捌甲，m ma n d 廿把n 咖删蜉剃c 麒咖船印；q 盯d j a l l 砌向印r s ) w a s p q 埘司b y m 哺0 do f l a w d e 舀姥o f s u b 蚯n 正o na n d 斟m 曲0 d ；c d r sw a sw 垃l u b ka 哪- 1w a ss h d w e d 幽罾d 叩a b s 0 删o n p e 呔a 1 1 d c h a 磁橱_ i s c i ca b 唧6 0 n p e a k o fb - d 不舍毒素，食溺爱全。嚣蘸，毫蠢建鼗舜笈的主要畜黄鞭 胶( 毗铂黼lg 哪) ，络冷胶( g u m ) ，可得兰( c u r d l 越1 ) 又h q 凝结多糖或热凝胶，右旋 葡聚糖( 强瓣麟) ，普蛰糖( 眦u l 撇 ，酵母多糖( 凝臌蜘) 键f “，德被国际食晶立法枫 撩，眵旷泛震骰食嚣豢勰裁褥激黧秘多糖迄今袭壹只帮莛暴骏、襞泠蔽黟q 辅垂 q 蝴 躺是耱隘蘩莓糖为缡搦肇元、戳嚣l ，3 * 糖菅键连按两成的巍镳蹶慧兰耪胞多 多糖 【l 删，与其它凝固剂( 如琼脂) 在加热厢经冷却才凝同成胶的性质谢所不同，c l h d l a n 可以在加 热时便形成凝胶，即 蔓谯温度稻予1 0 。对都不会融他，冷却后凝煅不变，因北称为热凝 蔽多蕤。这撩凝黢与葵它簸凝粼( 懿卡撼藏、鼗冷羧饕) 形或熬凝陂糖魄，裔许雾辨跨蘸挠疑 理毯犍簇。 强k 。呶化学工韭公司1 9 6 8 年开娥瞬究q 越媳生产及在食赫中的疲用。l 钟1 年w i k o 化学工监公蠲舞黝亍c n 琏必丈瓣摸艇产实验。飙l 鳃1 年孛袭开赡将渤麟躺皴为纯学试裁 推向市场。e u r d l 懿由韵啪au s a 公糊生产并以p 渊潮嘲l n 为商晶名加以推广。1 9 8 9 年后 q 嫡l a n 在融本、韩国铸国成为一种戴溪8 孽食品添办晴蝣丽褥要广泛的使题。1 9 9 6 年1 2 胃，美 鬓兹融a 经遗长羯熬蜜垒瞧及食鑫毒理学捡灏，涎鹱了e 醐瓣麓予食潞审燕安垒戆，舞羹 罐& g 辔椒律秀释纛蔌载港自日嫠麓予食螽酚蛹。热凝获嚣瑟薮髂为蓬继筵器骏、结冷蔽之 后第三个缎托a 批准的经发酵嫩产的食品用多糖一种新的食晶添加剂p 一。 l 产c 娃嬲i a 珏菌株斡磷突嚣程 i ，l产c t l 磁l 叠矗蘸撩簿发臻 1 9 6 4 冬，t o b 弘戏l 热d a 等人在筛选萄代谢番荸孛群豫材辩的徽生物辩从主壤中分离出拣 鼻蘸嘞黜：鲰糊拯硝+ 嘲粥妒帮( 1 麟 # 瑚。2 。窀磷蕊在l o 的乙烯基乙二酪为难碳源静 培养基，巴生长，可产生一种新型的含礴l 6 琥珀酸的静n l ，3 - 葡聚糖( 该多糖被称为琥珀酰 萄聚糖) 。避步的戆逸过程中又搿蚕g 变异墓株l 。c 3 醛埔，与其荣零蒺淤添瀚，该突变墓攘 主要产垒耱不含魏裁蘸揪熬窳不 窭程熬醪 多耱；该多耱霆参强l ，3 ，赣聚蘸。蠹予：这 种葡聚糖程勰热条件下麓形成凝腚，l 粕_ 箍d a 等入将其命名为热凝皎( 氏删a n ，啬译为可得兰) 。 1 2 产c u r d i a n 菌株的诱变 爨i 茭共矩黉 硕士学位论文可得兰多糖( c u r d j 丑n ) 发酵工艺及分子结构的研究 用n 一甲基n 一硝基n 一亚硝基腿、乙基甲磺酸或紫外线对l o c 3 k 菌株进行诱变后获得 另外一些胗 i 亡优良的o l i d l a n 生产蒯来，如舭嘶翠船廊僦，船卿娥8 船汹c 2 1 6 8 0 ) a 1 c 2 16 8 0 为尿嘧啶缺陷型菌株，可产生b 一1 ，3 葡聚糖。