（生物化学与分子生物学专业论文）苎麻生物脱胶研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r s t f 【e s i s 摘要 本研究应用生物酶类脱胶方法对苎麻进行生物脱胶，试图寻找一种简便、 廉价的苎麻脱胶生产加工方法，达到提高苎麻产品档次，同时保护环境的目的。 论文探讨了满足苎麻生物脱胶的生物菌种应具备的条件，初步鉴定了菌种类别 以及菌种的产酶类型；分析了菌种筛选、培育以及生物脱胶方法和碱液补充精 炼的加工工艺；并总结了苎麻生物脱胶方法的特点。 我们分析了脱胶所需菌种的各种条件，然后进一步选育，得到了三种具有 较好脱胶效果的嗜碱细菌，并对它们进行了较为深入的研究。初步鉴定了三种 嗜碱细菌的菌种类型，分析了它们的酶学特性，探讨了嗜碱细菌的工艺条件和 其他辅助条件对脱胶效果的影响以及细菌脱胶后的碱液补充精炼的工艺条件， 并进一步讨论了生物脱胶后的苎麻各种性能以及脱胶后废液中的b o d 、c o d 的数值。该生物脱胶方法简易，方便，实用。菌种脱胶初步残胶率达到9 左 右，比酶类其他方法脱胶效果好。经较低碱液浓度( 0 6 n a o h ) 进一步煮炼， 残胶率为1 左右，完全符合纺纱要求。 结果表明：1 ) 从不同污泥、土壤、污水中选取的8 0 0 种不同菌种，在碱性 条件下能生存的有3 2 0 种。经碱性苎麻培养基筛选后，发现有3 种嗜碱细菌脱 胶效果好。b 3 、b 6 、b 7 残胶率初步测定分别为1 4 3 、1 2 1 、1 3 9 ，其中 b 6 效果最好。三株菌株初步鉴定为嗜碱芽杆孢菌。2 ) 对嗜碱细菌酶学性能进 行研究，将三株菌株以羧甲基纤维素为底物来测定纤维素酶，均测不出酶活力。 将它处理的苎麻和j a 纤维素酶处理过的苎麻分别用显微镜放大看毛羽，j a 纤 维素酶处理过的苎麻表面毛羽基本不存在，而b 6 处理过的苎麻表面毛羽很明 显存在。用果胶培养基培养嗜碱细菌，测定果胶酶的活力，b 6 菌株产碱性多 聚半乳糖醛酸酶的活力二天后达3 7 1 0u m l ；测定半纤维素酶活力，b 6 在半纤 维素培养基和苎麻培养基中培养一天后的活力分别为1 0 5u m l 和9 0u m h 测 定木质素酶的活力，b 6 在苎麻培养基中培养，纤维中木质素含量由0 9 6 降到 o 6 2 ，降低了o 3 4 。3 ) 脱胶工艺条件通过正交法确定，比较好的脱胶条件 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l 5 , 是：接种量为1 0 ，脱胶时间为2 4 h ，p i l l 0 ，温度4 0 0 c ，残胶率为1 0 2 。另 外苎麻通过脱胶前的机械预处理，然后脱胶2 0 h ，测定脱胶率比未处理的高4 ； 添加物如e d t a 和缓冲液使脱胶率提高了1 ：搅拌使脱胶率提高了1 2 ；原 麻质量和重量并不影响脱胶率。为了达到纺纱要求，进一步用碱液精炼，碱液 浓度仅为0 6 n a o h ，残胶率为o 。8 5 。4 ) 脱胶后苎麻性能：通过菌静脱胶 后，苎麻茎横截面中的苎麻组织在显微镜下可见松散的纤维；单纤维的强力比 常规化学脱胶麻( 0 5 7 ) 高0 1 5 ：结晶度指数o 8 5 ，比化学脱胶的高o0 8 ； 用活性艳红1 ( o w f ) 染色，在3 0 分钟后，生物脱胶的苎麻上色率比化学脱 胶的高1 5 ：排放液中的b o d 、c o d 比化学法的分别低1 5 0 2 0 0 m g m l ， 4 0 0 6 0 0 m g m l ，生物法脱胶p h 值为7 - 8 ，化学法脱胶p h 为9 - 1 i 5 。 以上结果表明：1 ) 嗜碱细菌来自自然界，容易得到，可用苎麻培养基培 养，并能在碱性条件下生存，符合苎麻脱胶条件，脱胶效果好。2 ) 三种嗜碱 细菌不产生纤维素酶，产生果胶酶，半纤维素酶和木质酶，说明细菌不对苎麻 纤维产生损伤，并且通过果胶酶等多种酶的联合催化作用，共同降解苎麻胶质 中的多种组分，脱胶效果好。3 ) 脱胶工艺条件为：接种量为1 0 ，脱胶时间 为2 4 h ，p h l 0 ，温度4 0 0 c 。脱胶前的机械预处理，添加物，搅拌等因素也能促 进苎麻生物脱胶，但原麻质量和重量并不影响脱胶率。碱液补充精炼条件为： o 6 n a o h ，1 n a 3 p 0 4 ，压力为2 k g c m 2 ，时间2 h 。通过生物与碱液的联合 脱胶，完全可以达到纺纱要求。4 ) 细菌脱胶后苎麻纤维完全可以从木质化的 木质层中分化出来，有利于酶液渗透，便于脱胶。单纤维强力、结晶度系数均 比化学法处理的苎麻高，并且生物脱胶提高了染色深度。废液中b o d 、c o d 低，p h 值近中性，大大保护了环境。总之，苎麻生物脱胶方法对苎麻企业在 脱胶方面的技术改造奠定了基础。 