（应用化学专业论文）聚阳离子与DNA相互作用的共振光散射研究.pdf

摘要 本文在查阅大量文献的基础上，结合本实验室条件，采用共振光散射技术研究聚阳 离子与d n a 的相互作用。聚阳离子自身的共振光散射信号较弱，但与核酸作用后，共振光 散射信号大大增强，并且共振光强度的增加与d n a 的浓度成线性关系。以此为基础建立 了测定微量d n a 的新方法。同时还应用红外光谱、紫外光谱来研究聚阳离子与d n a 的作 用方式。实验分为四部分： 1 利用共振光散射技术研究三嵌段共聚物p l l - p e g p l l 与d n a 的相互作用 将阳离子三嵌段共聚物p l l p e g p l l 作为共振光散射探针来测定微量d n a 。在优化 条件下，d n a 线性范围为o 0 6 5 6 - 6 5 6i x g m l l ，检测限( 3 力为o 4 2n gm l l 。该方法快速、 准确、简单。同时应用紫外、红外等手段来研究p l l - p e g p l l 与d n a 的相互作用。结 果表明在反应过程中由于d n a 的微环境发生改变导致d n a 的构象发生变化。 2 合成聚阳离子p m b d a c ，并作为共振光散射探针测定微量d n a 合成了聚甲基丙烯酰氧乙基苄基二甲基氯化铵( p m b d a c ) 。p m b d a c 自身的共振 光散射信号较弱，但与核酸作用后，共振光散射信号大大增强。并且共振光强度的增加 与d n a 的浓度成线性关系，以此为基础建立了以p m b d a c 为共振光散射探针，利用共 振光散射技术测定d n a 的新方法。d n a 浓度的线性范围为1 7 0 x 1 0 8 - - - 4 4 2 1 0 6 m o ll 1 检测限( 3 力为5 7 x 1 0 4 t o o ll 1 。此方法简单、准确、快速，且成功用于合成样品的测定。 3 合成聚阳离子( p ( a m d m b ) ) ，研究p ( a m d m b ) 与d n a 的相互作用 合成丙烯酰胺一甲基丙烯酰氧乙基丁基二甲基氯化铵共聚物( p ( a m d m b ) ) 。利用 r l s 、u v 、f t i r 等方法研究此聚阳离子与d n a 的相互作用。结果表明在反应过程中由于 d n a 的微环境发生改变导致d n a 的构象发生变化。p ( a m d m b ) 与d n a 的结合常数是 8 0 x 1 0 3l m o l - 1 。 4 合成聚倍半硅氧烷苯基氯化铵( 阳离子p o s s ) ，并作为探针测定微量d n a 合成阳离子p o s s 。并用阳离子p o s s 作为共振光散射探针来测定微量d n a 。阳离 子p o s s 与d n a 相互作用形成的复合物使得其共振光散射信号大大增强，并且强度与 d n a 浓度成正比。在优化条件下，d n a 浓度在o 3 5 , - 4 2 8 5l a g m l - 范围内时，体系的 共振光散射强度与d n a 的浓度存在着线性关系。检测限( 3 为o 3 2n g m l - 1 。此方法准 确、快速、灵敏度高、重现性好。 关键词：共振光散射：d n a ；核酸探针；聚阳离子 l a b s t r a c t b a s e do i ll o t so fd o c u m e n t sa n dc o n d i t i o n so fo n rl a b o r a t o r y , w es t u d yt h ei n t e r a c t i o no f p o l y c a t i o na n dd n ab yr c 墨o i l a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) s p e c t r o s c o p y i tw a sf o u n d t h a tt h e e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o no f p o l y c a t i o u sa n dd n ac o u l do b v i o u s l ye n h a n c et h er l ss i g n a l ，t h e e n h a n c e dr l si n t e n s i t yw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fn u c l e i ca c i d s b a s e do ni t n e wm e t h o d sf o rt h ed e t e c t i o no fd n aw e r ef o u n d s o m ep o l y c a t i o n sw e r es u c c e s s f u l l yu s e d a sn e wp r o b e sf o rt h ed e t e c t i o no fd n ab y 卿n a n c el