i a 、怕r d 和蹦j i p s 等人在对 艇c 2 1 6 8 0 菌株的限氮连续培养中分离得到一株高产的自发突变菌株a t c c 3 1 7 拶1 3 1 ， a r c c 3 1 7 4 9 是一个性状稳定的菌株，在斜面上经多次传代仍保持优良的产胶性能，与其自发 突变的亲本菌株相比，其生长不需要尿嘧啶胛j 。加昭c 3 1 7 5 0 是由 t ( ：c 3 1 7 4 9 自发突变产生 的菌株，该菌株只能产生不溶于水的c i 硼孤型葡聚糖，而突变亲本筋c 3 1 7 4 9 菌株可以产 生水溶和水不溶两种类型的多糖。1 独e d a 公司对1 0 c 3 k 菌株进一步的诱变得到能产生磷酸烯 醇丙酮酸羧基激酶的突变菌株。代表性的产c l 删a n 的菌株诱变世系见图1 1 。 a 1 c 8 1 l g e n e sf b e c a i i 3v b r ，m y x o g e n e sl o c 3 i p 0 i 3 7 i 4 ) 勋o d t 8 月8 0 岫用u t 日t j 。月j自发突变 t 肌，t 日t f o 月6 y 崩惭im n n g 诱变 自发突变f i 五再蚕= _ ：= ：了石寸w 诱变rr r f 0 j 3 1 4 c f a c 1 8 e 饼 a g r 。b t e n u msp b 1 。v l 弘一2 p i f o i 5 4 唧 a g r o b a c t e r l 埘? 轨b i a v a ri g 3 3 t i f 0 1 5 4 9 i ) f 围11 产c i i r d 劬代表莹棒的诱变世系 1 1l j n 嘲g eo r 仲p 峭朗扭帆s h 劬e f 打c u 删如p r o d u 嘶n 研究发现b d 一1 ，3 一葡聚糖能专地被苯胺蓝( 靛蓝) 染色岍。靛蓝可以与c l 砌l a n 型 葡聚糖络合形成蓝色的复合物，蓝色复合物的形成率依赖与聚合物的浓度与聚合度p ，；因此 这种检测方法为筛选产q d l a n 菌提供了简便的手斟1 4 1 。 2 c u r d l a n 的分子结构和理化性质 2 1b 1 ，3 - 葡聚糖 许多生物多糖结构各异，但在分类e 都属于8 1 ，3 葡聚糖类，这些糖的来源和结构差异 见表1 1 。化学和酶学分析都确定c u r d l 柚是由单一的d 葡萄糖以p 1 ，3 嘲结：键连接而成的 无分枝的均一多糖聚合例“，平均聚合度约为4 5 0 ，在o 3 h 心i a o h 溶液中的平均分子量在 5 3 0 0 0 啦_ 2 0 0 0 0 0 0 d a l 。之间【1 0 1 。 第2 页共7 6 页 塑鋈奎堂皇垒登兰兰墼 襄1 主链禽蒋一t 。3 键的糟聚繁 兰些! ：! 垒：堕竺鲤懋! ! 篓! 尘憋鐾兰竺型曼竺 一 一 来源分棱度平均分子量参考茹射c 作者 2 2 c u i 棚卸外观和溶解性 干燥固体c 删m 是种流动性良好的无臭、无味的白色或灰白色粉末固体，乳浊液加热 时会凝固，撵密封的聚乙烯袋中可长期稳定避绦存，不会失去凝狡 孥瞧糍。 囟硼a n 在求、醇秘大多数有梗溶荆巾不能溶解，德它在水中可以溯长，能在n a o h 、磷 酸三钠等碱性水溶液中溶解，也可以溶解予蚁酸、甲酸等酸性水溶液和二甲基亚砜中，通常易 溶解于能破甥；氢键的物质巾。水饱和尿紫或硫脲及2 5 蚓均碘化钾中也可溶解【8 】。 2 。3c 鞋游腿鹃| i 薅鸯 2 3 1c u r d k m 的初级缩构 c u l d l a n 魁在葡萄糖的c l 和岛位置以b 葡萄糖瞥键相连接而成的无分枝的8 。