关键词：苎麻嗜碱细菌生物脱胶酶活力工艺条件 残胶率 脱胶率 硕士学位论文 m a s i e r st 卜t e s i s a b s t r a c t t h eb i o l o g i c a ls c o u r i n go fr a m i eu s i n ge n z y m e sw a sr e p o r t e di nt h i st h e s i s t h ec o n v e n i e n ta n dc h e a pm e t h o do fr a m i es c o u r i n gw a se x p l o r e di no r d e rt o e n h a n c et h el e v e lo fp r o d u c t i o na n dp r o t e c te n v i r o n m e n t i tw a sd i s c u s s e dt h a tt h e o p t i m a lq u a l i f i c a t i o n o fb a c t e r i au s i n gi nt h er a m i es c o u r i n ga n dt h ec l a s s i f i c a t i o no f t h e s eb a c t e r i aa n dt h e i re n z y m e s t h ec h a r a c t e r i s t i c so fr a m i e s s c o u r i n gw e r e s u m m a r i z e di n c l u d i n gt h eb a c t e r i as e l e c t i n g ，c u l t i v a t i n g ，b i o l o g i c a ls c o u r i n ga n dt h e s c o u r i n gp r o c e s so fh y d r o x i d e ss u p p l e m e n t u s i n gs e l e c t i n gm e d i u m ，8 0 0 k i n d so f b a c t e r i aw e r ed e t e c t e df r o md i f f e r e n tr e g i o n s ，s l u d g e ，s o i la n dw a s t e rw a t e ra n d 3 2 0 s t r a i n sw e r ea l i v ei na l k a l i n ec o n d i t i o n a m o n gt h e m ，o n l yt h r e ek i n d so fa l k a l i n e b a c t e r i a ( b 3 ，b 6a n db 7 ) s h o w e d t h ea b i l i t yo fr a m i es c o u r i n g t h e s eb a c t e r i aw e r e p r e l i m i n a r i l y i d e n t i f i e da n dt h e i r e n z y m e c h a r a c t e r i s t i c sw e r ea n a l y z e d t h e t e c h n o l o g i c a lp r o c e s so f t h ea l k a l i n eb a c t e r i as c o u r i n g ，o t h e ra s s i s t a n tc o n d i t i o n so n b i o l o g i c a ls c o u r i n ga n dt h et e c h n o l o g i c a lp r o c e s so fh y d r o x i d e ss c o u r i n gw e r e i n v e s t i g a t e d t h ec h a r a c t e r i s t i c s o fr a m i eh a v i n gb i o l o g i c a l s c o u r i n ga n db o d ， c o di nt h es c o u r i n gw a s t et h r o u g hb i o l o g i c a ls c o u r i n gw e r e a l s od i s c u s s e d i tw a s f o u n dt h a tt h i sp r o c e d u r ew a se a s y , c o n v e n i e n ta n dp r a c t i c a l t h ep r e l i m i n a r y r e m a i n i n gr a t ew a s9 b y t h eb a c t e r i as c o u r i n gt h a tw a sm u c hb e t t e rt h a no t h e r s c o u r i n gw a y s t h er e m a i n i n gj e l l y s r a t ew a sf u r t h e rd e c r e a s e dt o1 b o i l e db y a d d i n gl o w e rc o n c e n t r a t i o no fh y d r o x i d ef o n l y0 6 n a o h ) i tw a sp r o v e dt o b e s a t i s f i e dt ot h ed e m a n do f y a r n i n g t h er e s u l t ss h o w e d ：1 ) 3 2 0k i n d so fb a c t e r i ao f8 0 