（化学工艺专业论文）嗜碱细菌木聚糖酶及其应用基础研究.pdf

摘要 嗜碱细菌是一类新型微生物资源，其特有的高p n 耐受性，使其在基因工程 和工业生产中有着重要的理论和实用价值。嗜碱细菌及其分泌的碱性胞外酶能降 解植物纤维原料中的果胶、半纤维素等非纤维素物质，并与传统植物纤维加工中 的碱性条件具有相容性，因此在制浆造纸、麻纺等行业应用前景广阔。选用嗜碱 细菌及其胞外酶对植物纤维原料进行生物制浆、生物漂白、生物脱胶等预处理， 可以有效地减少后续工艺的化学药品用量，并能明显降低能耗和减轻环境污染， 对社会经济的可持续发展具有重要意义。 本研究从7 8 株嗜碱细菌中筛选产木聚糖酶活性较高的菌株，并优化其产酶 条件，同时对该酶的酶学特性进行初步研究，并探讨采用产酶菌株进行麻纤维生 物脱胶的可行性。主要研究内容和结论如下： 1 筛选到一株产碱性木聚糖酶的嗜碱芽孢杆菌n t - 1 6 。探讨了培养时间、 碳源、氮源及t w e e n 8 0 对该菌株产酶活性的影响。实验结果表明，该菌株产酶 的最佳碳源和氮源分别是半纤维素和胰蛋白胨，采用正交实验法优化的产酶条件 为：半纤维素2 ，胰蛋白胨l ，t w e e n ：8 00 1 ，k 2 h p 0 4 0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 2 ，n a 2 c 0 31 ，3 7 ，2 0 0 r m i n 培养7 2 小时。其木聚糖酶活力可达到 1 2 2 4 i u m l 。 2 采用硫酸铵分级沉淀分离嗜碱芽孢杆菌n t - 1 6 产生的木聚糖酶，并探讨 温度、p h 、各种金属离子对该酶活性的影响，为该酶的工业应用打下基础。实 验结果显示，粗酶液经硫酸铵分级沉淀后，木聚糖酶回收率可达8 0 ，纯化倍数 约为2 1 1 倍。该木聚糖酶在5 5 以下具有较好的热稳定性，在p n 7 0 - 1 1 0 范围 内能保持较高的活性，其最适p n 值为9 0 ，属于碱性木聚糖酶。在测试的金属 离子中，c l l 2 + 、h 9 2 + 离子对该木聚糖酶活性有比较明显的抑制作用。 3 选用嗜碱芽孢杆菌n t - 1 6 对苎麻进行生物脱胶，测定脱胶后的失重率， 并分析脱胶前后苎麻纤维理化性能的变化。结果表明，嗜碱芽孢杆菌n t - 1 6 在 碱性条件下能以各种麻类的胶质作为生长碳源，并分泌多种酶降解麻纤维胶质。 苎麻纤维经生物脱胶3 6 h 后，其胶质中的果胶去除率约7 0 0 , 4 、半纤维素去除率约 2 4 ，木质素的去除率约5 4 。显微观察显示，生物脱胶导致苎麻纤维表面出现 明显蚀痕。x 衍射分析发现，苎麻纤维经生物脱胶后，其相对结晶度有小幅下降。 关键词：嗜碱细菌，碱性木聚糖酶，苎麻纤维，生物脱胶 a b s t r a c t a l k a l o p h i l i cb a c t e r i aa r cak i n do fn o v e lm i c r o o r g a n i s mr e s o b r c e s t h e yh a v ea n i m p o r t a n tt h e o r ya n da p p l i c a t i o nv a l u ei nt h eg e n ee n g i n e e r i n ga n dt h ei n d u s t r i a l p r o d u c t i o nd u et ot h e i ru n i q u et o l e r a n ta b i l i t yf o rh i g hp h a l k a l o p h i l i cb a c t e r i aa n d , t h e i ra l k a l i n ee x w a c e l l u l a re n 2 y m e sc a l ld e g r a d et h en o n c e l l u l o s i cc o n s t i t u e n t so f p l a n tf i b e ra sp e c t i na n dh e m i c e l l n i o s e ，a n dh a v et h ec o m p a t i b i l i t yw i t ht h ea l k a l i n e c o n d i t i o n si nt h et r a d i t i o n a lp l a n tf i b e rp r o c e s s i n g t h e r e f o r e ，t h e yh a v ev a s t a p p l i c a t i o np r o s p e c t si nt h ep u l p ，p a p e r m a k i n ga n db a s tf i b e rt e x t i l ei n d u s t r y i ft h e c e l l u l o s i cm a t e r i a l sa 北p r e t r e a t e db yb i o p u l p i n g , b i o b l e a c h i n ga n db i o d e g u m m i