1 、3 葡聚 糖，其一级缩梅( 帮化学绪残构) 如图1 2 蹰裂磁，分予式戈( c l h l 融) 轴驴2 5 0 ，平均分 子量粼一l 啪，一散由褥5 0 0 个葡萄糖残鏊遂接丽成的c l 嬲拓m 就其有较强的热凝 胶的特性【7 州。 2 3 2c u m i a n 的高级绺梅 硬究撩邀表饔，q 蠢戳翡生貔活瞧麓结梅罄次削# 鬻密讶豹关系，特舅l 其三维螺旋豹高 级结构比初级结构在生物活性方面起更大的决定作用。耐单链螺旋结构又是形成凝胶时起决定 作用的多糖构型口3 ”。 c u 蝴飘主要班长链坎缝翰存在，毽凌予分子内部静攘互薅瓣每；予闻翡氢键缝合霹罄形 成更为复杂韵三维结榭8 。据报道c i 砖扛狲在碱性环境下的分子结构有三种构象：单镪螺旋结 第3 页共7 6 员 硕士学位论文可得兰多糖( c u r d j 蚰) 发酵工艺及分子结构的研究 构，三维螺旋结构和松散环状结构【。 1 曲鲥枷如删山a f 皿由啊 图1 2c q r d 岫的化学结构 f 唔1 0a 舢h i 如咖山o f c u r d h 在低浓度的n 扣h ( 0 1 n ) 溶液中，c u 栅a n 保持稳定的三维螺旋( 有序) 构象，但随着 氢氧化钠溶液的浓度升高，三维螺旋的解链程度也加强直至完全成为单链螺旋，在浓度大于 0 2 m 的n a o h 碱溶液中，c u r d l a n 完全溶解以松散的环状结构存在，但当n a 0 h 液被中和后， 则首先形成单链螺旋与三维螺旋相混的有序结构一沉淀聚合体形式“，之后c 删l a n 的构 像又逐渐回复为三维螺旋结构：s 舶等人所做的1 3 c 艄积研究结果与支持以上的结谢m 。在 o 1 m n a 0 h 溶液中螺旋结构依赖于c u i d l 锄的聚合度，聚合度在小于2 0 0 时随着聚合度的增加 c u r d l a n 更易形成有序的结 勾f ，只有高聚合度的q 耐l a i l 才能在加热时形成凝胶网。a t l d l l s 等 人对形成的凝胶用x - 射线衍射研究，发现当加热形成高强度胶时，分子构造由单螺旋或三螺 旋经脱水变为6 叠的三带分子】。 2 3 3 c u r d i a n 的显微结构 i a i nm 等人研究并借鉴阢a s a i k o 。”1 等人提出的c u r d l a i l 三螺旋结构的原子棍棒模型和 空间填充模型得到c u r d l 觚的显微结构。c 删a i l 显微结构可分为以下三类： 2 。3 3 1 c u r d k m 的颗粒构造 如图1 3 a 所示，c l m m a l l 微纤维由相互问不紧密的缭绕而形成的“油炸圈饼，状、有序 度不高的构造；c u n m 锄溶解于n a o h 溶液观察到的结构如f i 9 1 3 b 所示。与纤维素的结构相 似，三维螺旋问依靠氢键相互连接形成微纤维结构，而后微纤维结构也依靠氢键的相互连接成 为颗粒结构嘲，当氢键被破坏时颗粒结构也随之消失翰。 2 3 3 2 c u r d l 如凝胶的显微结构 如图1 4 所示，用不同方法制成的c u 础a i l 凝胶其结构也不同嘲。随温度的升高c l 删锄分 子间的疏水相互作用随之加强，9 5 凝胶的分子间联结在6 5 下制成的凝胶构造中观察不到 ( 如图1 4 b ) 吲；当n a o h 溶液的浓度从o 1 9 m 增到o 忽m 时也能发生这种分子结构的变化 刚。o 3 mn a o h 溶液中制成的c 删锄凝胶和在o 1 m n a 0 h 溶液中制成的。