0k i n d sf r o md i f f e r e n td i r t ， s o i la n ds e w a g ec o u l dg r o wi nt h ea l k a l i n ec o n d i t i o n s ，a n do n l yt h r e ek i n d so f b a c t e r i a ( b 3 ，b 6a n db 7 ) s e l e c t e df r o mt h em e d i u mo f r a m i es h o w e dt h eb e t t e r e f f e c to f s c o u r i n g t h er e m a i n i n g r a t e so f b 3 ，b 6 ，a n db 7 w e r er e s p e c t i v e l y1 4 3 ， 1 2 1 ，1 3 9 ，a n db 6w a st h e b e s t t h et h r e eb a c t e r i aw e r ep r e l i m i n a r i l y d e s i g n a t e d a st h eb a c i l l u sa l c a l o p h i l u s 2 ) t h ee n z y m ec h a r a c t e r i s t i c so ft h e a l k a l i n eb a c t e r i aw e r ed e s c r i b e d ：t h e yw e r en o ta b l e t od e c o m p o u n dt h ea c e t i c i v 硕士学位论文 n t i s t e r st i 正s i s m e t h y l - c e l l u l o s e ，b u tb 6s h o w e dt h ea c t i v i t yo fp e c t i n a s e ( 3 7 1 0u m la f t e rt w o d a y s ) a f t e rb 6w a s c u l t i v a t e di nh e m i c e l l u l o s eo rr a m i en u t r i t i o nm e d i u m sf o ro n e d a y , t h eh e m i c e l l u l o s e sa c t i v i t yw e r e1 0 5u m la n d9 0u m lr e s p e c t i v e l y i tw a s f o u n dt h a tb 6c u l t i v a t e di nr a m i en u t r i t i o nm e d i u mc o u l dr e d u c et h ec o n c e n t r a t i o n o fl i g n i nf r o m0 。9 6 t 0o 6 2 。3 ) t h eo p t i m a l p r o c e s sc o n d i t i o n s ，i e 1 0 i n o c u l u m sr a t i o ，2 4h o u r s ，p h1o ，4 0 0 c ，w e r ed e t e r m i n e db yt h en o r m a lc r o s s s m e t h o d t h er a t eo f r e m a i n i n g j e l l yw a s1 0 2 a f t e rr a m i ep r e t r e a t e dm e c h a n i c a l l y a n dt h e ns c o u r e df o r2 0h o u r s a n dt h es c o u r i n gr a t ew a sm o r e4 t h a nt h ec o n t r 0 1 t h e r e m a i n i n gj e l l yr a t ew a s d e c r e a s e d1 2 a n dl r e s p e c t i v e l yb ya g i t a t i o na n d b y t h ea d d i t i o no fe d t aa n db u f f e r t h ee q u a l i t ya n d q u a n t i t yo f i n i t i a lr a m i ed i d n t a f f e c tt h es c o u r i n gp e r c e n t a g e t os a t i s f yt h ey a r n i n gd e m a n d ，h y d r o x i d e sc o u l db e u s e dt of u r t h e rs c o u r t h ec o n c e n t r a t i o no fh y d r o x i d e sw a so n l y0 6 n a o ha n d t h er e m a i n i n gj e l l y sr a t ew a s0 8 5 4 ) t h er a m i e sc h a r a c t e r i s t i c