n g w i t ha l k a l o p h i l i cb a c t e r i aa n dt h e i re x t r a c e l l u l a re n z y m e s ，t h ec h e m i c a lc h a r g em a yb e o b v i o u s l yr e d u c e di nt h ef o l l o w i n gp r o c e s s e s , s ot h ee n e r g yc o n s u m p t i o na n dt h e e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o nm a yb ed e c r e a s e de f f e c t i v e l y t h e r e f o r e , i th a st h ev i t a l s i g n i f i c a n c et ot h es o c i a le c o n o m ys u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n t 。 l nt h i ss t u d y , as t r a i nw i t hh i g h e rx y l a n a s ea c t i v i t yw a ss e l e c t e df r o m7 8s t r a i n s o fa l k a l o p h i l i cb a c t e r i a , a n dt h ec o n d i t i o nf o rt h ee n z y m ep r o d u c t i o nw a so p t i m i z e d m e a n w h i l e ，t h ep r e l i m i n a r ys t u d yt ot h i se n z y m ec h a r a c t e r i s t i cw a sc o n d u c t e d , a n d t h ef e a s i b i l i t yo fb a s tf i b e rb i o d e g u m m i n gw i t ht h es t r a i nw a sd i s c u s s e d t h em a i n c o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： 1 ax y l a n a s ep r o d u c i n ga l k a l o p h i l i cb a c i l l u sn t - 1 6w a ss c r e e n e d , a n dt h e e f f e c t so fc u l t u r et i m e ，c a r b o ns o u l c e ，n i t r o g e ns o u r c ea n dt w e e n - 8 0o nt h ee n z y m e p r o d u c t i o nw e 化s t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eh e m i c e l l u l o s ew a st h eo p t i m u m c a r b o ns o u r c e , a n dt h ep a u c r e a s - p o p t o n ew a st h eo p t i m u mn i t r o g e ns o u r c e t h e o p t i m a l c o n d i t i o nf o rt h e e n z y m ep r o d u c t i o n w a sh e m i c e l l u l o s e2 p a n c r e a s - p o p t o n e1 ，t w e e n 一8 0o 1 ，k 2 h p 0 40 1 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 2 ，n a z c o ， 1 w i t h7 2hc u l t i v a t i o n3 7 u n d e rs u c hac o n d i t i o n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yc a n r e a c h1 2 2 4i u ，玎d 2 t od ot h eg r o u n d w o r kf o ri n d u s t r i a la p p l i c a t i o n , t h ex y l a r m s ep r o d u c e db y a l k a l o p h i l i cb a c i l l u sn t - 1 6w a ss e p a r a t e db yf r a c t i o n a lp r e c i p i t a t i o nw i t ha m m o n