删l a n 凝胶相比， 第4 页共7 6 页 堂兰叁兰竺垒熬主兰堕 一 前者的凝胶结构的电镜照片中光纤构造猛增，表明随着n a o h 溶液浓度的升随，其破坏氢键 的能力也增强”l 。 圈1 。3a 1c u r d l 宣n 颗粒结构的显微照片b ) c u r d l a n 颗粒构造巍l n 豹氢氧纯钠辫浚中祷瓣过程艘置个黔段。 f 塔h 揩1 3 社 p 。h r 凶畦l 醵融m 耙$ p yo ft c l l 哺k “ g m n u k ( b ) t l i r 神蝴吖t i l e d 嘞i u t i o no f c u r d l a n i n l o m s o d i mh y d r o x 图l 。4x 射线原子配能法1 1 5 i 得到的c u r d h n 兰螺旋的 幽g m 辩甓分予模型a 墙蠲螬噻 童臻可褥兰蟾巍辆逢靛 联络方式 tb a 鞫逢鹈空闻填充饕型。 f 唔l 4c h e m x r mm o i 醮h i a rm 硼e ko ft h p ( f d h nt r ；p l e 打e “x 螽椎mx - 憎yi 幻m 轻a m r d i h a t 嚣f 1 瞿a ) s c k 蹦o d e i _ 弱s 婵姊壤攘鸭删e l d i a ) 粥、0 ，lm k 3 龇b ) 蛄、瓣n 艄e ) 醛、氇】m 啪n 弩1 5 l 口wm a 辨稿硼t 沁ni m a 孽瞒# ft i i ec u r d h “学畦 甜r u d n 他a 且t9 5 。cu s j n g0 1ms o d i u mh y d m x j 她b ) n t 9 铲c 心哩0 j m s o d i h 瑚h y d m x i d b c ) 8 t 6 s o c 吲n 9 0 1 m 则妇曲羽m 撼 瞄1 6 高倍龟镀下的可摒兰分子a ) 放大l o 0 储 的c u r d l a n 分子： b ) a l 圈的电脑增强固，q a 2 幽 瓣毫鏊壤强毽， f 1 曙u m1 6h 堍舡r e 鲫i u 如i m a g 嘴“t c u r d 辆n m 岫ka ) o r 骈n 曩ll m 雌幅( xl 帅n ，o ) b ) c o m p u 姗 姻h 朝喇i 搬8 孽e 时l b e 蠡r 或涵a g e l n f a c c o m 却t e r 棚轴删i 咖秘酊m 铀= o 瞄i 黜酗 2 3 3 3 c u r d l 鼗n 凝胶的超摄微结构 离分辨力宅子爨强镜照冀握冢簿趣熬e 醴魏努子稔造及葵分子 霹豹联缝方式，蛰强1 6 第5 贾共7 6 页 疆圭学位论文爵褥兰多耱 c h r d l 辩) 发酵王葱及分子蘸擒趣疆究 襞示。q 舶重强鹣霾定结构冒汪实q 桶瓣分子内存簌三螺凝结搀。辫l 毒与黟l 。6 中鑫鼋q 砖囊融 分子结构共有的三螺旋结构的相似性说明不管采用何种方法所带恪的q d i a l l 凝胶中都普遍存 在三螺旋结魏，并虽这糖三螺旋结搀是e l 粕l 雒凝羧熬主要缝穆。然嚣，鲡莲l j 园援示，在三 螺旋结构间在任意位点还有氢键以外的其它联结方式，这种联结方式可能是在三螺旋结构的解 链过稷残漫剪三螺旋续擒豹c l 嬲轻峨分予阗豹朝曩绛结过程中形裂e 邶日。 3c u 翻帔 3 。lc 狂癌粕凝黢的期备 干燥的c u r d i a i l 为白色或灰色的粉末状固俐7 暹l ，它具有独特的加热成胶的特性，簧得到符 合需要的q 痢l 黼凝胶w 以通过以下不同的方式。 3 1 1加热成胶 c l 棘k l n 加水均质磁力n 热处璎再冷却鬻3 0 g p 可形成固定凝胶强度的凝胶。