（遗传学专业论文）ctxm14型超广谱β内酰胺酶的克隆表达及酶动力学研究.pdf

温州医学院硕士学位论文 c t x - m - 14 型超广谱1 3 一内酰胺酶克隆表达及酶动力学研究 中文摘要 目的： 研究c t x m 一1 4 型超广谱b 一内酰胺酶( e s b l s ) 在大肠埃希菌中的克隆，表 达，纯化，以及酶动力学。应用变性高效液相色谱技术( d h p l c ) 与定点突变相 结合的技术对c t x - m 一1 4 型e s b l s 基因型进行筛选，初步探索该技术在检测超广 谱6 一内酰胺酶的基因突变中的应用。 方法： 1 c t x m _ 1 4 在大肠埃希菌中的克隆与表达通过p c r 方法扩增温州地区已知产 c t x m - 14 型e s b l s 菌株后将其连接在p e t 2 8 a 质粒载体上，转化至大肠埃希 菌b l 2 1 ，得到c t x m 一1 4 工程菌。将该工程菌诱导表达，优化其诱导条件。 鉴定后用h i s 抗体及其二抗对重组蛋白进行蛋白质免疫印迹( w e s t e r nb l o t ) 检测。 2 c t x m _ 1 4 的发酵，纯化及酶动力学研究将c t x - m - 1 4 工程菌发酵，得到大量 菌体后进行亲和层析蛋白纯化以便得到纯度较高的c t x - m - 1 4 重组蛋白，分析 其纯度和比活性。通过c t x m - 1 4 型超广谱b 一内酰胺酶动力学分析，检测该 酶对多种抗生素的降解能力。 3 应用d h p l c 与定点突变相结合的技术对c t x m _ 1 4 型e s b l s 基因型进行检测 通过p c r 方法扩增温州地区e s b l s 菌株，运用d h p l c 技术进行检测，将 c t x m 一1 4 工程菌进行定点突变使其作为d h p l c 方法的阳性对照。 结果： 1 c t x m 一1 4 在大肠埃希菌中的克隆与表达c t x - m - 1 4 基因成功克隆到p e t 2 8 a 质粒载体上并在大肠埃希菌b l 2 1 中成功表达。通过w e s t e r nb l o t 检测可知该 重组蛋白有h i s 标签。 2 c t x m - 1 4 的发酵，纯化及酶动力学研究工程菌株通过发酵得到了2 5 0 9 菌体。 纯化后得到了纯度为9 0 以上的重组蛋白。酶动力学实验显示c t x - m - 1 4 型 e s b l s 能快速降解头孢噻肟，k m 值为1 0 5 6 8 。浓度为3 4 3 m g m l 的重组蛋白 取l m l 以头孢噻肟为底物测得酶活力为5 3 i u ，比活为1 5 5 1 u m g 。 3 应用d h p l c 与定点突变相结合的技术对c 1 x m 一1 4 型e s b l s 基因型进行检测 6 3 株临床得到的e s b l s 菌株中有3 0 例为c t x - m 一1 4 型，该分型在本次临床得 2 温州医学院硕士学位论文 到的e s b l s 菌株中所占比例高达4 7 6 。 结论： c t x - m - 1 4 型e s b l s 的克隆、表达与纯化以及酶动力学的研究为临床用药和 抗生素清除提供一定的理论指导。d h p l c 技术对c t x - m - 1 4 型e s b l s 的检测为该 技术运用在超广谱1 3 一内酰胺酶基因突变检测上的初步探索，为该技术的进一步 完善打下基础。 关键词： c t x m 一1 4 ；克隆；表达；酶动力学；d h p l c t h es t u d yf o r t h ec t x - - m - 14 t y p e e x t e n d e d s p e c t r u m ll 1 l l - l a c t a m a s ec l o n i n g e x p r e s s l o na n ne n z y m ek i n e t i c s a b s t r a c t o b j e c t i v e t os t u d ya n dr e s e a r c ht h ec t x - m - 14c l o n i n g ，e x p r e s s i o ni ne c o l i ，p u r i f i c a t i o n ， a n de n z y m ek i n e t i c s t oa p p l yd e n a t u r i n gh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( d h p l c ) f o rt h ec t x m 一1 4t y p ee x t e n d e ds p e c t r u m1 3 - 1 a c t a m a s e s ( e s b l s ) g e n o t y p e s c r e e n i n ga n dt oe x p l o r ep r e l i m i n a r i l yt h ea p p l i c a t i o no ft l l i ss k i l li ng e n em u t a t i o no f e s b l s m e