i u m s u l f a t e ，a n dt h ee f f e c t so ft h et e m p e r a t u r e ，p ha n dm e t a li o n so nt h ea c t i v i t yo f x y l a n a s ew e r ed i s c u s s e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ex y l a n a s ew a sp u r i f i e db yt h e f r a c t i o n a lp r e c i p i t a t i o n ，t h er e c o v e r yw a s8 0 ，a n da2 1 1 - f o l d p u r i f i c a t i o nw a s a c h i e v e d t h ee n z y m eh a sab e r e rt h e r m o s t a b i l i t ya tt e m p e r a t u r eb e l o w5 5 ca n d h i g i la c t i v i t yf r o mp h7 0t op h11 0 t h ee n z y m eh a sap ho p t i m u mo fp h9 0 ，s oi t b e l o n g st oa l k a l i n ex y l a n a s e c u 2 + 、h 矿c o u l do b v i o u s l yi n h i b i tt h ea c t i v i t y 3 a l k a l o p h i l i cb a c i l l u sn t - 1 6w a ss e l e c t e df o rb i o d e g u m m i n go fr a m i ef i b e r s t h ew e i g h tl o s sa n dt h er e s i d u a lg u mo f t h ef i b e r sw e r ed e t e r m i n e d , a n dt h ee f f e c t so f b i o d e g u m m i n go nt h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h ef i b e r sw e r ea n a l y z e d t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h ea l k a l o p h i l i cb a c i l l u sn t - 1 6c o u l du t i l i z e dt h eg u mo fb a s tf i b e r s a sac a r b o ns o u i _ c ea n de x c r e t es o m ee n z y m e st od e g r a d et h eg u mi nt h ec o n d i t i o n o fa l k a l i n i t y t h ea l k a l o p h i l i cb a c i l l u sn t - 1 6c o u l dr e m o v ea b o u t7 0 p e c t i n , 2 4 h e m i c e l l u l o s ea n d5 4 l i g n i nf r o mr a m i ef i b e r sa f t e ri n c u b a t i o no f3 6 h m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n ss h o wt h a tt h e r ea l es o m eb i o d e g r a d i n gt r a c e so nt h ef i b e rs u d 搬t h e x - m yd i f f r a c t o g r a m sr e v e a lt h a tt h er e l a t i v ec r y s t a l l i n i t yo ft h ef i b e r sw a sd e c r e a s e d s l i g h t l ya f t e rb i o d e g u m m i n g k e yw o r d s ：a l k a l o p h i l i cb a c t e r i a _ a l k a l i n ex y l a n a s e ，r a m i ef i b e r s ， b i o d e g u m m i n g ， 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章引言 进入新世纪以来，由于全球环境污染问题的日益突现和资源的日益枯竭，环 境保护和可持续发展已经成为人们关注的焦点。世界各国都开始把目光转向寻找 具有无环境污染、可以被循环使用、再生能力强的“绿色资源”。 