sa f t e rs c o u r i n g ： t h es t r e n g t ho fs i n g l ef i b e rw a sm u c hm o r e0 15 t h a nt h a to ft h eu s u a ir a m i e s c o u r e d ( o 5 7 ) t h ec r y s t a l l i n i t yi n d e xw a s0 8 5 ，w h i c hw a s o 0 8m u c hm o r et h a n t h em e t h o do fs c o u r e dw i t hc h e m i s t r y w h e nr a m i ew a sd y e df o r3 0m i nw i t h1 a c t i v ec o l o r f u lr e dd y e s t u f f ( o w f ) ，t h ee x h a u s t i o no f d y e sb yb i o l o g i c a ls c o u r i n gw a s m u c hm o r e15 t h a nt h a tb yc h e m i c a ls c o u r i n g b o da n dc o d i nt h eb i o l o g i c a l w a s t el i q u i dw e r er e s p e c t i v e l yl o w e r15 0 2 0 0 m g l ，4 0 0 - 6 0 0 m g lt h a nt h a ti nt h e c h e m i c a lw a s t el i q u i d i nt h eb i o l o g i c a ls c o u r i n gp h w a s7 - 8 ，w h i l ei nc h e m i c a lo n e p h w a s9 - 1 1 5 t h er e s u l t si n d i c a t e d ：t h a tt h ea l k a l i n eb a c t e r i ac o m ef r o mn a t u r ea n dc o u l db e o b t a i n e de a s i l y t h e s eb a c t e r i ac a nl i v ei na l k a l i n ec o n d i t i o n sa n du s ei nt h er a m i e s s c o u r i n gd e m a n d s 。n et h r e eb a c t e r i ad i d n tp r o d u c ec e l l u l o s e a s e ，a l t h o u g ht h e y c r e a t e d p e c t i n a s e h e m i c e l l u l a s e a n dl i g n i n a s e t h e b i o l o g i c a ls c o u r i n g d i d n t d e c o m p o s et h ec e l l u l o s ea n dt h ec o m b i n a t i o nu t i l i t i e so f s e v e r a le n z y m e sh a dt h e b e t t e re f f e c to fs c o u r i n g o t h e rf a c t o r s s u c ha st h ep r e t r e a t m e n t ，a d d i t i o n s ，a g i t a t i o n ， c o u l dp r o m o t et h eb i o l o g i c a ls c o u r i n g ，b u tt h ee q u a l i t ya n dq u a n t i t yo f i n i t i a lr a m i e d i d n ta f f e c tt h e s c o u r i n gp e r c e n t a g e t h es u p p l e m e n t a r yh y d r o x i d e ss c o u r i n g v 硕士学位论文 m a s t e r st i f e s i s c o n d i t i o n sw e r e0 6 n a o h ，1 n a 3 p 0 4a n da tt h ep r e s s u r eo f2k e d e m 2f o r2 h o u r s t h ec o m b i n a t i o no fp r o c e s so fb a c t e r i aa n dh y d r o x i d ec o u l dc o m p l e t e l y s a t i s f yt h ed e m a n d s o f y a m n l ef i b e r ss e p a r a t e df r o mp h e l l e ml a y e r sa f t e rs c o u r i n g w e r eb e n e f i c i a lt op e n