i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u e t h er e s u l t s s h o w e dt h e s em e t h o d sw e r ev e r ys e n s i t i v e , c o n v e n i a n t ，r a p i da n dr e p r o d u c i b l e u v - s p e c t r a a n df t i r s p e c t r aa r ea l s ou s e dt os t u d yt h em e c h a n i s m so f t h ei n t e r a c t i o n t h et h e s i si sc o m p o s e do f f o u rp a r t sa sf o l l o w ： 1 p l l - p e g p l lw a ss u c c e s s f u l l yu s e da san e wp r o b ef o rt h ed e t e c t i o no fd n ab y r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u e ( r l s ) t h er e s u l t ss h o wt h a ti ti sag o o dw a yt o d e t e r m i n e0 0 6 5 6 - 6 5 6 p g m l ld n aw i t l ip l l - p e g p l l ，t h ed e t e r m i n a t i o nl i m i t ( 3 力w a s 0 4 2n gm l - 1 t h ed e t e r m i n a t i o no ft h em e t h o di sr e l i a b l e ，p r e c i a n ds i m p l e u v - s p e c t r a a n df t - i ra p e c 仃aa r eu s e dt os t u d yt h em e c h a n i s m so ft h ei n t e r a c t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e t h a tt h ec o n f o r m a t i o no ft h ed n ah a sc h a n g e dd u r i n gt h e i n t e r a c t i o nb e c a u s et h e m i c r o “r o n m c n to f d n a c h a n g e s 2 ap o l y c a t i o n ，p o l y m e t h a c r y l o x y l e t h y lb e n z y ld i m e t h y la m m o n i u mc h l o r i d e ( p m b d c a ) ， w a ss y n t h e s i z e da n ds u c c e s s f u l l yu s e da san e w p r o b ef o rt h ed e t e c t i o no fd n ab yr e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u e i tw a sf o u n dt h a tt h ee l e c t r o s t a t i cm t c r a c t i o no fc a t i o n i cp o s sa n d d n ac o u l do b v i o u s l ye n h a n c et h er l ss i g n a l ，t h ee n h a n c e dr l si n t e n s i t yw a s p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f n u c l e i ca c i d sw i t h i nt h er a n g eo f1 7 0 x 1 0 8 - - 4 4 2 x 1 0 _ 6 m o l l 1f o rc a l f t h y m u sd n a ，t h ed e t e r m i n a t i o nl i m i t ( 3 力w a s5 7 x 1 0 9 m o ll - 1 tt h es y n t h e t i c s a m p l e sw e r ed e t e r m i n e dw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s t h er e s u l t ss h o w e dt h i sm e t h o dw a sv e r y s e n s i t i v e ，c o n v e n i e n ta