t h o d s 1 t h ec t x - m - 14c l o n i n g e x p r e s s i o ni ne c o l ip c r a m p l i f i c a t i o nm e t h o da d o p t e d b yt h ek n o w np r o d u c i n gc t x - - m - 1 4 - t y p ee s b l ss t r a i n sa tw e n z h o ua r e aa n dt h e p r o d u c t i o nw a sc o n n e c t e dt ot h ep e t 2 8 av e c t o r , a n dt r a n s f o r mi n t oe c o l ib l 2 1 t h ec t x m 一14 e n g i n e e r i n gb a c t e r i ae x p r e s s e di nb a c t e r i a o p t i m i z et h ec o n d i t i o n o fe x p r e s s i o n ，l a t e rd e t e c t e db ya n t i h i sa n t i b o d yi nw e s t e r nb l o tp r o t e i n ( w e s t e r n b l o o 2 t h ef e r m e n t a t i o n ，p r o t e i np u r i f i c a t i o na sw e l la se n z y m ek i n e t i c so fc t x m 一14 t h ef e r m e n t a t i o na n dp r o t e i np u r i f i c a t i o no fc t x - m 1 4i si no r d e rt oo b t a i n h i g h e rp u r i t yo fc t x - m - 1 4r e c o m b i n a n tp r o t e i n ，t h e na n a l y s i so fi t sp u r i t ya n d a c t i v i t y t h r o u g ht h ec t x - m - - 14t y p ee x t e n d e d - s p e c t r u mp - l a c t a m a s ee n z y m e 3 温州医学院硕士学位论文 到的e s b l s 菌株中所占比例高达4 7 6 。 结论： c t x m 一1 4 型e s b l s 的克隆、表达与纯化以及酶动力学的研究为临床用药和 抗生素清除提供一定的理论指导。d h p l c 技术对c t x - m - 1 4 型e s b l s 的检测为该 技术运用在超广谱1 3 一内酰胺酶基因突变检测上的初步探索，为该技术的进一步 完善打下基础。 关键词： c t x m 一1 4 ；克隆；表达；酶动力学；d h p l c t h es t u d yf o r t h ec t x - - m - 14 t y p e e x t e n d e d s p e c t r u m p - l a c t a m a s ec l o n i n g ，e x p r e s s i o na n de n z y m ek i n e t i c s a b s t r a c t o b j e c t i v e t os t u d ya n dr e s e a r c ht h ec t x - m - 14c l o n i n g ，e x p r e s s i o ni ne c o l i ，p u r i f i c a t i o n ， a n de n z y m ek i n e t i c s t oa p p l yd e n a t u r i n gh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( d h p l c ) f o rt h ec t x m 一14t y p ee x t e n d e ds p e c t r u m1 3 - 1 a c t a m a s e s ( e s b l s ) g e n o t y p e s c r e e n i n ga n dt oe x p l o r ep r e l i m i n a r i l yt h ea p p l i c a t i o no ft l l i ss k i l li ng e n em u t a t i o no f e s b l s m e t h o d s 1 t h ec t x - m - 14c l o n i n g ，e x p r e s s i o ni ne c o l ip c ra m p l i f i c a t i o nm e t h o da d o p t e d b yt h ek n o w np r o d u