实验表明， c t d l 鳓的悬浊液在不同的温度阶段形成的凝胶有不同的髋质。当q d i 趾的悬浊液加热温度 5 4 ，悬浊液会变得清澈透明；加热至6 0 随之冷却会形成凝胶，但这种凝胶是可逆的，加 热后可以融化，其强度较低，性质介予琼目鹭的脆憾辆明胶羽弹性之间，被称为低固定胶或低强 度胶( 1 0 w - s e t 萨1 ) ；在6 0 时继续加热，温度升躯8 0 以上后，溶液的透光性降低，逐渐 形成另一种不可逆性凝琵带鼬”，这种凝陂结梅坚实且有高弹性，& p 使自赜到1 2 0 也不会西餐 至液态，被称为高固定l 谶高强发胶( h “咖删g c l ) ，这种胶在冷冻和高温恭菌时稳菇磐m m 端 制t 继续加热至l o 融1 3 9 ，凝狡强度霹达8 0 瓣，且随着温度的上升，凝狡强度增加，并 且在8 0 以上延长加热时间也自使凝胶强赛增加。温度达1 4 0 - 1 6 ( ) ，凝胶迅速液化，可再 生成菇类强凌曼大的凝自馨8 癣蝴。 高阎定胶程1 4 0 _ 1 6 0 ，会遐速融化，融化潞度与q 删粗的浓度和聚食度有关：c u 硼a n 静浓度越惠，融佬疆度磁趣离：q 蛾懿聚合疫的拜离，融纯i 箍凄餐l 舞嵩。警融纪酶凝较溶液 重新冷却时，程1 3 6 变得浑浊，可重新形成另类强度聪大的凝胶，该凝h 雯在加热至1 8 0 嚣才会融纯瑟3 鹕强斓。 3 。1 2 透析翱中和成胶 q 避融戆溶簿于n a 潍溶液，形城瀵滋透骥懿溶滚，毽q 嬲翻融豹溅波麓汞透轿器雩，随 着碱浓度的降低，溶液会逐渐形成强度很低的凝胶；这种凝胶的形成过程可稽作q 删a n 溶解 予疆菠避程戆爱女妻 塑；巍一定滚发戆q 砖函碱性溶液孛嘉l 酸孛翘辩，獭l 酸懿溪多，瀵 澈的溶液逐渐变浑浊最终形成凝胶强度不大的凝腰3 毋。两种方法形成的c u r d l a l l 凝胶郄可重毅 溶织予碱溶滚巾骆船“7 1 。 3 1 3 添加离子成胶 诲多骏凝剡在加入一定豹盐潞滚时会形残凝狡躐改善凝狡兹强度。懿褥藻段夔蓉鬻离子豹 加入，溶 b 逐渐变稠并形成凝胶；卡拉胶加入钙离子时，形成凝胶的强度会增加。c u r d l a l l 在 第6 页共w 页 浙江大学生命科学学院 o 瑚6 3m 的二甲基亚砜或7 m 的尿素水悬浮液中冷却时，或向弱碱性溶液中加入c 矿，都会 形成凝胶。 3 2 c w 珊蛆凝胶强度的影响因素 3 2 1 温度对c u 棚蛆凝胶强度的影响 q d l 锄的水悬浊液通过加热形成的凝胶依据加热温度分为两种类型：加热到5 5 6 0 之 间冷却后形成低固定胶；加热到8 0 以上不经冷却而直接形成高固定胶嘲- 坤1 。低固定胶向 高固定胶转化温度是8 0 左右。高固定胶与低固定胶形成的分子机制也不相同【加】，高固定胶 是由q 】r d l 觚的微胶粒子通过互相铰链而形成的刚，这种微胶粒子是由多维螺旋链叨或三股三 维螺旋微粒田1 通过疏水相互作用而紧紧的联结在_ 起：而低固定胶主要是由单链螺旋分子通过 氨键联结形成的维胶粒子间的交叉联结而形成的。k a s a i 例等人提出退火模型解释高固定胶 的形成i 丑程：加热到8 0 以上时，c u r d l 锄凝胶发生不可逆的脱水，使三维螺旋更加紧密的互 相缠绕在一起，形成由以六根右手螺旋单链形成的六角形为结构单位而构成的重复长度为 1 8 7 8 a 的光纤维形成的三维螺旋晶体结树划。如果进一步在真空状态加热脱水，会使六股螺 旋单链形成的三维螺旋相互之间更加紧密的缠绕，光纤维的重复长度减少到5 8 7 a 嘲，从而使 形成的可得兰多糖凝皎更坚固，弹性更大。 3 2 2 浓度对c i 1 d i 柚凝胶强度的影响 c i 砌l 觚的浓度对凝胶强度也有影响。