n dr a p i d 3 ap o l y c a t i o n , p o l y a c r y l a m i d e - ( 2 - m e t h y l a c r y l o x y e t h y l ) d i m e t h y lb u t h y l a m m o - n i u m b r o m i d e 】( p ( a m d m b ) ) ，w a ss y n t h e s i z e d t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np ( a m - d m b ) a n dd n a i ss t u d i e db ys p e c t r a lm e t h o d s r e s o n a n c el i g h t s c a t t e r i n gs p e c t r a , f t i r - s p e c t r a a n d u v - s p e c t r aa r eu s e dt os t u d yt h em e c h a n i s m so ft h ei n t e r a c t i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e i i c o n f o r m a t i o no ft h ed n ah a sc h a n g e dd u r i n gt h ei n t e r a c t i o nb e c a u s et h em i c r o e n v i r o n m e n t o f d n a c h a n g e s t h eb i n d i n gc o n s t a n tk o f t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np ( a m d m b ) a n dd n a i s8 0 x 1 0 3l t o o l - i 4 an o v e lc a t i o n i cp o l y h e d r a lo l i g o m e r i cs i l s e s q u i o x a n en a n o p a r t i c l e ( c a t i o n i cp o s s ) w a s s y n t h e s l z e da n ds u c c e s s f u l l yu s e da san e wp r o b ef o rt h ed e t e c t i o no f d n ab yr c s o n a n o el i g h t s c a t t e r i n gt e c h n i q u e ( r l s ) i tw a sf o u n dt h a tt h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o no fc a t i o n i cp o s s a n dd n ac o u l do b v i o u s l ye n h a n c et h er l ss i g n a l ，t h ee n h a n c e dr l si n t e n s i t yw a s p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f n u c l e i ca c i d sw i t h i nt h er a n g eo f 0 3 5 _ 4 2 8 2 嵋m l f o r c a l ft h y m u sd n a ，t h ed e t e r m i n a t i o nl i m i t ( 3 0 ) w a s0 3 2n gm l - 1 t h er e s u l t ss h o w e dt h i s m e t h o dw a sv e r ys e n s i t i v e , c o n v e n i e n t ，r a p i da n dr e p r o d u c i b l e k e yw o r d s ：r e s o n a n c el i g h ts c a r c r i n g , d n a ，n u c l d ca c i dp r o b e s ，p o l y c a t i o n i l l 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：，习移：万 日期：年月 e l 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以 允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的 前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规 定) 作者签名：闺匆矽艺 指导教师签名二窑旧氏蕊 日期： 日期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 光散射现象 光散射存在于只常生活以及宇宙空问。