（遗传学专业论文）小鼠血清糖蛋白质组富集及鉴定.pdf

讨论2 6结 仑2 6本研究创新性的自我评价2 8参考文献2 9附录3 4鉴定蛋白列表3 4综j 丕4 3在学期间科研成绩5 8致谢5 9个人简介6 0l61糖基化修饰疾病如：癌症、炎症反应和神经退行性疾病密切相关。糖蛋白成为疾病诊断、预后和对于药物治疗反应的重要靶标。现在得到广泛研究是n 连接糖蛋白和o 一连接糖蛋白。已经发现n 糖基化蛋白质与多种重要的生理过程密切相关( 如转化生长因子p l 信号通路和表皮生长因子信号通路等) ，n 糖蛋白的还与多种疾病，特别是癌症相关( 如肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等) 。越来越多的研究表明，监测某些n 一糖基化蛋白质的表达水平变化，较检测这些蛋白质的总体表达水平变化( 如a f p ) ，对疾病诊断具有更好的特异性和灵敏度。材料和方法一、实验对象：选用5 只c 5 7 小鼠血清混合进行实验。二、方j 去：对于糖基化肽段的鉴定之前关注的很少，本课题我们关注了n 糖基化位点血清的分析。对于糖肽富集主要采用肼化学和凝集素的方法进行富集鉴定实验。肼化学方法是基于肼化学试剂与固相支持物相连接，通过糖苷酶f 释放n 连接糖基化肽段。通过串联质谱鉴定目的肽段。我们应用此方法鉴定血清中分泌蛋白。结果我们是用固相萃取n 连接糖肽，是用串联质谱鉴定n 连接糖基化位点。该方法氧化成醛，它可以固定在一个固相支持糖肽的碳水化合物上。随着肼化学结合串联质潜分析，在9 3 个蛋白中鉴定到1 0 8 个糖基化位点。在本课题中，我们把重点方法大规模鉴定糖肽的方法学。这种方法被称作滤膜辅助的样品制备。用三种凝集素c o a ，w g a 和r c a l 2 0 联合富集。方法的原理是基于糖肽和亲和捕捉试剂的结合，在超滤管中进行蛋白的消化酶切。然后是由糖苷酶切去糖肽，是用串联质谱方法鉴定去糖基化肽段。本实验从小鼠血清中得到3 8 1 个非冗余糖基化肽段和3 1 9 糖蛋白。而且这些鉴定到的肽段全部严格含有n x i s 用x ( 其中x 为非脯氨酸) 序列，不含有n x c 或无意序列。结论本课题对于血清n 一糖基化位点进行深入鉴定糖蛋白质方法是分别使用凝集素和肼化学方法富集串联质谱。我们鉴定了4 2 3 个糖基化肽段和3 4 8 个糖蛋白，建立了小鼠血清糖蛋白表达谱。我们的策略有以下几个优点：( 1 ) 高效的糖蛋白富集策略是鉴定血清中糖蛋白重要方法。( 2 ) 本研究建立的规模化精确鉴定n 一糖蛋白质的策略对发现肿瘤标志物具有重要的应用价值，同时为糖蛋白质组的生物信息学研究提供了宝贵的基础数据集。关键词糖蛋白质组；质谱；凝集素；肼树脂；血清2英文摘要论著e n r i c h m e n ta n di d e n t i f i c a t i o no fm u r i n es e r u mg l y c o p r o t e o m ei n t r o d u c t i o ng l y c o s y l a t i o ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta n dc o m m o nf o r m so fp r o t e i np o s t - t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o nw h i c hi si n v o l v e di nm a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sa n db i o l o g i c a lp a t h w a y s a l t e r e dg l y c o s y l a t i o nh a sb e e na s s o c i a t e dw i t hav a r i e t yo fd i s e a s e s ，i n c l u d i n gc a n c e gi n f l a m m a t o r ya n dd e g e n e r a t i v ed i s e a s e s g l y c o p r o t e i n sa r eb e c o m i n gi m p o r t a n tt a r g e t sf o rt h ed e v e l o p m e n to fb i o m a r k e r sf o rd i s e a s ed i a g n o s i s ，p r o g n o s i sa n dt h e r a p e u t i cr e s p o n s et od r u g s t h em o s tc o m m o na n dw i d e l ys t u d i e df o r m sa r en - l i n k e da n do l i n k e dg l y c o s y l a t i o n n - g l y c a n sa r ei n v o l v e di nav a r i e t yo fb i o l o g i c a lp r o c e s s e s ( 1 i k et