多糖浓度太1 氐( 小于2 ) ，则加热不能形成凝胶， 在一定浓度以上随着多糖浓度的增加，凝胶强度会有所提高：q d l 觚的浓度对形成凝胶时从 低固定胶( 热可逆凝胶) 向高固定胶( 热不可逆凝胶) 转化的温度也有影响，见表1 2 i 邸删。 f u m l i l i t 等人研究发现升高悬浊液的浓度在加热时使凝胶颗粒间的疏水相互作用增强，同时 减少凝胶中热可逆性的含量，从而耐氐低固定凝胶向高固定凝胶的转化温压m 。 c l m ，的嬲慨一竺坚! 竺型塑墅型 j 型一一墅竺 墅笙 ! 垫竺 l 7 3 2 6 5 1 8 6 21 2 7 】9 6 7 3 54 7 0 32 4 5 5 1 9 1 1 7 6 7 跗 4 3 6 3 7 3 5 1 7 6 4 1 9 6 0 5 4 6 1 9 印 2 1 5 6 “5 0 l 竺兰l型 型 第7 页共7 6 页 硕士学位论文可得兰多糖( c u r d i a n ) 发酵工艺及分子结构的研究 与琼脂在p h 小于4 5 的酸性环境中不能形成凝胶的性质不同，q i i d l a i l 在p h 3 9 5 的范 为内加热都能形成高固定胶，形成的凝胶在p h 为3 时强度最大p 1 ，随着p h 的继续增加，凝 胶强度几乎不变。当p h 高于1 0 时凝胶强度有所下降，p h 超过1 2 ，其水悬浮液就不在形成凝 h 妒”。 3 2 3 聚合度( d p n ) 对c u 删舳凝胶强度的影响 s 撕oh 等人研究表明：不同q m h 样品的聚合度在1 3 5 4 5 5 之间不等，这可能是由于 发酵条件的不同造成的。发酵过程的供氧及营养状况等发酵条件都会影响产生的c 删a i l 的聚 合度，从而影响c m 姐的凝胶质型嗍。q d l a n 凝胶强度随着c 删锄聚合度的变化而变化， 当聚合度小于5 0 时，c i | i d l a n 在水中加热不能形成凝胶；聚合度大于5 0 但是较低时，形成的 凝胶强度较小；随着叫l a n 聚合度的升高，其所形成的凝胶强度也增大嗣 3 2 4 共存成分和尿素对c u 删肋凝胶强度的影响 c u l d l a i l 可以与众多成分共存于同一体系中，无机盐、多元醇、有机酸盐等在低浓度下对 c m 锄形成的凝胶几乎无影响，但添加0 0 2m _ n a 2 b 4 0 7 可显著增强c u r d l 锄凝胶的强度| 9 】。 尿素浓度小于2m 时，c u 【d i a n 凝胶强度随着尿素浓度的升高而增大；当尿素浓度大于2m 时，c u i d l a n 的凝胶强度随着尿素浓度的升高而减少。c u r d l a n 形成凝胶的温度也随着尿素浓度 的升高而降低，当尿素浓度高于8m 时，可能是尿素破坏了凝胶的疏水键而不能形成凝胶。 另外，乙烯基乙二醇也是一种氢键促进剂，c u r d l 觚形成凝胶的起始温度会随其浓度的升 高而下降，但在其高浓度下c u r d l 锄凝胶也不能形成。这些结果说明：在形成凝胶的起始阶段， 部分或全部氨键断裂，然后通过疏水相互作用最终导致凝胶的形局拶。 3 3a h m 地形成凝胶过程中的结构变化 c 删a 1 1 的结构在固态时以三维螺旋的晶体结构存在郾”。c u i d l a l l 在2 5 、低浓度的n a 0 h 溶液中是有序的结构，在加热到6 0 时变为无序的结构 5 3 】；高浓度n a 0 h 溶液( o 0 5 m ) 中 c u r d l 锄的分子是多维螺旋的结 勾l 蜘，然而在低浓度的n a 0 h 溶液