植物纤维素类物质是世晃上最为丰富的可再生资源。利用植物纤维素这一巨 大的可再生资源，提供人们所需的能源和其它化工产品，是世界上许多国家正在 积极探索的课题。植物纤维素的转化利用研究将为人类解决能源、粮食和环境污 染等问题拓展新的途径，在可持续发展战略中占有重要地位。 纺织工业和造纸工业是利用植物纤维的主要行业。就其本质而言，麻纺工业 的脱胶过程和造纸工业中的制浆过程并无差异，二者都是降解植物纤维原料中的 果胶、半纤维素等非纤维素组织，使其分散成能满足纺织工业和造纸工业不同要 求的柬纤维或单纤维的过程。为此，人们探讨了多种预处理方法，大致可分为物 理法、化学法、生物法。其中尤以生物技术的发展最为迅猛，目前；基因工程改 良造纸原料、生物制浆、生物漂白、以及麻类的生物脱胶等方面的研究已成为世 界各国的研究热点。 嗜碱微生物在制浆造纸和纺织工业领域有着广泛的应用前景。嗜碱细菌分泌 的胞外酶通常能满足制浆、脱胶工艺的高碱性要求，可直接用于植物纤维原料的 生物制浆预处理和生物脱胶等工艺，分泌的多种酶能调节和改善纤维原料的各组 分。利用嗜碱细菌及其碱性胞外酶降解植物纤维原料中的果胶、半纤维素等非纤 维素物质的能力，对植物纤维加工中的碱性降解工艺进行改造，可以大大降低后 续工艺化学试剂的用量，能有效地减轻环境污染。微生物一化学联用技术无论是 在造纸工业，还是在麻纺行业，与传统化学处理工艺相比，在产品质量、降低能 耗和减小环境污染等方面，都具有不可比拟的优势。 本研究的重点集中在产木聚糖酶菌株的筛选，产酶条件的优化及酶学特性的 初步研究，并探讨采用产酶菌株进行麻纤维生物脱胶的可行性。 本章主要阐述嗜碱细菌及其木聚糖酶的概况和最新研究进展，以及目前微生 物技术在工业中的应用前景。 武汉理工大学硕士学位论文 1 1 嗜碱微生物 1 1 1 嗜碱微生物的概述 嗜碱菌是一类独特的微生物类群。碱性条件的长期选择使它们具有特殊的细 胞结构和生理机能。嗜碱微生物能产生多种碱性酶和其它生物活性物质，因此， 作为一类独特的微生物资源，其在社会经济和生物工程研究上有巨大的开发潜力 和应用价值。 具体什么是嗜碱微生物或耐碱微生物目前还没有一个精确的定义，因为有些 微生物依生长条件不同有两个或以上最适生长p h 值。目前，国内外学者根据耐 受碱的程度不同对该类微生物作如下的界定1 1 2 】： ，耐碱菌：能在高p h 条件下生长，但最适范围不在碱性p h 范围的微生物。 嗜碱菌：最适生长p h 在8 0 以上，通常在p h 9 o 一1 0 0 之间，但在p u 6 5 左右不能或仅能缓慢生长的微生物。 极端嗜碱菌：最适生长p h 一 1 0 ，包括专性和兼性嗜碱菌。专性嗜碱菌在p h 低于8 0 - - 9 0 时不生长：兼性嗜碱菌的最适生长p h 1 0 0 ，并且在中性环境中 也能生长。 1 9 2 8 年d o w n i e 报道发现了第一个嗜碱菌s t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s 。从此，许多 不同类型的嗜碱菌不断被人们从自然界中分离出来，其生长环境包括了一般土 壤、盐碱土壤、碱湖、碱性沙漠、海洋甚至南极等的广大范围。嗜碱菌包括不同 类型的微生物，除古细菌外，还有真细菌、放线菌和真菌中的一些种，既有好氧 的，也有厌氧的类型，但它们均能在高碱性环境下生活l ”。 对嗜碱微生物的较为系统的研究是日本学者k o k ih o r i k o s h i 自1 9 6 8 年开始 的。三十多年来，科学家们发现了大量的嗜碱微生物，并纯化了多种碱性酶1 4 j 。 由于嗜碱菌是一种能在极端环境下生存的微生物，其特有的高p h 耐受性， 使其在基因工程和工业生产中有着重要的理论和实用价值，因此在涉及碱性环境 的工业中和日常生活等方面有着广泛的应用。嗜碱细菌分泌的酶可直接用于麻纺 工业中麻原料的生物脱胶，造纸工业中木材等原料的生物制浆预处理和预漂白等 工艺。采用这些工艺流程能减少后续工艺化学试剂的使用量，大大减轻麻纺、造 纸工业对环境的污染。 武汉理工大学硕士学位论文 1 1 2 嗜碱微生物的应用 嗜碱菌的碱性酶具有对高p h 稳定的特点，因此可以将这些酶应用到许多涉 及碱性环境的工业生产和日常生活中去，这是嗜碱微生物一个最为重要的研究方 向。 1 1 2 1 木聚糖酶 嗜碱微生物在纺织工业、制浆造纸工业方面有着广泛的应用前景。有些嗜碱 细菌分泌的木聚糖酶符合造纸工业的高碱性、高温的特殊要求，可直接用于木材 等原料的生物制浆预处理和预漂白，分泌的多种酶能调节和改善纸浆组分。植物 的胶质成分主要是果胶、半纤维素、木质素。内切木聚糖酶能够切割半纤维素的 主要成分一木聚糖主链上的e 1 , 4 糖苷键，使其链长降低；而木糖苷酶并能够进 一步作用于低聚木糖和木二糖，使其彻底降解为木糖单体。利用嗜碱细菌及其碱 性胞外酶降解植物纤维原料中的果胶、半纤维素等物质的能力，对植物纤维加工 中的碱性降解工艺进行改造，可以大大降低污染。在造纸工业，当用嗜碱细菌进 行生物制浆时，既能改善纸的质量，又能减轻污染。在麻纺行业也可选用适宜的 嗜碱菌及胞外酶进行麻类纤维的生物脱胶，在提高产品质量、降低能耗和减少环 境污染方面有显著的优势。 1 1 2 2 纤维素萄 近年来，嗜碱细菌产生的碱性纤维素酶已开始用作洗涤剂的添加剂。