r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 31a n de p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rs i g n a l i n gp a t h w a y s ) ，a n dp a t h o l o g i c a lp r o c e s s e s ( 1 i k el i v e rc a n c e r , p a n c r e a t i cc a n c e r , l u n gc a n c e r ，o v a r i a nc a n c e ra n dp r o s t a t ec a n c e r ) t h en g l y c o s y l a t i o np a t t e m so fg l y c o p r o t e i n s ，s u c ha sa f p , h a v eb e e nr e p o r t e dt os e r v ea sm o r es e n s i t i v ea n ds p e c i f i cb i o m a r k e r st h a nt h e i rt o t a lr e s p e c t i v ep r o t e i nl e v e l s s u b je c t sa n dm e t h o d s1 ，s u b je c t s ：w ec h o o s ef i v ec 5 7m o u s es e r u m 2 ，m e t h o d s ：w i t hr e s p e c tt ot h e i rg l y c o s y l a t i o ns i t e s ，l i t t l ea t t e n t i o nh a sb e e np a i d h e r e ，w er e p o r tt h ea n a l y s i so fn - g l y c o s y l a t i o ns i t e so ns e r u m f o rt h ee n r i c h m e n to fg l y c o p e p t i d e s ，c a p t u r em e t h o d sw i t hl e c t i na n dh y d r a z i d ec h e m i s t r y ( h c ) w e r eu s e dc o m p l e m e n t a r i l y i ti sb a s e do nt h ec o n j u g a t i o no fg l y c o p r o t e i n st oas o l i ds u p p o r tu s i n gh y d r a z i d ec h e m i s t r ya n dt h es p e c i f i cr e l e a s eo ff o r m e r l yn l i n k e dg l y c o s y l a t e dp e p t i d e sv i ap e p t i d e - n - g l y c o s i d a s ef ( p n g a s ef ) t h er e c o v e r e dp e p t i d e sa r et h e ni d e n t i f i e da n dq u a n t i f i e db ym s m s r e s u l t sw ed e s c r i b eap r o t o c o lf o rs o l i d - p h a s ee x t r a c t i o no fn - l i n k e dg l y c o p e p t i d e sa n d3s u b s e q u e n ti d e n t i f i c a t i o no fn - l i n k e dg l y c o s y l a t i o ns i t e s ( n g l y c o s i t e s ) b yt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y t h em e t h o do x i d i z e st h ec a r b o h y d r a t e si ng l y c o p e p t i d e si n t oa l d e h y d e s ，w h i c hc a nb ei m m o b i l i z e do nas o l i ds u p p o r t i nas i n g l ea n a l y s i s ，t h em e t h o di d e n t i f i e sh u n d r e d so fn l i n k e dg l y c o p r o t e i n s ，t h es i t e so fn - l i n k e dg l y c o s y l a t i o n w i t ht h eu s eo fh y d r a z i d ec h e m i s t r y ( h c ) i nc o m b i