c i n gc t x - - m - 1 4 - t y p ee s b l ss t r a i n sa tw e n z h o ua r e aa n dt h e p r o d u c t i o nw a sc o n n e c t e dt ot h ep e t 2 8 av e c t o r , a n dt r a n s f o r mi n t oe c o l ib l 21 t h ec t x m 一14e n g i n e e r i n gb a c t e r i ae x p r e s s e di nb a c t e r i a ，o p t i m i z et h ec o n d i t i o n o fe x p r e s s i o n ，l a t e rd e t e c t e db ya n t i h i sa n t i b o d yi nw e s t e r nb l o tp r o t e i n ( w e s t e r n b 1 0 0 2 t h ef e r m e n t a t i o n ，p r o t e i np u r i f i c a t i o na sw e l la se n z y m ek i n e t i c so fc t x m 一14 t h ef e r m e n t a t i o na n dp r o t e i np u r i f i c a t i o no fc t x - m 1 4i si no r d e rt oo b t a i n h i g h e rp u r i t yo fc t x - m - 1 4r e c o m b i n a n tp r o t e i n ，t h e na n a l y s i so fi t sp u r i t ya n d a c t i v i t y t h r o u g ht h ec t x - m - - 14t y p ee x t e n d e d - s p e c t r u mp - l a c t a m a s ee n z y m e 3 温州医学院硕七学位论文 k i n e t i ca n a l y s i s ，w et e s tt h ed e g r a d a t i o no ft h ee n z y m et oa n t i b i o t i c s 3 d h p l ca n ds i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sw e r eu s e dt od e t e c tt h ec t x m 一1 4t y p e e s b l sc l i n i c a ls p e c i m e n sp c r a m p l i f i c a t i o nm e t h o da d o p t e db yt h ee s b l s s t r a i n sa tw e n z h o ua r e a ，u s ed h p l cs k i l lt od e t e c tt h ep c r p r o d u c ta n dm a k et h e s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i sg e n ea sam e t h o do fd h p l c p o s i t i v ec o n t r 0 1 r e s u l t s 1 t h ec t x m 一14c l o n i n g e x p r e s s i o ni ne c o l i t h ec t x - m 一14g e n ew a s s u c c e s s f u l l yc l o n e di n t ot h ep e t 2 8 av e c t o ra n de x p r e s s e di n e c o l ib l 21 t h r o u g hw e s t e r nb l o td e t e c t i o n ，w ek n o wt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nh a sh i sl a b e l 2 t h ef e r m e n t a t i o n ，p r o t e i np u r i f i c a t i o na sw e l la se n z y m ek i n e t i c so fc t x m - 1 4 w eh a v eb a c t e r i a2 5 0 9t h r o u g ht h ef e r m e n t a t i o n t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a s a b o u t9 0 a f t e rb e i n gp u r i f i e d e n z y m ek i n e t i c s