彩虹、日出、日落等美景，都是由于空气中 的灰尘、云、烟雾等颗粒相互作用的光量子散射引起的【l 】。光散射现象广泛存在于光与 粒子的作用过程中，是指当光通过介质时在入射光方向以外的各个方向上所观察到光强 的现象。光散射与介质的不均一性有关，除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的 不均匀性，从而产生散射光，只是由于介质中粒子大小不同，产生不同种类的散射【鼬】。 当介质中粒子直径( d ) 远远大于入射光波长( ao ) 时“ ao ) ，产生的散射可看成是 反射和折射；如果介质中粒子直径与入射光波长相近( dzao ) ，就产生 t y n d a l l 散射； 如果介质中粒子直径很小( d s2 0k ) ，便产生以r a y l e i 曲散射为主的分子散射【2 1 。分子 散射是由于分子热运动造成的局部密度涨落引起的。分子散射比t y n d a l l 散射要弱得多。 但是，即使是十分纯净的液体和气体都能产生分子散射。根据入射光和散射光波长的不 同，光散射又可以分为弹性光散射、非弹性光散射和准弹性光散射。其中，弹性光散射 又称为经典散射或静态散射。a a y l e i g h 散射、介质混浊的t y n d a l l 散射和介质透明的分子 散射均属于弹性光散射。发射光波长和入射光波长不同的r a m a n 散射是光与分子振动交 换能量的非弹性光散射；b r i l l o u i n 散射是由于热声波引起的非弹性光散射。入射光频率 和发射光频率仅有微小差别的准弹性光散射，是由于散射质点的b r o w n 运动所引起的多 普勒效应使散射光频率以入射光频率为中心而展宽，因此可称为动态光散剃3 4 1 。对多原 子分子或基团，荧光是高能电子激发态跃迁到电子激态中的各振动转动态产生的电子振 动跃迁而形成的宽带发射谱，所以在共振光散射测定中，荧光将产生干扰。 1 2 共振光散射技术的原理 根据宏观波动理论，分子散射源于折光指数( m ) 的涨落，而折光指数可以分为实部 和虚部两个部分阁，即肌= 雄蔚，其中，l 是溶液的折光指数，七是吸光系数，在分子吸收 带附近与波长和摩尔吸光系数的关系与分子在整个波长范围的吸收有关，u - j 嗣k r o n i g - k r a m e r s 方程来表裂6 】： 湖北大学硕七学位论文 n = j l o + 2 3 2 0 膏3 。d ：j f 。器苡 j l o + 2 膏2j o 石= 7 靠 式中n o 为纯溶剂的折光指数，c 是溶液的摩尔吸光系数，ao 为入射光和散射光波长，a 为 整个分子吸收带中的任意研究波长，砌) 是所研究波长处分子的摩尔吸光系数。与n 不同 的是，构成m 的七仅与吸收带相关的分子量跃迁有关，它与摩尔吸光系数q ) 的关系是： ：芈 这样就得到表征体系光散射特征的瑞利 ：e ( r a y l e i g h r a t i o ) ，在与入射光成9 0 。角处检测， 瑞利比大小为【6 1 ： j l = 警 ( a 删+ ( a 删】c ( 3 ) 式中n a 为a v o g a d r o 常数，a n 8 c 和a 纠a c 分别是1 0 m o ll 溶液中表示折光指数实部和 虚部的增量，c 。是表示光散射增加的c a b a n n e s 因子。引入以和七，可得 n 业斧堂叫辫】2 + 蝉4 , 。0lc，i ( 4 ) 因此如果入射光波长远离分子吸收带，则o k o c = 0 ，如果d _ 2 0 2o 获得的光散射光谱主 要决定于折光指数的实部，散射光强度遵从r a y l e i g h 散射定律，即散射光强度与波长的 四次方成反比川， ，= 驾芋( 糍) 2 ，o ( 5 ) 其中功散射光强度，o 为入射光强度，a 为入射光和散射光波长，为单位体积内粒子数 目，v 是一个粒子的体积， l 和一2 分别表示散射相和介质的折光率。如果入射带波长接近 于分子吸收带，o k o c o ，即除折光指数的实部对光散射有贡献外，虚部也具有相当 大的贡献，特别是吸收带强烈时贡献更大，将产生共振r a y l e i 咖光散射增强，增强与分 子吸收带中的跃迁有关。但此时的光散射强度还比溶剂的散射强度低1 2 个数量级，因 而要求激光作激发光源并使用高浓度有机染料【6 1 。但如果分子形成了聚集物，便产生了 强烈的共振r a y l e i g h 光散射增强，即使用普通分光光度计都能检测到哺4 ”。值得注意的是 2 第一章绪论 由于分子同时吸收入射光和散射光，因而在分子的最大吸收处常得到较低的光散射强 度。 根据式( 2 ) 所示的s 与_ | 的关系，折光指数的虚部与分子吸收光谱具有相似的形状，相 反由式( 3 ) 的k r o n i g - k r a m e r s 积分，折光指数的虚部与分子吸收带分布的高能区和低能 区有关。