n a t i o nw i t hn a n o l c e s i m s m sa n a l y s i s ，10 8d i f f e r e n tg l y c o s y l a t i o ns i t e sw i t h i n9 3u n i q u eg l y c o p r o t e i n sw e r ei d e n t i f i e de x p e r i m e n t a l l y i n t h i ss t u d y , w eh a v ef o c u s e do n at e c h n i q u ef o rl a r g e s c a l ei d e n t i f i c a t i o no fn g l y c o p e p t i d e sf r o mac o m p l e xs a m p l e t h ea p p r o a c h ，t e r m e d f i l t e ra i d e ds a m p l ep r e p a r a t i o n ( f a s p ) 一b a s e dm e t h o d ，i sb a s e do nm u l t i p l el e c t i n ss u c ha sc o a ，w g aa n dr c a l 2 0 w er e a s o n e dt h a tf a s pc a nb ec o m b i n e dw i t hp e p t i d ea f f i n i t yc a p t u r es i m p l yb ya d d i n ga na f f i n i t yr e a g e n ti n t h i sc a s el e c t i n ，t ot h et o po ft h ef i l t e ra f t e ro n f i l t e rp r o t e i nd i g e s t i o n f o rt h en e x ts t e p g l y c o p e p t i d e sw e r ee f f i c i e n t l yd e g l y c o s y l a t e db yp n g a s ef t h er e l e a s e dp e p t i d e sa r ee l u t e d ，w h i c hr e s u l t e di nap e p t i d ep o p u l a t i o no fh i g hp u r i t y t oi d e n t i f yd e g l y c o s y l a t e dp e p t i d e s ，w eh a v eu s e dl c m s m so nl t qa n do b t a i n e d381g l y c o p e p t i d e sa n d319g l y c o p r o t e i n sf r o mt h em o u s es e r u m t h es i t e sa l m o s ta l w a y sh a v et h en - x 一 s f f 一x ( w h e r exi sn o tp r o l i n e ) b u tn o n eh a st h en - x cm o t i fo rn o n c o n s e n s u ss e q u e n c e s o u rm e t h o di n d i c a t e dt oa n a l y z eg l y c o p r o t e i n si nt h es e r u mi sap o w e r f u la p p r o a c hf o ri d e n t i f y i n gp o t e n t i a lc a n c e rb i o m a r k e r s c o n c l u s i o nw er e p o r ta ni n - d e p t hi d e n t i f i c a t i o no fn - g l y c o s y l a t i o ns i t e so ns e r u mu s i n gac o m p l e m e n t a r yp r o t e o m i ca p p r o a c hw h i c hs e p a r a t e l yu s e dl e c t i na n dh y d r a z i d ec h e m i s t r y ( h c ) f o rg l y c o p e p t i d ee n r i c h m e n t ，f o l l o w e db yn a n o l c e s i - m s m sa n a l y s i s w eh a v eu s e dl c m s m so nl t qa n do b t a i n e d4 2 3g l y c o p e p t i d e sa n d3 4 8g l y c o p r o t e i n sf r o mt h em o u s es e r u m g l y c o s