据分析， 9 0 0 0 的污染附着在棉纤维之间，碱性纤维素酶作用于织物非结晶区，能有效地软 化、水解纤维素分子与水、污垢结合形成的凝胶状结构，使封闭在凝胶结构中的 污垢较容易地从纤维非结晶区中分离出来1 3 】。在日本这样的含纤维酶的洗衣粉已 占市场的4 0 p 1 。 1 1 2 3 环状糊精葡萄糖基转移酶 环糊精( c d ) 是由q - 1 ，4 糖苷键连接而成的环状化合物，一般为6 8 个葡 萄糖单位，依次称为q 、b 、y 环糊精。环状糊精葡萄糖基转移酶( c g t a s e ) 能 够作用于淀粉产生环糊精6 。7 1 。与普通细菌产生的c g t a s e 相比，嗜碱c g t a s e 使 环糊精的产率大大提高( 达7 0 - - 9 0 ) 1 引，环糊精可直接从淀粉水解产物中结最 析出，因而不需要像传统工艺那样加入毒性有机溶剂去沉淀环糊精，使生产成本 大为降低。相信不远的将来，随着环糊精新用途的丌发，1 3 型转化率的进一步的 提高及新菌株的不断发现，嗜碱细菌在这领域的应用前景会更加诱人。 武汉理工大学硕士学位论文 1 1 2 4 蛋白酶 许多年来嗜碱性蛋白酶已广泛应用于洗涤剂，由于蛋白的水解作用，使得洗 涤物的血迹、牛奶和碳黑等污物更容易洗去，从而增加洗涤剂的去污效果。碱性 蛋白酶的生产已经发展成工业规模，在洗涤剂行业，用于洗涤剂的酶占世界酶产 量的3 0 。碱性蛋白酶还可用于皮革脱毛，可避免使用c a s 0 4 和n a 2 s 0 4 产生的 污染。f u j i w a r a 和c o w o r k c r s 发现了碱性蛋白酶的另一个独特的用途：分解x 射 线胶片上的凝胶涂层，并从中回收银。 1 1 2 5 果胶酶 在日本，来自嗜碱菌的果胶酶己被用于提高纸张的质量。将此酶用于沤麻工 艺，可生产出高质量的非木质纸张，其强度比传统纸张强得多 7 1 。另外，果胶酶 在麻的脱胶工艺中能够高效地去除麻纤维中所含的胶质，其中果胶的去除率可达 7 5 以上，使纤维的分散性能更好，而同时又不降解纤维素。果胶酶还能分解各 类水果及蔬菜汁含有的果胶物质以及其它类似阿聚糖的长链分子，可迅速降低果 桨粘度，利于汁液的过滤和澄清，提高浓缩果汁的质量和稳定性。因此果胶酶在 食品领域中也有广泛的应用价值。 利用嗜碱酶的催化作用还可对洗涤剂工业、印染工业、造纸工业、麻纺工业 等所产生的碱性废水进行生物处理；个别性质优良的嗜碱酶还可应用于生物工程 方面，将其作为工具酶应用于分子生物学研究。 1 2 木聚糖酶 1 2 1 木聚糖酶的概况 木聚糖是植物半纤维素的主要成分，它是除纤维素外，自然界最为丰富的多 糖，大约占地球上可再生有机碳源的l 3 。木聚糖是一类复杂的多聚碳水化合物， 属于非淀粉多糖，它包括木聚糖c x y l a n ) 、木葡聚糖( x y l o g l u c a n ) 、葡甘露聚糖 ( g l u c o m a n n a n ) 、半乳葡甘露聚糖( g a l a c t o g l u c o m a n n a n ) 、阿拉伯半乳聚糖 ( a r a b i n c i g a l a c t a n ) 等。 木聚糖酶是一类降解酶系，对降解自然界大量存在的半纤维素起着重要作 用。木聚糖多为异质多糖，主链和侧链上具有多种取代基团，它的降解需要许多 酶的参与，主要有内切b l ，4 一木聚糖酶( e n d o 1 ，4 1 3 d x y l a n a s e se c 3 2 1 8 ) 、 b d 一木糖苷酶( b d x y l o s i d a s ee c3 2 1 3 7 ) 、a d 一葡糖醛酸糖营酶 武汉理工大学硕士学位论文 ( d - g l u c u r o n i d a s e s e c3 2 1 1 3 9 ) 、n - l 阿拉伯糖苷酶( a l - a r a b i n o f u r a n o s i d a s e s e c3 2 1 5 5 ) 、乙酰木聚糖酯酶( a c e t y l x y l a ne s t e r a s e se c3 1 1 7 2 ) 等组成。这些 酶通过特定的协同机制作用于木聚糖，使木聚糖得以降解。其中作用于主链的有 两种酶：内切b 1 小木聚糖酶和1 3 木糖苷酶。内切1 3 1 , 4 木聚糖酶从木聚糖主链 的内部切割b 1 , 4 糖苷键，使木聚糖溶液的粘度迅速降低惮】，其水解产物主要为 木二糖及木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。争d 木糖苷酶 作用于低聚木糖和木二糖，通过从非还原末端水解出d 木糖的方式降解低聚木糖 和木二糖，它是从可溶性的木聚糖片段产生木糖单体的关键酶。 嘟一 p d - 奉营一 图1 1 木聚糖酶的作用机理 ( a ) 木聚糖碳链的结构以及它被木聚糖酶作用的位置 1 3 - d 一木糖苷酶对低聚木糖的水解作用 1 2 2 木聚糖酶的理化性能 木聚糖酶的来源比较广泛，细菌、藻类、真菌、原生动物等均可分泌产生木 聚糖酶，而目前研究最多的是细菌和真菌两类。 细菌所产木聚糖酶大致可分为两类：高分子量的耐酸木聚糖酶和低分子量的 耐碱木聚糖酶，而真菌木聚糖酶的最适p h 相对细菌的来说偏酸性，并且它的耐 热性也较细菌差。