e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a t c t x - m - 1 4 一t y p ee s b l sc a nq u i c k l yd e g r a d ec e f o t a x i m e ，k mv a l u eo f1 0 5 6 8 t a k el m lc e f o t a x i m es u b s t r a t ef o r3 4 3 m g m lc o n c e n t r a t i o no fr e c o m b i n a n t p r o t e i n ，t h ee n z y m ea c t i v i t ym e a s u r e df o r5 3 i u ，s p e c i f i ca c t i v i t y15 5 i u m g 3 d h p l ca n ds i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i sw e r eu s e dt od e t e c tt h ec t x m - 14t y p e e s b l sc l i n i c a ls p e c i m e n st h e r ew e r e3 0c a s e so fc t x - - m - - 1 4t y p ei n6 3c a s e s o fc l i n i c a ls t r a i n s t h ec l a s s i f i c a t i o nh a sb e e ni nt h ec l i n i c a ld r u g r e s i s t a n ts t r a i n s o fe s b l ss h a r et o4 7 6 c o n c l u s i o n c l o n i n g ，e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n a sw e l la s e n z y m ek i n e t i c s o ft h e c t x m - 14p r o v i d e dat h e o r e t i c a lg u i d a n c ef o ru s i n ga n dc l e a r i n go fa n t i b i o t i c si n c l i n i c a l a p p l i c a t i o nd e n a t u r i n gh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( d h p l c ) f o rt h ec t x m 一14 t y p ee x t e n d e ds p e c t r u mp l a c t a m a s e s ( e s b l s ) g e n o t y p es c r e e n i n g w a st h ep r e l i m i n a r ye x p l o r ea b o u tt h ea p p l i c a t i o no ft h i s s k i l li ng e n em u t a t i o no f e s b l s ，a n di tw a st h ef o u n d a t i o nt oc o n s u m m a t et h et e c h n o l o g y k e y w o r d s c t x - - m - 14 ；c l o n e ；e x p r e s s ；e n z y m ek i n e t i c s ；d h p l c 4 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 关于学位论文使用授权声明 本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将 学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权 将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇 编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 日期：幽- 【：扣日期：幽： 学位论文作者签名刁导众 导师签名： 温州医学院硕士学位论文 刖舌 超广谱1 3 一内酰胺酶( e x t e n d e ds p e c t u r n1 3 一l a c t a m e r s e s ，e s b l s ) 是由细 菌质粒介导的能水解氧亚氨基b 内酰胺类抗生素，并且可以被1 3 内酰胺酶抑制剂 所抑制的一类酶，该酶为丝氨酸蛋白酶的衍生物，它是导致革兰氏阴性菌对新型 广谱1 3 内酰胺类抗生素耐药最重要的机制。e s b l s 主要由肠杆菌科细菌产生， 以肺炎克雷伯杆菌和大肠埃希菌为代表。