y l a t i o ns t a t u so fm u r i n es e r u mw a si n v e s t i g a t e do u rs t r a t e g yh a ss e v e r a la d v a n t a g e s ：( 1 ) t h eu t i l i t yo fn g l y c o p r o t e o m i cs t r a t e g yi sag r e a tw a yt op r o f i l et h eg e n u i n e l ys e r u mp r o t e i n s ( 2 ) t h u st h i ss t u d ye n l i g h t e n sp r o m i s i n gf o rl a r g es c a l ed e t e r m i n a t i o no fn g l y c o p r o t e i n sa st h eb i o m a r k e rp a n e l sf r o mc l i n i c a ls a m p l e s ，a n dar a r ed a t a s e ti sa l s op r o v i d e df o rb i o i n f o r m a t i cr e s e a r c ho fg l y c o p r o t e o m i c s k e y w o r d sg l y c o p r o t e o m e ；l c - m s m s ；l e c t i n ；h y d r a z i d er e s i n ；s e r u m4英文缩写词对照表英文缩写a f pa s nb c ac i dc o nad ad t tf u cg a lg l cg l c n a ch p l cm sp a g ep b sp hp n g a s e fr p ms d sw g a英文名称a l p h a f e t o p r o t e i na s p a r a g i n eb i c i n c h o n i n i ca c i d中文名称甲胎蛋白天冬氨酰二喹林甲酸c o l l i s i o ni n d u c e dd i s s o c i a t i o n碰撞诱导碎裂c o n c a n a v a l i nad a l t o nd i t h i o t h r e i t o lf u c o s eg a l a c t o s eg l u c o s e刀豆a道尔顿二硫苏糖醇岩藻糖半乳糖葡萄糖n - a c e t y l g l u c o s a m i n e sn 一乙酰葡萄糖胺h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y高效液相色谱m a s ss p e c t r o m e t r y质谱仪p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚丙烯酰胺凝胶电泳p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n ep o w e ro fh y d r o g e np e p t i d e - n - g l y c o s i d a s efr o t a t i o np e rm i n u t es o d i u md o d e c y ls u l f a t ew h e a tg e r ma g g l u t i n i n5磷酸盐缓冲液酸碱度糖苷酶f每分钟转数十二烷基硫酸钠麦胚凝集素论文小鼠血清糖蛋白质组富集及鉴定i 上j -刖吾蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰。至少5 0 的蛋白质存在糖基化。糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响，如透明带糖蛋白z p 3 可影响卵子与精于的结合，其糖链是精一卵结合的“牵线人”；免疫系统中几乎所有的关键分子均为糖蛋白，免疫球蛋白糖链异常是自身免疫疾病的“元凶 ”。蛋白质糖基化修饰的异常在其它疾病、尤其是肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程中也是“罪魁祸首”1 3 1 0 另一方面，细胞表面的糖链对于细胞内外的物质交换、信息的转换与交流、以及细胞问的通讯起着重要的作用，是细胞生命活动中细胞识别的探测器和细胞粘合的连接杆。糖基化蛋白质参与几乎所有重要的生命过程如受精、发育、免疫应答、细胞通讯、细胞凋亡等 4 - 7 1 0 糖链的组成和结构对糖基化蛋白质的构象、功能以及与其它分子的相互作用都具有巨大的影响 8 - 9 1 0 因此，对于糖蛋白的研究具有十分重要的生物学意义和临床应用价值。大多数哺乳动物分泌的膜结合蛋白含有共价连接的聚糖结构 1 0 1 。蛋白质的糖基化位点具有高度的特异性，在各种细胞类型和生理状态下基本稳定。然而，在癌症，炎症和神经退行性疾病中，蛋白质糖基化形式的改变可显着影响细胞的信号通路和细胞进程。