从很多木聚糖酶的氨基酸组成及其三维结构分析可以看出，谷 氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、色氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸和赖氨酸对其催化 特异性及耐碱、耐热性非常关键1 9 1 0 武汉理工大学硕士学位论文 细菌产生的木聚糖酶蛋白质亚基比较单一，分子量范围在8 1 4 5 k d a 。而真 菌产生的木聚糖酶蛋白质亚基则较复杂，分子量的变化范围也较大。但无论是真 菌还是细菌，其内切型木聚糖酶的最适作用温度一般在4 0 - - 6 0 之间，一般细 菌所产木聚糖酶比真菌所产木聚糖酶热稳定性高1 9 l 。不同微生物所产木聚糖酶所 能耐受的p h 范围一般是3 o 一1 0 0 ，当然也还有一些能够承受极端p h 环境的木 聚糖酶，这将在后面谈到。不同木聚糖酶的等电点变化范围一般在3 二- l o 之间【l o l 。 1 2 3 木聚糖酶分子的结构区域 不同微生物产生的木聚糖酶在结构和性质上有很大的差别。有的木聚糖酶只 含有单一区域，即催化域，也有的同时具备催化域和多种非催化域。多域木聚糖 酶分子结构中含有催化域( c a t a l y t i cd o m a i n ，c d ) 、纤维素结合域 ( c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 、木聚糖结合域( x y l a n - b i n d i n gd o m a i n ，x b d ) 、 连接序列( l i n k e rs e q u e n c e ) 、重复序列( r e p e a t e ds e q u e n c e ) 、热稳定域 ( t h e r m o s t a b i l i s i n gd o m a i n ) 及其它未知功能的非催化域等。这些区域担负着不同 的生理功能，在木聚糖酶的催化机制中也发挥着不同的作用【i l l 。 其中催化域是这些区域中最为重要的一个，它承担着酶的水解特性，并作为 该酶分类的基础。在催化域特定位置的谷氨酸和天冬氨酸对催化特异性非常关 键。 1 2 4 木聚糖酶的分类 不同种类的酶能通过不同的催化机制作用于同一种木聚糖，并能产生同样的 产物，因此依靠底物特异性会使我们对木聚糖酶的分类变得很困难。由 h e n r i s s a t l l 2 】等人提出了一个比较完整的分类系统，这个系统不仅适用于木聚糖酶 的分类，还适用于通常的糖苷水解酶( e c3 2 1 x ) 的分类。现在，这个分类系统 已逐渐成为糖苷水解酶分类的标准方法。这个系统是基于对催化区域基本结构的 对比上的，把这些酶归纳到具有不同相关序列的家族( f a m i l y ) 中。最初这个分 类法把纤维素酶和木聚糖酶分为6 个家族( a f ) 1 1 2 1 ，到1 9 9 9 年【1 3 】，已经含有 7 7 个家族( i 一7 7 ) ，而到2 0 0 5 年这个分类系统已包含了9 6 个糖苷水解酶家族。 这些家族中大约有三分之一的家族都是多特异性的，即它们所包含的酶系具有不 同的底物特异性。 从这个分类系统来看，木聚糖酶通常属于家族l o 和家族11 。但是家族5 、7 、 8 和4 3 中的一些酶也具有b 一1 ，4 - 木聚糖酶催化活性1 i 3 1 。目前对木聚糖酶的研究 情况来看，大部分还是集中在家族1 0 和l l 之中，对家族5 、7 、8 和4 3 的研究 6 武汉理工大学硕士学位论文 还比较少。 1 2 5 嗜极木聚糖酶 对于细菌和真菌木聚糖酶的大量研究表明，绝大部分木聚糖酶在接近中温 ( 大约4 0 - 6 0 c ) 【1 4 5 l 和中性p h ( 尤其是细菌木聚糖酶) 或者微酸性p h ( 尤 其是真菌木聚糖酶) 环境下具有良好的活性。但是，也有许多报道在极端温度和 极端p h 下，有些木聚糖酶不仅稳定，而且具有较高活性。实际上，在5 一1 0 5 c t 城1 7 , 1 8 1 、p h2 0 - - 1 1 0 t 城博2 以及在盐度高达3 0 1 2 1 2 2 1 的较大范围内，都有 活性木聚糖酶的报道。事实上，在许多极端环境中生存着大量的嗜极微生物，由 这些微生物所产生的酶大多数都能够在极端环境条件下具有稳定性和活性。在这 些嗜极木聚糖酶中，研究最集中的主要是在嗜热、嗜碱和嗜酸的木聚糖酶，而对 于适冷以及嗜冷的木聚糖酶则研究较少。下面将分别讨论各种嗜极木聚糖酶的性 质以及它们的最新研究进展。 1 2 5 1 嗜热木聚糖酶 现在已分离出了许多能产生木聚糖酶的嗜热( 最适生长温度在5 0 一8 0 1 2 ) 和极端嗜热( 最适生长温度 8 0 ) 微生物，其生长环境包括陆地、海底、温泉 及有机体降解残骸等田】。到目前为止，所发现的嗜热木聚糖酶基本上都属于家 族1 0 和1 1 ，还没有报道发现属于其他家族的嗜热木聚糖酶。 