由于第三代头孢菌素的不合理应用，使 产e s b l s 的细菌种类不断增加，e s b l s 的基因种类也不断增加。自1 9 8 3 年德国学 者首次从臭鼻克雷伯菌中发现了e s b l s ( s h v - 2 ) 以来，e s b l s 种类已超过2 0 0 多 种，其类型可以分为t e m 型、s h y 型、o x a 型、c t x - m 型、其它型等5 类u 。 1 9 8 9 年，同时在德国和阿根廷的大肠埃希菌和肠炎沙门菌中分离、鉴定出1 种新奇的e s b l s ，产此种e s b l s 的菌株表现出对头孢噻肟高水平耐药，而对头孢 他啶却不敏感，其基因结构和氨基酸结构与t e m 和s h v 型e s b l s 的同源性较低， 被命名为c t x m 家族。研究发现，c t x m 型e s b l s 属于非t e m 和s h v 型e s b l s ， 此类酶对头孢噻肟的水解活性远远大于头孢他啶，但其抗菌活性可被克拉维酸所 抑制。不同于t e m 和s h v 型e s b l s ，此类酶的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性 较低，因此，根据其氨基酸序列的同源性可将此类酶分为5 个组：第1 组( c t x m 一1 组) 共1 6 种，包括c t x m 一1 、c t x m 一3 、c t x m 一1 0 、c t x m 1 1 、c t x m 一1 2 、c t x m 一1 5 、 c t x - m - 2 2 、c t x - m 一2 3 、c t x m 一2 8 、c t x - m - 2 9 、c t x - m - 3 0 、c t x m 一3 2 、c t x m 一3 3 、 c t x - m - 3 6 、c t x - m - 5 4 、u o e - 1 ；第2 组( c t x - m - 2 组) 共9 种，包括c t x m 一2 、 c t x - m - 4 、c t x - m - 5 、c t x - m - 6 、c t x - m - 7 、c t x - m - 2 0 、c t x - m - 3 1 、c t x - m - 4 4 ( 先前 的t o h o - 1 ) 、f e c - 1 ；第3 组( c t x - m - 8 组) 共2 种，包括c t x m 一8 和c t x m 一4 0 ； 第4 组( c t x m 一9 组) 共1 5 种，包括c t x m 一9 、c t x m 一1 3 、c t x m 一1 4 、c t x m 1 6 、 c t x m 一1 7 、c t x m 一1 8 、c t x m 一1 9 、c t x m 一2 4 、c t x m 一2 7 、c t x m 一4 5 ( 先1 芤f 的t o h o - 2 ) 、 c t x m 一4 6 、c t x m 一4 7 、c t x m 一4 8 、c t x m 一4 9 、c t x m 一5 0 ；第5 组( c t x m 一2 5 组) 共4 种，包括c t x m 一2 5 、c t x m 一2 6 、c t x m 一3 9 、c t x m 一4 1 。 c t x m 型e s b l s 一般由2 91 个氨基酸残基组成，分子质量2 8 k d a ，p i 值介于 7 4 9 0 。c t x m 型和t e m 型或s h v 型的同源性仅为4 0 。t e m 型和s h v 型e s b l s 是在广谱酶t e m 一1 、2 和s h y 一1 的基础上发生1 4 个氨基酸的改变衍生而来，而 c t x - m 型e s b l s 没有相应的广谱酶基础，目前认为其超广谱活性可能是其本质特 征而不是几个位点突变的结果。h u m e n i u k 等研究发现，c t x m 型e s b l s 和抗坏血 酸克吕沃尔菌染色体a m p c 酶具有高度同源性，推测c t x m 型e s b l s 可能起源于 a m p c 酶。c t x - m 各亚型之间的核苷酸序列差别比较大，但都具有以下特点：对窄 谱头孢菌素水解活性最高，而水解青霉素类的活性不如t e m 型和s h y 型；其最主 5 温州医学院硕士学位论文 要的特征就是对头孢噻肟水解力高于头孢他啶。目前，已经证实s e r 2 3 7 在维持 c t x - m 型e s b l s 的活性非常重要，a s n l 0 4 位和s e r 2 3 7 位对水解头孢噻肟有重要 作用，第1 6 7 、2 4 0 位上的氨基酸残基则与水解头孢他啶密切相关，s e r l 6 7 和 g 1 y 2 4 0 可扩大c t x - m 型e s b l s 与头孢他啶的结合部位，促进头孢他啶的水解， 导致c t x - m - 1 5 和c t x - m - 1 9 水解头孢他啶的能力高于头孢噻肟。 本研究对c t x - m 型中的c t x - m - 1 4 分型的克隆，表达，发酵，纯化及酶动力 学的研究，探索了获取大量、高纯度、低成本e s b l 的方法学，为开发c t x m 一1 4 型e s b l s 作为头孢噻肟类抗菌素的清除剂打下基础。