这类疾病可能涉及的糖蛋白改变包括以下方式：1 ) 蛋白糖基化水平过低或过高，或产生新的糖基化形式；2 ) 涉及糖基化的碳水化合物发生改变。事实上，糖基化形式的改变被认为是癌症发生、发展的重要标志。重要的糖蛋白常涉及肿瘤的发生和转移 1 1 - 1 4 1 。敏感地检测这种糖基化的改变可为发现特异的糖蛋白作为诊断和预后的标记物提供一个独特的途径。此外，干预糖基化和碳水化合物相关的细胞途径可为癌症治疗提供一个新的策略 1 5 - 1 7 1 。美国f d a 已批准一系列糖基化蛋白质或蛋白质复合物作为痛症的生物标志物1 8 1 0 糖链的组成和结构对糖基化蛋白质的构象、功能以及与其它分子的相互作用具有巨大的影响【1 9 删。许多疾病已被发现与糖基化蛋白质的特定糖型变化相判2 1 乏3 1 ，因6用。蛋白质的n 糖基化形成主要经过三个步骤：1 ) 脂连接前体寡糖的形成；2 )寡糖整体转移至多肽；3 ) 寡糖的加工。在加工过程中，通过不同的糖苷酶作用，会去除一些原有的糖残基，并在糖链非还原端添加新的糖残基。脂连接前体的合成、寡糖整体向蛋白质转移和寡糖的初始剪切均发生于粗面内质网，之后的加工发生在糖基化蛋白质通过高尔基体的迁移过程中【2 5 1 。一般情况下，n 糖基化的形成需要具备三个条件：1 ) 在蛋白质一级结构中，天冬酰胺必须处于特异的a s n x s e r t h r c y s 序列中，其中x 为除脯氨酸外的其它氨基酸残基【2 6 】；2 ) 在蛋白质的三维结构中，n 糖基化必须发生在蛋白质表面适当的位置，而不能埋藏在蛋白质内部；3 ) 必须出现在j 下确的细胞分区，n 糖基化反应仅起始于糙面内质网腔内。启动n 连接糖基化合成的供体是g l a c 3 m a n 9 g l c n a c 2 结构，通过焦磷酸连接键与脂质多萜醇结合。脂质多萜醇是由五碳异戊二烯单位缩合而成，多萜醇中的单位组装是端部对端部，不形成环，并插入内质网的脂质双层中。脂质多萜醇头部基团上的聚糖的组装分两步进行。第一步发生在内质网膜的细胞质侧面，第二步发生在内质网腔内。催化两个n 乙酰氨基葡萄糖( n a c e t y l g l u c o s a m i n e s g l c n a c ) 残基和五个甘露糖残基结合所需要的酶，直接利用核苷酸糖供体鸟苷二磷酸( u d p ) n 乙酰氨基葡萄糖和鸟嘌呤核苷二磷酸( g d p ) 一甘露糖，之后脂质体连接的这个聚糖结构进行跨膜异位，而进入内质网腔中。在内质网腔环境中，新的糖残基继续添加，共添加四个甘露糖残基和三个葡萄糖残基。这些单糖残基的供体是多萜醇与单糖残基化合物。这些化合物是脂质多萜醇磷酸与鸟苷二7磷酸葡萄糖或鸟嘌呤核苷二磷酸一甘露糖在内质网的胞质表面上合成产生的，并易位进入内质网腔。最后的脂连接前体寡糖含有两个n 乙酰氨基葡萄糖残基，九个甘露糖残基和三个葡萄糖残基。脂连接前体寡糖将含有1 4 个糖残基的寡糖转移并与蛋白质的天冬氨酸残基连接的过程发生在内质网内侧( n 糖肽键是由1 3构型的n 乙酰氨基葡萄糖与天冬酰胺的y 酰胺n 原子共价连接形成的) ，并对寡糖继续进行加工。首先由葡糖营酶i 和葡糖苷酶i i 去除木端三个葡萄糖残基，再经甘露糖苷酶的一系列作用，清除掉q 一1 ，2 糖苷键连接的某些或全部4 个甘露糖残基，此时剩余两个n 乙酰氨基葡萄糖残基及五个甘露糖残基。加工过程在内质网开始，在高尔基体中继续。最终，n 糖链一般含有1 5 个左右的糖残基，常见的糖残基有n 乙酰氨基葡萄糖( g i c n a c ) 、甘露糖( m a n n o s e ，m a n ) 、葡萄糖( g l u c o s e ，g l c ) 、岩藻糖( f u c o s e ，f u c ) 、n 乙酰神经氨酸( 唾液酸，s i a l i c a c i d ，s a ) 、半乳糖( g a l a c t o s e ，g a l ) 等。所有的n 糖链都含有一个共同的结构，称为五糖核心。根据外周糖链的结构组成及其与非还原端甘露糖残基的链接方式，n 糖链可分为三类，( 1 ) 复杂型，这类n 糖链除五糖核心外不含其它甘露糖残基；( 2 ) 高甘露糖型，此类糖链除核心五糖外只含甘露糖残基；( 3 ) 杂合型，此类同时具有前两种糖型的结构元件【2 7 1 。以复杂型为例，其构建过程是在两个n 乙酰氨基葡萄糖残基及五个甘露糖残基的基础上，首先是通过位于高尔基体的n 乙酰氨基葡萄糖转移酶i 将一个n 乙酰氨基葡萄糖残基与末端甘露糖结合，之后再通过甘露糖苷酶，去处另外一个木端的两个甘露糖残基，然后，n 乙酰氨基葡萄糖残基及其它糖残基由不同的糖基转移酶，如半乳糖转移酶( g a l a c t o s y l t r a n s f e r a s e ) 、唾液酸转移酶( s i a l y l t r a n s f e r a s e ) 添加。其中两天线( b i a n t e n n a r y ) 糖型最多见，三天线( r i f t a n t e n n a r y ) 和四天线( t e t r a a n t e n n a r y r n n )糖型也比较常见【2 8 1 。1 9 9 4 年，澳大利亚m a c q u a r i e 大学w i l k i n s 和w i l l i a m 首先提出了蛋白质组( p r o t e o m e ) 的概念，指一个细胞或组织的基因所表达的全部蛋白质。蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 旨在阐明生物体中全部蛋白质的表达模式和功能模式，目前主要研究内容包括规模化的蛋白质鉴定、蛋白质翻译后修饰的检测、蛋白质表达量的变化、空问结构、相互作用等。如此复杂和广泛的研究目标，对研究技术提出了极高的要求。就蛋白质组学的基础表达谱的研究来说，目前所有的分析手8段均无法从整体水平规模化鉴定蛋白质，因此只能采取将蛋白酶切为肽段，依靠质谱对特有肽段的检测间接实现蛋白质鉴定，也就是通常所说的“由下而上( b o t t o mu p ) 策略。然而，即使是肽段水平的鉴定，仍然对分离富集技术、质谱分析技术、生物信息学检索技术有着相当高的要求。蛋白质组学概念从提出到现在已有1 5 年，针对不同的研究样本和研究目的，蛋白质组学研究的方法和策略表现出越来越专门化的发展趋势。在糖蛋白质组的研究中，科学家们已丌发出多种富集技术，使糖基化蛋白质及微量的肽样本可以从复杂体系中得以集中，从而提高糖基化蛋白质的鉴定规模。目前的富集技术主要包括凝集素法【2 9 - 3 0 1 、酰肼化学法【3 1 3 3 1 、硼酸化学法【3 4 。3 5 】、亲水色谱澍3 6 - 3 7 1 ，体积排阻法等【3 8 1 ，其中以自i 两种应用最为广泛。凝集素是动物细胞或植物细胞合成分泌的、能与糖结合的蛋白质，不同的凝集素可结合的糖结构不同，如伴刀豆凝集素( c o n c a n a v a l i na ，c o na ) 对甘露糖有特异的亲合作用、麦胚凝集素( w h e a tg e r ma g g l u t i n i n ，w g a ) 对n - 乙酰氨基葡萄糖有特异的亲合作用等，因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基，样品可依次通过不同凝集素进行分类富集。另外，已有商品化的特定结构糖链的抗体，对糖基化蛋白质进行抗体亲和纯化，如应用n 乙酰氨基葡萄糖的抗体对含有o 连接n 乙酰氨基葡萄糖的糖肽或蛋白质进行富集。这种方法能够针对性地研究含特定糖链结构蛋白质或肽段。因此可用来富集糖基化蛋白质和糖肽。酰肼化学法是使用含有肼的化学材料与氧化后的糖残基上的顺势邻位羟基产生的醛基( 氨基酸残基上无此机构) 共价结合，从而达到从复杂体系中提取含糖结构蛋白质或肽段的目的。硼酸化学法同样是利用糖残基上的顺势邻位羟基与硼酸发生可逆的共价反应而完成富集，但是硼酸化学法的特异性和灵敏性较酰肼化学法为差。亲水色谱法则是根据糖基化肽段的亲水性强于非糖基化肽段的原理，将其相对分离富集。目前最大规模的血浆糖基化修饰谱是通过肼化学法完成的，体现出这种方法的特异性和灵敏度的优势【3 3 1 。但是酰肼化学法有一个致命的缺点，就是会不可逆地破坏糖结构，以至无法获得任何糖结构信息。凝集素是通过非共价键与某种糖结构结合，在一定程度上可以提供糖型信息，因此成为目标糖蛋白质组学研究主要采取的富集手段。但是，凝集素富集的特异性并不理想，9对最终鉴定结果的可信度有很大影响【”】。而其它富集方法的应用报道较少，所得结果的鉴定规模也比较有限。完整的糖基化蛋白质的鉴定信息应包括三部分，分别是蛋白质的身份、糖基化位点信息和相应糖链结构信息。但是，对于同时包含此三部分信息的最小单位糖肽，其质谱鉴定具有巨大的困难。因为，一个典型的n 糖链一般含有7到2 5 个单糖残基( 约含6 种单糖) ，而每两个单糖残基之间的连接就有8 种之多。呈分支状连接的糖链在理论上可形成的一级结构类型将是一个天文数字。与之相比，由氨基酸残基组成的线性结构的多肽可形成的一级结构数只是小巫见大巫m 】。可想而知，想将如此复杂的糖链加上肽段所形成的糖肽做到类似普通肽段那样的大规模质谱鉴定在目前的技术水平下是完全不可能的。这些困难迫使大部分糖蛋白质组学研究舍弃了糖链信息。在目前通用的研究策略中，富集到的糖肽上的糖链将被n 糖苷酶酶切去除。酶切之后，n 糖基化位点的天冬酰胺将转变成天冬氨酸，从而在质谱上发生0 9 8 4 0 d a 的质量增加，并利用这个质量增加作为去糖基化的标志。在质谱检测完成后的数据库检索中，此质量增加作为可变修饰来确定糖基化位点【3 3 1 。也就是说常规的糖蛋白质组学研究技术只能提供蛋白质的身份和糖基化位点信息。而丢失的糖型信息却往往是导致蛋白质功能改变的重要因素，如本文所研究的n 糖基化蛋白质的核心岩藻糖化。但是，只有直接鉴定糖肽同时全面含有糖链信息与蛋白身份的最小分析单位，才能够提供最有力、最为全面的糖基化蛋白质信息。科学家对糖肽规模化质谱分析的探索研究一直在进行中，但至今仍没有突破性的进展。蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，不仅与细胞粘附相关而且通过特殊的蛋白改变重要生理功能【4 卯。蛋白质糖基化尤其是n 一连接的糖基化在蛋白中是很普遍的，而且分泌到外环境中去【4 6 1 。另外非正常的糖基化也和肿瘤癌症的侵袭相关【4 7 】。但是选择性的糖肽分析是现在阶段的主要研究重点，对于蛋白质糖基化位点的确定用现在蛋白质组技术是可行的。这主要是糖基化位点是n x s t 序列基序，其中x 可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。通过对已知的基序可计算出潜在n 糖基化位点。