在高能区，虚部的贡献是正的，实部的贡献是负的，二者抵消：在低能区，二者 同为正掣1 2 1 ，因而在通常的共振光散射光谱中，最大共振光散射信号常位于共振吸收的 低能区，从而在严格意义上讲，可能获得前共振光散射光谱( p r e r e s o n a n c el i g h ts e a t t e a - i n g s p e c t r u m ) 【5 1 3 1 ，值得注意的是，式( 4 ) 考虑的是分子散射，即主要是从共振r a y l e i 曲 散射增强的角度出发的。实际上，从目前的研究中，我们还没有确定散射粒子大小是否 满足d s 2 0 知的条件。同时由于共振光散射光谱的测定通常是在较大的激发和发射单色 器通带宽度( 5 蛐) 下进行的( 当通带宽度小于5 0n n l 时，光谱发生很大的畸变，且散 射光强度较弱) ，因而所得到的共振光散射光谱中含有动态光散射成分，从而使共振光 散射强度在散射粒子浓度较大时的出现较大的波动。共振光散射( r o n a n c el i g h t8 c a r e l - - i n g ，r l s ) 信号的组成如图1 - l 所示。 图1r l s 信号的成分 f i g u r ei 1t h e c m n p o n e n t s o f r l ss i g n a l s 3 湖北大学硕士学位论文 1 - 3 共振光散射技术的试验方法及分析定量方程 在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度，采用相等的激发和发 射波长同时扫描激发和发射单色器所得的同步光谱( 即a 2 = o ) 即为散射粒子的共振光散 射光谱7 1 6 1 。 由于共振光散射光谱属于同步光谱，而散射光是源于等波长入射光激发散射粒子时 产生的，因此散射粒子实际上是能发射出与激发光波长相等的新发光体，故而共振光散 射信号属于同步发光。根据同步发光方程 6 1 ： j s l = 脚。( | ：i 。) e 。( 。+ ) ( 6 ) 式中如是在给定激发光波长处的激发函数，e 赢是发射光波长处的发射函数，k 是 与仪器条件常数有关的常数，b 是液池厚度。当越= o 时，即得共振光散射强度 1 l , 1 2 ： l m = 弛。( 。) e 。( a 。) ( 7 ) 即在仪器条件一定时，共振光散射强度与散射粒子的浓度成正比，据此荧光分光光 度计可用于散射粒子的定量测定1 7 , 1 4 - 16 】。 1 4 共振光散射测定确定有机染料的聚集 1 4 1 有机染料的聚集 生物色素广泛存在于自然界。研究生物色素参与生物物理和化学过程具有十分重要 的意义。早期报道在水溶液介质中具有共振光散射信号的化合物有番茄红素【1 7 】、香豆素 e t a 、3 。4 二硝基苯酚【、二苯甲酞甲剧19 1 、花普染料2 0 l 和血红蛋白剀等。但这些化合 物的共振光散射强度都较低，甚至比溶剂本身的普通瑞利散射低l 一2 个数量级，因而必 须采用激光光源。而这些化合物一旦形成染料聚集体，就可以观察到强烈的共振光散射 信号增强阱】。通过耦合普通荧光仪的激发和发射单色器，p a s t e m a c k 等建立了共振光散 射技术，研究了卟啉2 3 洲、叶绿素a 【2 5 阗、金属配合物【2 刀的聚集。卟啉自组装可代表超 分子化学的进展，这是因为卟啉单体通过冗兀堆积效应和o 霄引力自组装为二聚体或多 聚体，从而使得模拟复杂的物化过程具有可能【2 引，并且为在纳米电子应用中合理设计自 组装超分子结构以及合成具有特殊性能和功能的材料奠定基础 2 9 1 。 带电荷的水溶性卟啉，可以通过静电引力进行聚集。可通过各种分光方法，包括r l s 方法来研究卟啉在不同介质中的聚集 3 0 1 。阴离子卟啉，如t p p s 4 ，t c p p ，由于静电和疏 4 第一章绪论 水作用，形成j 型和h 型聚集体。由于聚集体内分子间发生电子耦合，形成了更大的离域 电子共扼体系，提高了平面振子的简并度，j 型和h 型聚集体的吸收峰增强，从而导致r l $ 信号增强，单体则无此现象1 3 0 , 3 1 捌。进一步研究显示，水溶液中的h + 和n a + 对于j 型t p p s 4 的结构有着不同的驱动力，聚集数目的范围在6 3 2 ，在大的聚集体中，甚至可能达到 1 0 5 l 俨3 引。类似的，也可以通过r l s 方法来测定叶绿素在有机溶剂中形成的纳米级的自 组装聚集体。并且发现，形成的球形聚集体可以产生色素，从而使卟啉环的亲水头部朝 向水溶液【蚓。 离子卟啉( 如h 2 t h p p ) 在水溶液中存在聚集体，在4 4 0 - 4 8 0n t n 范围内出现强烈的 r l s 信号，但当加入乙醇等有机溶剂时，由于聚集体解聚，增强的r l s 信号又降低了嘲。 在极性、酸度、离子强度不同的溶剂中，有机染料的聚集非常常见，如罗丹明类染料在 水溶液中聚集，产生增强的r l s 信号，特征r l s 峰位于荧光的激发和发射带之间【蚓。 1 4 2 有机染料在聚合物模板上的堆积 通过吸收、荧光、圆二色谱以及r l s 技术，基于带电卟啉与带相反电荷的聚合物， 如表面活性剂、核酸、蛋白质 3 7 , 3 8 】等的相互作用，建立了一种新方法。