目前报道的来自于嗜热细菌如b a c i l l u s 等属的木聚糖酶，其最适温度一般在 6 5 - - 8 0 之间；s i m p s o n 等 2 4 1 报道了一株极端嗜热菌t h e r m o t o g as p f i s s b 1 产 生的木聚糖酶，该酶的分子量为3 l l o a ，最适反应温度为1 0 5 ，9 5 时的半衰 期为1 5 h ，将酶固定在玻璃珠上后，酶反应的最适温度从1 0 5 上升到1 1 2 ； 嗜热厌氧细菌c l o s t r i d i u ms t e t c o r a r i u m 产生的木聚糖酶a 的最适温度为7 0 ， 在8 0 时的半衰期为9 0 m i n 。b e r e n s 等p 1 报道了一株嗜热放线菌m i c r o t e r a s p o r a f l e x u o s a s i i x 的木聚糖酶在p h 6 0 时的最适温度为8 0 。 由于在工业上嗜热细菌有很大的应用范围，木聚糖酶的热稳定性机制一直是 近年来研究的热点。人们已用了很多方法来研究它的嗜热机制，如比较不同木聚 糖酶一级序列的同源性，用核磁共振法、x 光衍射法和分子模拟( m o l e c u l a r m o d e l i n 曲来研究它的三维结构等【2 们。现在有观点认为，嗜热酶分子中分子量的 大小，氢键、二硫键数目的多少，以及分子螺旋结构、折叠结构等因素与其热稳 定性有密切的关系。虽然酶热稳定性的确切机制还没有完全弄清，但随着新兴的 定点突变技术和蛋白质工程技术以及其它技术的发展，有望为阐明酶的热稳定机 制提供更有力的手段。 武汉理工大学硕士学位论文 1 2 5 2 嗜碱木聚糖酶 我们地球上绝大部分自然环境都是p h 在5 0 9 0 之间的环境，但在一些石 灰型土壤、碱性沙漠、碱性湖泊、造纸工业的纸浆、废水等碱性环境中，都已分 离出许多能够适应碱性环境并产生木聚糖酶的微生物。事实上，产木聚糖酶的嗜 碱微生物并不一定必须在碱性环境下才能分离得到，因为它们能够在中性环境下 与许多中性微生物形成共生共存的关系田】。 1 9 7 3 年，h o f i k o s l 吐等 2 7 1 从嗜碱芽孢杆菌b a c i l l u ss p c 5 9 - 2 中第一次分离得 到嗜碱木聚糖酶。自从发现木聚糖酶具有生物漂白、脱胶功能以来，各国科学家 更是对嗜热嗜碱木聚糖酶的分离产生了极大的关注。d e y 等 2 8 1 分离的嗜碱嗜热菌 b a c i l l u ss p n c i m 5 9 能产生2 种不含纤维素酶的木聚糖酶，它们的最适p h 值和 温度分别为p i l l 0 0 和5 0 。k h a s i n 等 2 9 1 用一步纯化法得到了碱性菌株b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u st - 6 的木聚糖酶，该酶是一个单肽链，分子量为4 3 k d a ，降解 木聚糖很彻底，最后的降解产物为木糖和木二糖。该木聚糖酶在p n 9 0 和6 5 时对纸浆有最好的漂白效果，因此，这是一个具有很大潜在应用价值的耐碱木聚 糖酶。n a k a m u r a 等p o 报道了碱性菌株b a c i l l u ss p 4 1 m 1 能产生几种胞外木聚糖 酶，木聚糖酶j 是其中的一种，它的最适p h 为9 0 ，在此p h 条件下的最适温度 为5 0 。嗜碱菌的嗜碱机理还没有完全解释清楚，n a + 旷反向运输系统的研究 一直进行着，并取得了一些成果，但现在的结果只限于b a c i l l u s 的范围；嗜碱菌 的氧化磷酸化过程也是处于假说阶段，因此，嗜碱菌嗜碱机理的研究将是未来的 热点之一1 4 】。 嗜碱木聚糖酶由于其独特的高p h 耐受性，在造纸和麻纺等行业中有着广阔 的应用前景，后面将有比较详细的阐述。 2 5 3 嗜酸木聚糖酶 在一些地热地区以及海底深处，一些嗜酸的微生物能在p h i o 一5 0 的环境 中较好的生长，它们中也有许多能够产生酸性木聚糖酶的种类。比如a s p e r g i l l u s k a w a c h i i1 1 9 川) 、c r y p t o c o c c u ss p s _ 21 3 2 1 、p e n i c i l l i u ms p 4 01 2 0 ! q b 的木聚糖酶则在 酸性条件下有较高活性，其中p e n i c i l l i u ms p 4 0 木聚糖酶在p h 2 o 一5 0 条件下比 较稳定，而a s p e r g i l l u s k a w a c h i i 的木聚糖酶x y n c 则在p h i o 一9 o 的较大范围内 都比较稳定。一般来说真菌产生的木聚糖酶较细菌产生的木聚糖酶有更好的耐酸 性。 有研究表明，木聚糖酶在极端p h 环境中的稳定性是由其催化域周围带电残 基的空i b j 偏移所导致的。以a s p e r g i l l u sk a w a c h i i 的木聚糖酶x y n c 为例，在其催 化区域周围有大量的酸性残基1 1 9 l ，这些酸性残堆被认为降低了低p h 环境中大量 武汉理工大学硕士学位论文 正电基团的静电斥力，因而能使酶在低p h 条件下保持较好稳定性。相反，对于 碱性木聚糖酶而言，它拥有相对较少的酸性残基，却有较多的精氨酸等碱性氨基 酸残基。日本i m a n a k a 报道了一种丝氨酸蛋白酶，其作用的最适p h 高达1 3 ， 分析发现它所含的酸性氨基酸残基较少，而精氨酸和赖氨酸残基的比率却较高， 使得它在高p h 条件下仍能保持稳定嗍。