n 连接的糖蛋白主要见于细胞外，包含n x s t 序列基序【4 引。这提示现有的蛋白质组技术可以应用高效液相色谱和串联1 0质谱的方法来高通量的鉴定n 连接糖蛋白。通过减少每次质谱检测的肽段数量，可以提高特异性和敏感性。z h a n g 3 2 4 8 。5 0 1 等人通过固相支持的方法来富集n 连接的糖肽，取得了不错的效果。其原理主要是应用肼富集来收集糖肽和糖蛋白，用色谱柱为固相支持物来收集富集到的糖蛋白。通过去盐，洗脱，最后进行质谱鉴定。作者共鉴定了3 0 0 肽段。上述方法从血清、细胞、组织中均能高效地鉴定糖蛋白。此外，用标准蛋白对糖富集过程的每一步进行质量评估，也为反应平台和质量体系的鉴定起到了很好的效果。上述方法从小鼠血清中也同样能够鉴定出n 连接的糖蛋白，且效果很好。说明这种富集方法可以大范围推广。在鉴定的过程中，可加入1 8 0稳定同位素标记对糖蛋白的肽段进行半定量和绝对定量。杨艽原等人【5 1 1 利用不同的凝集方法，即亲水亲和和肼化学法对肝细胞癌样本进行了测定，共获得3 0 0 个不同的糖基化位点，其中，1 9 4 个糖蛋白和1 7 2 个糖基化位点首次得到确认。研究提示，对于糖肽的选择肼化学法优于亲水亲和法，而亲水亲和法凝集比较好。研究者在d n a 测序的基础上通过辅助荧光糖电泳，对非酒精性脂肪肝患者的糖基化水平进行了检测，发现血清中的多聚糖可作为早期诊断非酒精性脂肪肝和非酒精性肝硬化的生物标记物，诊断的敏感性达到8 9 5 ，特异性达到7 1 41 5 2 1 。氨亚自剂自保灵曼公司；蛋白酶抑制剂c o c k t a i l 购自r o c h e 公司；w g a ，c o a ，r c a l 2 0 购自s i g m a ；其它化学试剂购白军事家医学科学院条件处，均为分析纯。二、主要仪器设备纯水仪( m i l l i p o r e 公司) ；高速低温离心机( h e r a e u s 公司) ；5 8 1 0 r 冷冻型离心机( e p p e n d o r f 公司) ；m u t i s k a nm k 3 酶联检测仪( t h e r m o 公司) ；g s 7 1 0分光光度计( b i o r a d 公司) ；纳升级高效液相色谱l c p a c k i n g 系统( d i o n e x 公司) ；电喷雾毛细管柱( b i o b a s i c c 1 8 ，5 肛m ，7 5 肛mi d x1 0c m ，1 5l a mi d s p r a yt i p ，n e wo b j e c t i v e 公司) ；高效液相色谱线性离子阱质谱仪l t q - m s ( t h e r m of i n n i g a n t m 公司) 。三、血清制备用左手抓取小鼠颈部皮肤，取侧卧位将其轻压在实验台上，左手拇、食指尽量将动物眼部皮肤向颈后压，使动物眼部充血突出，以弯头镊央去眼球，并将鼠倒置，使血液流出。血清制备首先将采集的血液样品置室温半个小时，待血液凝固后2 0 0 0 3 0 0 0 分离心5 1 0 分钟，上清液即为血清；如离心后有轻微溶血，用牙签将血凝块挑出，将混有红细胞碎片的血清再次离心，用干净吸管收集血清于干燥的e p 管中，贴上标签备用。5 只c 5 7 小鼠分别取血，制备血清然后混合5 只小鼠的血清，分装8 0 。c 冻存。所有对实验动物的操作程序符合军事医学科学院道德委员会的规定。1 2b1 2 53 7 5c3 2 53 2 5d1 7 51 7 5 b 液e3 2 53 2 5 c 液f3 2 53 2 5 e 液g3 2 53 2 5 f 液h4 0 01 0 0 g 液i4 0 00( 二) 蛋白定量方法：9 6 孔板检测步骤( 样品一般稀释十倍)1 、每个孔加入1 0pl 样品和b s a 。2 、再依次向每个孔中加入2 0 0l al 的工作液。3 、3 7 。c 孵育3 0 分钟。4 、冷却至室温。5 、在酶标仪中，5 9 5 n m 检测数值。五、实验方法( 一) 肼化学方法富集l 、试剂配制1 3理足在碱性条其吸光值与蛋即可计算待测、，操作简单。如沁巧50湖咖瑚湖拗协筋。1 r a p i g e s t8 现用现配( 9 ) 0 5 m g 胰酶2 、实验步骤( 1 ) 在1 0 0l al 裂解液中加入l m g 蛋白( 2 ) 加入1 0 0 u1 三氟乙醇变性蛋白( 3 ) 加入2 0 0 ul2 5 0 m m 碘乙酰胺室温孵育3 0 分钟( 4 ) 加入l m l5 0 m m 碳酸氢铵，使三氟乙醇的浓度降低到1 0 以下移去5ul 上清液( 5 ) 加入0 5 m g 胰酶，3 7 。c 轻摇，孵育4 小时( 6 ) 除盐，使用除盐柱脱盐，然后冻干7 8 0l al 富集缓冲液溶解冻干肽段，加入2 0hl5 0 m m 高碘酸钠，4 。c 轻摇l 小时。( 8 ) 蛋白孵育过程中，准备5 0 ul 肼树脂，用l o 倍体积水洗脱肼树脂。离心5 分钟，3 0 0 0 9 ，2 0 。c ，重复一次。( 9 ) 混合肽段脱盐，l m l 洗脱液直接加入到沈脱完毕的肼树脂中，室温下轻摇1 0 个小时( 1 0 ) 去除非结合肽段，每次沈脱液分别加入7 0 0l al 洗脱液，重复3 次1 5 mn a c ih 2 01 0 0 m m 碳酸氢铵( 1 1 ) 加入1 0 0l al1 0 0 m m 碳酸氢铵( 1 2 ) 加入3ulp n g a s e f 轻摇3 7 。