我们还将d h p l c ，定点突变 与测序相结合对温州地区大肠埃希菌临床标本进行c t x - m - 1 4 型e s b l s 的检测， 初步探索该技术在e s b l s 基因突变中的应用，为该技术的完善打下基础，并为该 地区抗生素的临床用药提供了一定的依据。 6 温州医学院硕士学位论文 第一部分c t x 一i 卜1 4 型e s b l s 的克隆与表达 材料与方法 材料 一、菌株及质粒： 太肠埃希菌标本于2 0 0 6 年采集于温州医学院附艟医院检验科。e l e o f i b l z l ( o e w 勾本实验室储存。p e t 2 8 a 表达载体为高效表达质粒，全长5 3 6 9 b p , 台卡那霉素抗性。 2 戮：= ! 蔫善嘉：e ：。：。熹： 。击啦。督筹鲁诮：。一；掌蜷毪耳冀b 百j ；：薹童羔毒：囊；i ! 黧= i 二。：。一。 r i j f i 芍f i i i i 7 i 五t i z t 墨；鼻= 互z 7 了j 习 k 兰= ：兰z ：篡篇赫篡：毫。，+ l 置竺置冀竺麓蓑竺兰兰耋奉善耄兰，_ j ；= = ；赫” p e t a h “d 咖n _ e q h 雠啪嘲- 图卜1p e t 2 8 a ( + ) 表达载体 温州医学院硕士学位论文 二、试剂及材料： 限制性内切酶n c oi 、x h oi 、t 4 连接酶、t a gd n a 聚合酶、d n a 纯化试剂盒、 d n a 胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、核酸分子量标准、蛋白分子量标准、 i p t g 等购于宝生物工程有限公司。h i s 抗体购于碧云天生物公司。其他所用化学 试剂均为国产分析纯。 三、主要溶液及培养基的配制 o l b 培养液及培养基： 成分 量 胰蛋白胨 酵母提取物 n a c l 1 0g 5g 1 0g 加双蒸水至9 5 0m l ，用2 mn a o h 调p h 值至7 o 7 2 ，1 2 1 高压灭菌2 0 - - 3 0m i n ， 置4 储存备用。在每升l b 液体中加入1 5g 琼脂粉即为固体l b 培养基， 经 1 2 1 高压灭菌2 0 - 3 0 m i n ，置4 储存备用。 1 0 0 m g m l 卡那霉素： 1 9 卡那霉素粉剂溶于1 0 m l 灭菌去离子水中，分装后2 0 c 保存。 琼脂糖凝胶电泳缓冲液( 5 0 x t a e ) ： 成分量 i r i s2 4 2g 冰乙酸5 7 1m l 0 5 me d t a ( p h8 o 、10 0m l 加蒸馏水定容至1 l ，工作液稀释5 0 倍。 1 0 m g m l 溴乙锭： l ge b 完全溶于1 0 0 m l 去离子水，室温避光保存。 1 琼脂糖凝胶： l g a g a r o s e 溶于1 0 0 m ll x t a e 电泳缓冲液，加入5 u l1 0 m g m le b ，冷却凝固。 s d s p a g e 电泳与免疫印迹的主要溶液 1 5 mt r i s ( p h8 8 ) 2 0 0 m h 称量t r i s3 6 3 4 9 ，加蒸馏水1 6 0 m l ，用h c l 调p h 至 8 8 ，加水定容至2 0 0m l ，置4 储存备用。 温州医学院硕士学位论文 1 0 mt r i s ( p h6 8 ) 2 0 0 m l ：称量t r i s2 4 2 2g ，加蒸馏水1 6 0 m l ，用h c l 调p h 至 6 8 ，加水定容至2 0 0m l ，置4 。c 储存备用。 1 0 s d s ( 毗) ：取s d s1 0g ，加蒸馏水9 0 m l ，加热至6 8 。c 助溶，用h c 调p h 至7 2 ，定容至1 0 0m l 。 0 1 0 a p ( 垅) ：取0 1 9 过硫酸铵，加蒸馏水定容至1m l ，于4 c 保存备用。 0 3 0 a c r b i s 母液( 毗) ：称取b i s5g ，a r c y l a m i d e1 4 5g 于5 0 0 m l 烧杯中，加 入3 0 0m l 蒸馏水，于3 7 c 充分搅拌溶解。加去离子水定容至5 0 0m l ，用0 4 5 l r t m 滤纸过滤后4 c 避光保存。 0 1 2 分离胶5m h 0 5 聚合胶1m h 成分量 d d h 2 0 3 0 a c r b i s 1 5 mt r i s ( p h 8 8 、 1 0 s d s 1 0 a p t e m e d 1 5 5m l 2 0 m l 1 2 5 m l 0 0 5 m l 0 0 5 m l o 0 0 2 m l 成分量 d d h 2 0 0 7 m l 3 0 a c r ，b i s0 1 5 5 m l 1 0 mt r i s ( p h 6 8 )o 1 2 5m l 1 0 s d s 1 0 a p t e m e d 0 o l m l 0 o l m l o 0 0 l m l 9 温州医学院硕士学位论文 e 5 x 蛋白上样缓冲液1 0m l ： 成分量 1 m i r i s - h c lq h6 8 ) 2 一m e 溴酚兰 甘油 s d s 2 5m l 0 5 m l 0 0 5g 5m l 1 0g 加蒸馏水至1 0m l 。