另外，h a k u l i n e n 等【3 4 】报道称，酶分子 结构中盐桥数目的多少与木聚糖酶在极端p h 下的活性和稳定性也有一定的相关 性。 1 2 5 4 嗜冷木聚糖酶 目前已有很多关于木聚糖酶最适作用温度的报道，大部分木聚糖酶的最适作 用温度在5 0 一6 0 ，而某些极端嗜热木聚糖酶的最适温度可达到8 0 左右。但 若是在温度低于4 0 的环境下，大部分木聚糖酶其活性都会快速下降至5 0 0 以 下。而嗜冷木聚糖酶通常能在o 一3 0 之间具有高活性，但是其稳定性却不是很 好。有报道称，嗜冷木聚糖酶p x y l ( f a m i l y8 ) t ”j 在5 左右的环境下依然能够保 持6 0 的酶活，且它的最适作用温度在3 0 左右，如果将其应用于工业领域， 则无需额外加热，在常温下即可获得较高的酶活性，能大大减小能耗，降低生产 成本。 尽管寒冷的生态环境在地球上的范围很广，但是却只有极少数的适冷或嗜冷 木聚糖酶被发现。目前所发现的能够产生嗜冷木聚糖酶的生物体有：两种革兰氏 阴性菌p s e u d o a l t e r o m o n a sh a l o p l a n k t i st a i l 3 ai j ，”1 和f l a v o b a c t e r i u m f r i g i d a r i u ms p n o v 网、一种革兰氏阳性菌c l o s t r i d i u mp x y l i 3 9 1 、酵母菌 c r y p t o c o c c u sa d e l i a e 4 0 1 、一系列的真菌p e n i c i l l i u ms p 、a l t e r n a r i aa l t e r n a t a 和 p h o m as p 2 【4 n 、以及南极磷虾【4 2 】等。这所有的生物均生活在南极大陆严寒的环 境中。关于嗜冷机理，有人认为酶催化底物反应的重要一步是与底物分子结合， 然后改变构相形成酶与底物复合体进而暴露官能团使得底物反应，而嗜冷酶分子 的作用力弱，与溶剂的作用加强，从而使酶结构的柔韧性增加 3 3 1 ，这一方面有 助于酶催化反应时构相的变化，另一方面使底物与酶结合有更多的位点和机会， 而且更重要的是它能在这一过程中节省活化酶容纳底物的能量，从而使得它能在 低耗能的情况下具有较高的催化效率。目前对嗜冷木聚糖酶的研究还比较少，但 从整体和长远来看，加强对它们的研究还是有较大意义。 9 武汉理工大学硕士学位论文 1 3 木聚糖酶在工业中的应用与研究进展 由于木聚糖酶具有很多优越的特性，使其在造纸、纺织、食品、饲料等工业 中显示出广阔的应用前景。 本小节将着重介绍木聚糖酶在造纸、纺织工业中的应用状况及研究进展。 1 3 1 木聚糖酶在制浆造纸工业中的应用 1 3 1 1 制浆造纸工业概论 造纸工业是投资大、能耗高，对环境污染严重的行业之一。其污染特点是废 水排放量大，色度高，化学需氧量高，废水中纤维悬浮物多。制浆造纸生产中的 主要污染源有三个：一是来自蒸煮废液，二是制浆过程洗、选、漂工段排出的中 段废水，三是造纸机白水。污水治理的主要措施有蒸煮废液碱回收或综合利用， 纸机白水回收和厂外综合废水治理。 ， 近年来，造纸工业污染防治的新技术不断涌现，8 0 年代中期，芬兰和瑞典 等国家的造纸逐步开始推广延时蒸煮或称深化蒸煮，通过蒸煮设备和操作的改 进，使蒸煮终点的纸浆含有的木素量少于常规方法，这不但可使漂白过程氯的添 加量减少，漂白废水氯代有机物排放负荷降低，同时还增加了黑液中的热值。另 外，我国大多数草浆厂均采用传统漂白工艺c e h 三段漂( c 氯化，e 碱抽提， h 次氯酸盐) ，其中氯源是以元素氯作漂剂，会产生少量氯化度高的二恶英类化 合物。二恶英中的2 ，3 ，7 ，8 - t c d d 为迄今最毒的有机化合物，具有很强的致癌性。 要消除二恶英污染主要通过漂白工艺改革，采用清洁的“无元素氯漂白工艺” ( e c f ) 和“全无氯漂白工艺”( t c f ) 。目前世界各主要的纸浆产地正快速向二氧 化氯漂白甚至t c f 漂白转变。我国一些大型造纸厂正在引进e c f 技术，山东晨 鸣纸业集团从1 9 9 7 年开始进行麦草浆的t c f 技术研究与开发，共投入2 0 0 0 万 元建设日产5 0 吨麦草浆t c f 生产线，现已取得阶段性成果。 造纸工业中的大部分生产过程都处于高温、商p h 条件下，因此嗜热碱性木 聚糖酶在这一领域的应用具有许多独特的优点。一方面，它能在高温碱性条件下 保持较好的活性和稳定性，另一方面，木聚糖在碱性溶液中是可溶的，因此，碱 性木聚糖酶就很容易将溶液中的木聚糖降解掉。传统的化学漂白法是大量采用酸 性漂白剂如氯气、二氧化氯等来减小木质素对纸张质量的影响，这就使得造纸废 水中含有大量对环境有害的成分，容易造成严重后果。如果在化学漂白之前，用 木聚糖酶对纸浆进行预处理，就会使氯气等化学漂白剂更好地渗透到纸浆里面， j o 武汉理工大学硕士学位论文 从而大大减少化学漂白剂的用量唧。目前，已有报道丹麦n o v o r d i s k 公司开发出 了一种最适p r 0 0 0 ，最适温度为7 0 - - 8 5 用于造纸工业的木聚糖酶【4 硼