c 孵育过夜( 1 3 ) 离心1 0 0 0 9 ，5 分钟保留上清1 43 0 0 0 9 ，5 分力流干，重复( 2 1 ) 冻干样品，等待质谱检测。( 二) 凝集素富集糖肽1 、蛋白消化( 1 ) 向3 0 k d 的超滤管中加入2 0 0 ulu a 和2 0 0 4 0 0 u 甙含o 2 m g 的蛋白) ，在热混合器中以5 5 0 r p m 混合l m i n ，1 4 ，0 0 0 9 离心1 5 m i n 。( 2 ) 向超滤管中加入2 0 0pl 的u a ，1 4 ，0 0 0 9 离心15 m i n 。( 3 ) 去掉收集管中的滤液。( 4 ) 加入1 0 0u1i a a 溶液，在热混合器中以5 5 0 r p m 混合l m i n ，黑暗中孵育2 0 m i n 。( 5 ) 将超滤管以1 4 ，0 0 0 9 离心1 0 r a i n 。( 6 ) 向超滤管中加入1 0 0ulu a 溶液，以1 4 ，0 0 0 9 离心1 5 m i n 。重复该步骤两次。( 7 ) 向超滤管中加入1 0 0 pla b c 溶液，以1 4 ，0 0 0 9 离心1 0 m i n 。重复该步骤两次。( 8 ) 把超滤管转移到新的收集管中。( 9 ) 向超滤管中加入2i lg 的胰酶，在热混合器中以5 5 0 r p m 混合1 m i n 。( 1 0 ) 在恒温水浴箱中3 7 0 c 酶切过夜。( 1 1 ) 将超滤管以1 4 ，0 0 0 9 离心1 0 m i n 。( 1 2 ) 向超滤管中加入4 0 u1 的1 x b b ，将超滤柱以1 4 ，0 0 0 9 离心8 m i n 重复该步骤一次，收集滤液，转移到1 5 m l 的e p 管中。d 的超滤管中，向含肽段的超滤管中加入3 8ulplr c a ) ，在热混合器中以5 5 0 叩m 混合l m i n ，心1 0 m i n 。11 x b b 并且以1 4 ，0 0 0 9 离心8 m i n ，重复该步骤11 x b b 并且以1 4 ，0 0 0 9 离心8 m i n ，重复该步骤一次。( 6 ) 向超滤管中加入5 0ula b c 并且以1 4 ，0 0 0 9 离心8 m i n ，重复该步骤一次。( 7 ) 将超滤管转移到新的收集管中。( 8 ) 向超滤管中加入2 ul 的p n g a s e f ，在热混合器中以5 5 0 w m 混合l m i n 。( 9 ) 将超滤管放入恒温水浴箱中3 7 0 c 3 h 。( 1 0 ) 将超滤管以1 4 ，0 0 0 9 离心8 m i n 。( 1 1 ) 向超滤管中加入4 0 ul 的a b c ，将超滤柱以1 4 ，0 0 0 9 离心8 m i n 。重复该步骤一次，收集滤液，转移到1 5 m l 的e p 管中。( 1 2 ) 将含有肽段的滤液的e p 管放入冻于机中，冻干3 h 左右，然后放入8 0o c 冰箱中保存。3 、z i p t i p 脱盐( 1 ) 向脱盐柱中加入l o ul 的1 0 0 a c n ，反复沈吸1 0 次，压出液体。( 2 ) 向脱盐柱中加入1 0u1 的5 0 a c n ，反复洗吸1 0 次，压出液体。( 3 ) 向脱盐柱中加入l oul 的o i t f a ，反复洗吸l o 次，压出液体。( 4 ) 从一8 0 0 c 冰箱取出样品，用0 5 乙酸将其1 0 一2 0ul 溶解，振荡混匀，1 2 0 0 0 9 离心5 m i n ，吸上清1 0p1 到脱盐柱中，反复洗吸，使肽段充分被吸附，压出液体。( 5 ) 向脱盐柱中加入l o ul 的o 1 t f a ，反复沈吸1 0 次，使肽段脱盐充分，压出液体。1 6( 6 ) 向脱盐柱中加入5pl 的8 0 a c n ( 含o 1 t f a ) ，反复沈吸，压出并用1 5 m l e p 管收集滤液。重复该步骤一次。( 7 ) 将含有滤液的e p 管放入冻干机中，冻干3 h 左右，然后放入8 0 0 c 冰箱中保存。4 、质谱分析( 1 ) 取出样品，向e p 管中加入2 7pla 液( o 5 乙酸) ，振荡混匀。( 2 ) 将e p 管以1 2 0 0 0 94 。c 离心2 5 m i n ，离心后平衡取出e p 管，轻拿轻放。( 3 ) 吸取2 3ul 样品加入到小瓶中( 不能有气泡) 。( 4 ) 上质谱仪器，得出数据，分析数据。六、液相色谱分离和质谱鉴定( 一) 液相色谱条件酶切后冻干的肽段用色谱a 液( 5 乙腈，0 1 三氟乙酸水溶液) 溶解，离心后取上清，色谱柱进样1 9ul 。毛细管反相柱的色谱条件为：缓冲液有流动相a 液组成，洗脱液由不同比例的流动相a ( o 1 甲酸水溶液) 及流动相b ( 0 1 甲酸溶于9 9 9 乙腈中) 组成，总时间是1 2 0 分钟，o 6 0 分钟，流动相中b 比例由5 上升至4 0 ；6 0 7 5 分钟，b 液比例由4 0 9 5 ；维持15 分钟后，以a 液平衡色谱柱3 0 分钟，控制两个泵的流速使分流后流至色谱柱的流速为1 2ul 分钟。( 二) 质谱条件由反相色谱流出的洗脱组分经由纳升级电喷雾接口从金属针喷出，电喷雾的电1 8 k v ；粒子传输毛细管温度设为1 8 0 。c ；质谱分析以一个全扫描( f u