室温保存，2 - m e 临用前加。 考马斯亮蓝染色液1 0 0m l - 成分量 甲醇 蒸馏水 冰乙酸 2 5m l 6 5 m l 1 0m l 称取考马斯亮蓝r 一2 5 00 1 9 溶解，过滤除去杂质。 考马斯亮蓝脱色液1 l 充分混合后使用。 s d s p a g e 电泳缓冲液1 成分量 乙醇 冰乙酸 蒸馏水 5 0m l 1 0 0 m l 8 5 0 m l 砀s 甘氨酸 s d s 3 0 2g 1 8 8 9 1 9 充分溶于去离子水并定容至1 l 。 1 0 温州医学院硕士学位论文 膜转移缓冲液： 成分量 t h s 甘氨酸 s d s 甲醇 5 8g 2 9 9 0 3 7 9 2 0 0 m l 用去离子水定容至1 l ，室温保存。 t b s 缓冲液l l ： 成分量 1m t r i s h c l ( p h 8 o ) n a c l 2 0m l 8 8 9 用去离子水溶解并定容至1 l 。 5 脱脂奶粉： 取5g 脱脂奶粉，溶于1 0 0 m l t b s ( p h7 4 ) 。 t b s t 缓冲液： 加o 5 m l t w e e n2 0 于1 l t b s 缓冲液中充分混匀。 四、主要仪器 p c r 仪( b d 公司) m i c r o f u g e2 2 r 高速离心机( b e c k m a n 公司) 净化工作台( 苏净集团安泰公司) 全自动凝胶成像系统( s y n o p t i c s 公司) d h p l c 仪( w a v e0 8 0 5 0 8 w a v ) p h s 一3 c 精密p h 计( 上海雷磁仪器厂) 方法 一、c t x m 1 4 型e s b l s 的扩增和克隆【钆】 ( 一) 引物的设计和合成 根据c t x m 1 4 基因序列，用p r i m e r 5 0 ，设计一对特异性引物：上游引物p 1 ： 5 一g g g g 鲤鱼鱼t g a c a a a g a g a g t g c a a 3 ( 划线为n c oi 酶切位点) ，p 2 ： 温州医学院硕士学位论文 5 - - t t c 至鱼q c a g c c c t t c g g c g a t g a t 3 ( 划线为x h oi 酶切位点) 。引 物由宝生物工程有限公司合成，用无菌去离子水将引物溶解，储存浓度为 10 0 p m o f l ，使用浓度为2 0 j x m o l l 。 ( 二) p c r 反应 以临床标本为模板，以p 1 和p 2 为引物，通过p c r 反应条件扩增c t x m 一1 4 型b 内酰胺酶基因。 p c r 反应体系： r e a g e n t sv o l u m e ( i t 1 ) d n t p ( 2 5m m ) r t a q d n a 聚合酶( 5u u1 ) 模板d n a 上游引物 下游引物 l o x b u ：f i e r m g c l 2 ( 2 5 m m ) d d h 2 0 t o t a l2 5 p c r 反应条件：9 4 预变性5 r a i n ，9 4 变性5 5 s ，5 8 退火5 0 s ，7 2 延伸 l m i n ，循环3 5 次，7 2 c 延伸1 0 m i n ，4 c 保存。扩增长度为8 8 0 b p 。取5 “1 产物 以1 5 的琼脂糖凝胶电泳鉴定。 ( 三) c t x m 1 4p c r 产物的纯化 将c t x - m 一1 4 的p c r 扩增产物用d n af r a g m e n tp u r i f i c a t i o nk i tv e r 2 0 纯化。 具体操作步骤如下： ( 1 ) 句p c r 反应液中加入l o o p 的d bb u f f e r ，然后混合均匀。 ( 2 ) 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 安置于c o l l e c t i o nt u b e 上。 ( 3 ) 将混合溶液转移至s p i nc o l u m n 中，1 2 ，0 0 0 r p m 离一t , 1 m i n ，弃滤液。 注：如将滤液再力h ) , s p i nc o l u m n 中离心一次，可以提高d n a 的回收率。 ( 4 ) 将5 0 0 p 1 的r i n s e a 力h n 至s p i nc o l u m n ，1 2 ，0 0 0 r p m 离一1 ) 3 0 s e c ，弃滤液。 ( 5 ) 将7 0 0 “1 的硒1 1 s e b 加入至s p i nc o l u r r m ，1 2 ，0 0 0 r p m 离一t g 0 s e c ，弃滤液。 1 2 加 筋 如 如 如 o 0 1 o 0 2 1 1 温州医学院硕士学位论文 ( 6 ) 重复步骤( 5 ) 。 ( 7 ) 将s p i nc o l u m n 安置于新的1 5 m l 的离心管上，在s p i nc o l u m n 中央处加入 2 5 1 x l 的灭菌水，室温静置lm i n 。 注：把灭菌水加热至6 0 c 使用时有利于提高洗脱效率。 ( 8 ) 1 2 ，0 0 0 r p m 离心l m i n 洗脱d n a ，4 c 保存。 ( 四) 小量提取p e t 2 8 a 质粒 p e t 2 8 a 质粒用m i n i b e s t p l a s m i dp u r i f i c a t i o nk i t 小量提取。 ( 1 ) 从平板培养基上挑选含p e t 2 8 a 质粒的单菌落接种至3 m l 的含有卡那霉 素的l b 液体培养基中，3 7 2 0 0 r p m 培养过夜。 ( 2 ) 取3 m l 的过夜培养菌液，1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n ，弃上清。 ( 3 ) 用2 5 0 1 1 1 的s o l u t i o ni ( 含r n a s e a l ) 充分悬浮细菌沉淀。 ( 4 ) 加入2 5 0 p 1 的s o l u t i o ni i 轻轻上下翻转混合5 、6 次，使菌体充分裂解， 形成透明溶液。 ( 5 ) 加入4 0 0 1 x l 的40 c 预冷的s o l u t i o ni i i ，轻轻上下翻转混合5 6 次，直 至形成紧实凝集块，然后室温静置2 m i n 。 ( 6 ) 室温1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，取上清。 ( 7 ) 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 安置于c o l l e c t i o nt u b e 上，将上清液转 移至s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃滤液。 ( 8 ) 将5 0 0 p 1 的r i n s e a 加入s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，弃滤液。 ( 9 ) 将7 0 0 1 的r i n s e b 加入s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，弃滤液。 ( 1 0 ) 重复操作步骤( 9 ) 。 ( 1 1 ) 将s p i nc o l u m n 安置于新的1 5 m l 的离心管上，在s p i nc o l u m n 膜的 中央加入6 0 t l 的灭菌蒸馏水，室温静置l m i n 。 ( 1 2 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n 洗脱d n a 。 ( 五) 纯化后的c t x m _ 1 4p c r 产物和p e t 2 8 a 质粒双酶切反应 扩增的c t x m - 1 4p c r 产物和p e t 2 8 a 质粒都含有n c o i 酶切位点和x h o i 酶切 位点，采用n c o i 酶和x h o l 酶进行双酶切反应，3 7 水浴4 h 。 温州医学院硕七学位论文 双酶切反应体系： r e a g e n t sv o l u m e ( g o p c r 产物( 或p e t 2 8 a 质粒) 1 0 x k b u f f e r b s a ( 4 , 牛血清) n c o i x h o i 1 4 2 2 1 1 t b t a l2 0 ( 六) c t x m _ 1 4 酶切片断和p e t 2 8 a 质粒酶切片断胶回收 按照a g a r o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o nk i t 说明书胶回收双酶切后的c t x - m - 1 4 酶切片断和p e t 2 8 a 质粒酶切片断。 ( 1 ) 用1 琼脂糖凝胶对双酶切后的c t x m 一1 4p c r 产物和p e t 2 8 a 质粒电泳。 ( 2 ) 在紫外灯下切出含有目的d n a 的琼脂糖凝胶，尽量切除不含目的d n a 部分的凝胶。 ( 3 ) 切碎胶块，称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以l m g = l g l 进行计算。 ( 4 ) 向胶块中加入3 倍胶块体积量的胶块融化液d r - ib u f f e r ，均匀混合后 7 5 加热融化胶块。 ( 5 ) 向上述胶块融化液中加入d r - ib u f f e r 量的1 2 体积量的d r - i ib u f f e r ， 均匀混合。 ( 6 ) 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 安置于c o l l e c t i o nt u b e 上，将上述溶液转 移至s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃滤液。 ( 7 ) 将5 0 0 9 l 的r i n s e ad n , x , s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0