叶绿素的色素 聚集可以通过r l s 技术测定。在胶束中，带正电的表面活性剂与单体卟啉上的酯基c 1 3 2 相互作用，形成离域电子【3 9 】。 金属卟啉在离子或非离子表面活性剂诱导下，表现出不同的聚集特征。金属卟啉包 括f e t p p s 4 和z n t c p p s 4 ，可以与胶束离子结合，形成非胶束金属卟啉表面活性剂聚集体， 其结合率和结合常数可通过紫外、荧光以及共振光散射方法测定。结合率和结合常数随 着金属离子的变化而变化 4 0 , 4 ”。 当有机小分子与蛋白质、核酸等生物大分子作用时，由于生物大分子起着模板的作 用，每个结合单元有较大的结合数，因此有机染料在生物大分子表面形成大粒子聚集体， 产生强烈增强的r l s 信号h “7 1 ，这也就证实t a n g l i s t e t 等的预言，他们最早预言：有机 染料或其他吸光物质与蛋白质或核酸的多位点结合，将产生灵敏的r l s 信号。 核酸与c t ，b ，t ，5 - 四( n - 甲基) 4 毗啶基卟啉( t m p y p _ 4 ) 和a ，p ，t 5 - 四( 4 - - - - - 甲铵苯 基卟啉( t a p p ) 作用时都能观察到红移现象，但只有t a p p 和质子化t a p p 与核酸作用 时才产生增强r l s 信号1 ，这是因为t a p p 和质子化t a p p 在核酸分子表面的堆积，诱导 了核酸超螺旋结构的形成 4 4 , 4 s ，并且还可能发生质子化核酸到t a p p 的质子转移【舶】。铜 ( i i ) 卟啉，根据与d n a 模板作用的取代基不同，可以插入限制或者形成大的电子耦合， 5 湖北大学硕七学位论文 电子耦合的r l s 特征光谱与吸收峰相对应i 蜘。类似的，有关阳离子卟啉在p o l y ( d a - d t ) 2 或者p o l y q g d c k 表面的长距离自组装的r l s 信号表明耜邻口p 啭发生电子耦合，大规模 自组装表现出卟啉的高疏水性 4 8 1 。 同理，藏红t ( s d 、酚藏花红( p s ) 、硫酸耐尔蓝( n b s ) 、亚甲蓝( m b ) 【4 ”1 1 ，在核酸 分子表面的长距组装也产生特征r l s 光谱。这些聚集可以通过r l s 数据进行s c a t c h a r d 分 析所得到的结合数和结合常数确定，醌亚胺类染料在核酸模板上聚集的结合数在4 巧， 结合常数在1 0 4 1 0 5lt o o | 1 范围内。 蛋白质与有机染料如铬天青s ( c a s ) 5 2 、酸性铬蓝k ( a c b k ) f 明等作用，产生强烈 的r l s 信号，其特征r l s 峰与这些染料的最大吸收带一致，表明分子吸收在r l s 光谱分 析中起重要作用。 另外，g - q u a d r u p l e xd n a 可以通过发色团依赖州进行自组装来选择性地结合 p e r y l e n ed i i m i d e 【s 4 5 1 。依赖p h 进行自组装的发色团可应用于p h 传感器，它们的超分子 聚集体可应用于d n a 传感器1 5 6 1 。 1 5 共振光散射技术的应用研究 光散射技术在物理化学，胶体化学和高分子化学研究中具有十分重要的地位，但在 分析化学中尚未得到充分的应用，尤其在荧光测定中散射光是一种很大的干扰源。但自 从1 9 9 3 年p a s t e m a c k 等使用普通荧光分光光度计建立共振光散射技术研究生物大分子识 别、组装和聚集以来，共振光散射技术引起了研究者的广泛兴趣。在短短几年中，发展 十分迅速，使这一技术广泛应用于无机离子、蛋白质、核酸和药物的测定中。r l s 的发 展如图1 2 、图1 3 所示。 1 5 1 金属离子、表面活性剂和药物分析 金属离子分析在分析化学中占有十分重要的地位。其方法之一是基于金属离子与阴 离子染料形成离子缔合物。由于染料的自聚集，罗丹明6 g 在激发和发射带的中间有一个 特征的r l s 峰，加入碘负离子降低了r l s 强度，但在长波方向出现了一个新的r l s 峰锅， 结晶紫( c v ) 、孔雀石绿( m g ) 、亮绿( b g ) 等三苯甲烷类染料有微弱的r l s 信号，当它们与 碘负离子和金属离子形成离子缔合物后能产生新的r l s 峰，根据产生的新的r l s 峰，能 测定纳克级的h 颤i i ) 、c r ( 1 l i ) 、s “) 离子【5 7 - 6 0 。表1 1 列出了测定糖类和药物等的r l s 法【6 1 4 n 。 6 第一章绪论 图1 - 2r l s 技术在分析化学中的主要成就 f i g u r e l 2 m a j o r a c h i e v e a n e n t s o f r l s t e c h n i q u e i na n a l y t i c a lc h e m i s t r y 厂 1 图l - 3r l s 近年来的研究热点 f i g u r e1 3a n a l y t e so f i n t e r e s ta n dt h e i r 日o u g ht i m er a n k i n gi nr l sh o m o g e n o u sa s s a y s 7 固回回国回国巨 表1 1 测定表面活性剂和药物的r l s 方法 t a b l e1 1d e t e r m i n a t i o n so f s a c c h a r d e sa n dm e d i c i n e s 硒me n h a n c e dr l ss i g n a l s ( g m 1 ) g m 1 5 2 蛋白质分析 开发新的蛋白质分析方法在临床和实验室分析中都有十分重要的意义。经典的蛋白 质分析方法有b i u r e t 、b r a d f o r d 、l o w r y f h l b r o m c r e s o lg r r e n ( b c g l ，但这些染料结合法费 时且操作复杂，而使用有机染料通过r l s 法测定蛋白质操作简单方便。用于r l s 法测定 蛋白质的有机染料包括三苯甲烷、卟啉、和偶氮类等染料，此外，金属配合物和黄酮也 用于蛋白质的分析。表1 2 列出了蛋白质分析的r l s 方法( 亿9 7 1 。 8 第一章绪论 表1 2 蛋白质分析的r l s 方法 t a b l e1 2d e t o r m i n a t i o n so f b o v i n es e 九瑚a l b u m i nb a s e do l li t se n h a n c e dr l s s i g n a l s o nc h r o m o p h o r c s a n i o np o r p h y r i n s1 8 6 4 9 0 2 n ，p t ，& t e t r a k i s ( 4 - s u l f o p h e “y 1 ) p o r p h i n ef r p p s , ) t r i p h e n y l m e t h a n e 4 1 02 7 7 f u c h s i n ea c i d ( f s a ) x a n t h o n ed y e s 3 6 - 4 23 4 7 p y r o g a l l o lr e d ( p r ) a z o d y e s 4 - a z o c h r o m o t o r o p i ca c i d d i b r o m o m e t h y l - a r s e n a z o - a l ( i i l l 5 6 _ 7 24 1 0 d i b r o m o m e t h y l c h l o r o p h o s p h o n a z o 3 7 8 _ 4 3 54 11 6 ( d b m - c p a ) a m a r a n t h 3 8 73 6 4 m o n o a z od y e s ( c h r o m a z o lk s ，3 8 ，3 驰2 3 3 8 ，3 1 4 ， a c i d ，c h r o m ed a r kb l u e ，c h r o m e3 4 - _ 4 23 3 0 ，3 3 6 。 b l u es e ，a c i dc h l o n eb l u ek3 3 8 c h l o r o p h o s p h o n a z oi ，a r - n n a z o 1 ，c h r o m o t r o p ez g ) t h ( 1 b i s a z od y e s o f c h r o m o t r o p i ca c i d s a r s e n a z oi l i ( a ae 1 1 ) ， o r a n g e g n a p h t h a l e n ed i s u l f o n i ca c i d ( s p a d n s ) b e r y l l o ni i b e r y l l o ni i - a i ( i i i ) m - a c c t y l c h l o r o p h o s p h o n a z o ( c p a - m a ) f a s tr e dv r ( f r v ) t i t a ny e l l o w ( t y ) a j s e n a i c h l o r o p h o s p h o n a z o l l i ( c p al i i ) ， c h l o r o s u l f o n p h e n o ls ( c s ps ) ， a c i d i c m e d i u m a c i d i c m e d i u m a c i d i c m e d i u m 0 6 _ 之o 3 8 0 5 6 _ _ 7 2 4 1 3 5 2 4 1 3 2 9 4 1 4 7 0 4 7 0 4 7 0 5 4 8 0 1 5 _ o 81 8 【7 2 】 o 一3 80 4 7 o 2 5 一1 3 o5 1 0 2 孓- 5 01 3 5 o o 0 6 5 加03 0 5 o 5 5 o 1 o _ - 7 ol o m 2 o o _ - 2 8 o 1 6 o 5 5 o 一0 1 0 一3 2 t 锄 4 0 0 - 4 2 00 2 4 1 2 4 0 80 5 n - 3 0 0 2 8 7 0 4 0 0 3 7 5 0 1 墙o 0 1 5 o o 1 8 o 1 5 o 1 3 6 2 2 1 1 0 7 2 6 8 7 0 5 2 7 7 1 1 2 7 6 0 3 9 o 【7 3 7 4 】 【7 5 1 【7 6 【7 7 】 【7 8 】 【7 9 】 7 9 】 f 7 9 【8 0 【8 l 】 【8 2 1 【8 3 1 【8 4 】 【8 5 】 【8 6 】 【8 7 】 9 湖北大学硕士学位论文 1 5 3 核酸分析 核酸的定量基础是核酸与染料作用，特别是核酸与有机染料之间的能量转移产生的 荧光增强己广泛用于新的发光生色团的设计、免疫分析和d n a 芯片研究中【9 引。有机染料 如溴乙锭己广泛应用于化学及生物化学研究中。通过使用激光设备能检测到有机染料被 d n a 增强的荧光单分子d n a 和在p c r 放大过程中的d n a 都能被灵敏测赳9 9 1 。 目前，d n a 的定量分析主要有三种方法：1 光度分析法。包括基于磷含量的光度分 析法、基于碱基的紫外吸收光度分析法和基于戊糖含量的光度分析法三种；2 荧光分析 法。应用于d n a 测定和结构研究的是各种荧光试剂探针；3 共振光散射技术。各种超 分子、小分子、高分子和有机小分子染料用于此方法测定d n a 。其中光度分析法大都 繁琐、耗时长。尽管荧光分析法以其高灵敏度和高选择性在d n a 的定量分析中发挥着 十分重要作用，但不少经典的荧光探针存在不稳定、可能致癌、价格昂贵等缺陷。而共 振光散射作为一种新兴的技术，具有简便、快速、灵敏度高、选择性好等优点，但其在 分析化学中的应用和研究中还有很多的不足，其理论，尤其是成因方面还存在较多争论， 需要做大量工作来进一步完善。 l o 第一章绪论 水溶性卟啉t a p p 是最早用于r l s 法测定核酸的染料【l o o 。t a p p 诱导核酸超螺旋结 构形成，从而产生强烈的r l s 信号，能检测到1 4n gm l l 的d n a 。如果加入第二种染 料如澳连苯三酚红( b p r ) 灵敏度会更耐1 0 1 ，m 1 。二元配合物钻( i i ) 钻试剂与d n a 作用产 生特征峰位于5 4 7 n m 的强烈r l s 信号，其检测限低于ln gm u lb 0 3 ，比使用溴乙锭的 荧光分析法更灵敏。在一些表面活性剂存在下，d n a 与染料产生共振光散射信号的增 强作用的研究也时有报道。如碱性三苯甲烷染料亮绿( b g ) 和孔雀石绿( m g ) 与核酸结合 后的r l s 强度变化不明显，而在溴代十六烷基甲基铵( c t m a b ) 的存在，b g l l 0 4 和m g 【0 5 1 与d n a 体系的共振光散射信号大大增强。 阳离子表面活性剂作为与核酸反应的共性剂( c s ) 与核酸反应使其r l s 信号急剧增 强。刘绍璞等研究发现5 种c s 与核酸具有相同的反应条件和光谱曲线，并对五种阳离 子表面活性剂与核酸的反应机理、核酸构象对r l s 信号的影响等进行了讨论【l 删。 李正平将大粒子散射( 粒子直径在2 0 0 7 0 0 啪，其散射光的性质属于d e b y e 散射和 m i e 散射，称其为大粒子散射技术) 用于核酸的共振散射分析【1 0 7 1 ，效果很好。在强酸性 介质中，核酸首先变性，然后单链核酸聚集为大粒子，粒子的大小与紫外可见光的波长 相当，由动态激光散射仪测得在强酸性介质中粒子的水合半径与其浓度呈线性关系【1 0 8 j 。 由大粒子产生的光散射强度在很宽的范围内与核酸的浓度成j 下比，该方法具有灵敏度 高、线性范围宽、操作简便、所用试剂易得的优点，应用i ； 景广泛。 硫酸鱼精蛋白是一种小分子蛋白，它能与核酸通过强静电力作用结合为大粒子的复 合物，其散射光强度在p h2 2 - 4 4 的b r i t t o n - r o b i n s o n 缓冲溶液中达到最大n 0 9 。由此建立 的核酸的大粒子散射分析方法的线性范围为0 0 5 - - 6 0 0p gm l ；其检出限分别为1 2 5n g m l 的小牛胸腺d n a 、9 0n gm l 。的鱼精子d n a 、18 0n gm l 。1 的酵母r n a 。其优点是蛋 白质、核苷酸和大部分金属离子都不干扰测定结果。 有关金属离子及其络合物与核酸作用的共振光散射现象的研究也有报道。黄承志 发现c o ( i i ) 5 c 1 p a d a b 在核酸上的堆积对共振光散射信号的增强现象，并将其用于核 酸的高灵敏测定【1 1o 】。在p h 2 2 1 的酸性介质中，a 1 3 + 与d n a 分子表面的磷酸根发生静电 作用，产生增强的共振光散射信号 1 1 1 1 。与染料不同的是，金属离子没有生色团，因而 它们与核酸和蛋白质等生物大分子的作用受光吸收的影响小，主要体现出粒子大小对 r l s 信号的影响，许金钩等发现核酸对氯化银溶胶的共振光散射信号有猝灭作用，认为 是游离的银离