e t r a t ea n ds c o u r t h es i n g l ef i b e r ss t r e s sa n dt h e c r y s t a l l i n i t y i n d e xw e r em u c hm o r et h a nt h a tw i t hc h e m i s t r y t h eb i o l o g i c a ls c o u r i n gi n c r e a s e s t h ee x h a u s t i o no f d y e s b o d ，c o di nt h eb i o l o g i c a lw a s t el i q u i dw e r el o wa n dp h w a s n e a r l yn e u t r a l s oi tc o u l dp r o t e c te n v i r o n m e n t i naw o r d ，t h em e t h o do fr a m i e b i o l o g i c a ls c o u r i n g b u i l tt h ef o u n d a t i o nf o rt h e t e c h n o l o g i c a lr e f o r mo fr a m i e i n d u s t r i e s k e y w o r d s ： r a m i et h eb a s i cb a c t e r i a b i o l o g i c a ls c o u r i n ga c t i v i t y t h es c o u r i n g p e r c e n t a g e t h ep r o c e s sc o n d i t i o n s 淼篡。 1 前言 生物技术应用于纺织工业具有广阔前景。为了发展苎麻纺织业，迸行苎麻 生物酶法脱胶，既提高了苎麻产品的档次，同时也保护了环境，对苎麻企业的 技术改造也奠定了基础。 1 1生物酶法在纺织行业的应用状况： 近几年来生物酶法越来越受到纺织工业的重视 i - 3 i 。最初为了得到优质 棉花和羊毛而进行的遗传因予重组1 4 】，作为人造纤维原料的浆粕浆化，直至染 整加工的退浆、精炼、整理和净洗等加工f 56 】，以及服装的洗涤和改性都在继 续开发应用和发展之中。 大量的酶首先应用于纤维素纤维，除棉纤维外，还包括苎麻、亚麻、粘胶 和铜铵人造丝，以及近年来出现的t e n c e l 纤维等。这些虽然都属于纤维素纤维， 但这些纤维的超分子结构及形态结构和棉纤维有很大不同，因此它们的酶催化 反应与棉纤维有很大的不同。获得的效果也不同。苎麻和亚麻纤维具有较高的 结晶度和取向度，而且螺旋形结构的螺距小于棉纤维，并且棉纤维中的螺旋成 反向和盘旋状。它们的微孔和微晶尺寸也不同于棉纤维。苎麻属复型细胞状纤 维素纤维，含有较多的果胶等多糖杂质，而棉纤维是单一的细胞，含杂质较少。 再生纤维素纤维的成分较单一，但结晶度、取向度、聚合度有很大的差别，有 的纤维还具有皮层结构特征。所以各类纤维素纤维及其纺织品的酶法处理，无 论是反应特性和效果与棉纤维均会有所不同。 酶用在蛋白质纤维上，以前是用它来破坏羊毛的鲮片结构，从而获得好的 羊毛织物的服用性能。如柔软性等，但现在何中琴等人将它用在羊毛的漂白加 工方面【7 。1 。，主要是基于丝氨酸蛋白酶对过氧化氢稳定，在碱性介质中，其活 力随过氧化氢浓度增加而增加。一种称为b a c t o c o ls i 的酶的存在，会提高过 氧化氢对羊毛的漂白效果，自度有所提高，还可改善羊毛的亲水性和手感。进 一步研究发现，用这种酶提高白度不是通过酶活化过氧化氢的漂白作用，而是 由于酶对羊毛上天然色素有脱色作用而产生的。他们还确定了酶在漂白浴中使 m 酣a s t e 雏r s t 做h e s i 。 用的最适条件，不过目前还未见有应用报道。 在纺织加工中，酶类被应用并获得很大的发展有许多因素p 。2 1 ，其最主要 的几点为： ( 1 ) 化学试剂加工后残留在纤维中的化学试剂可对纤维产生许多不良的 影响，而酶是天然产物，副反应少，有利于环境保护和获得卫生产品： ( 2 ) 酶的生产技术的改进，酶处理效率的提高，应用工艺的不断完善； ( 3 ) 酶加工赋予纤维制品优良的性能和高附加值。 纺织加工中目前应用的酶品种还是很少的，主要包括淀粉酶、纤维素酶、 蛋白酶、脂酶、过氧化氢酶等数种，其原因也许是酶在纺织染整加工中仅限于 “物质分解”之故。而按酶的作用，实际上只应用水解酶类和氧化还原酶【8 j 类。 酶在纺织染整加工中的作用和加工目的可综合列表1 ： 表1 酶在纺织染整加工中的作用和加工目的 1 3 - 2 8 1 酶的作用和作用对象酶的种类加工名称加工目的 作去除果胶果胶酶精炼、脱胶去除麻，棉纤维 用杂质中的果胶等杂 于质 非油脂脂酶精炼去除蚕丝、羊毛 纤 纤维中的油脂 维丝胶蛋白酶精炼去除蚕丝纤维 中的丝胶 去除残淀粉淀粉酶退浆去除经纱上的 留物浆料 过氧化过氧化氢酶去除过氧化去除过氧化氢 氢氢漂白后残留的 过氧化氢 多糖类甘露聚糖酶、印花糊料的去除印花后的 纤维素酶、淀退浆糊料 粉酶 然篙。 作物理和棉、麻纤纤维素酶柔软加工分解纤维、改善 用化学性维 手感和风格 于能变化羊毛角蛋白酶、蛋防毡缩加工分解软化羊毛 纤白酶 上的鳞片 维天然纤蛋白酶、纤维酶改性改善染色性能， 维素酶 去除织物上纤 维毛茸，增加光 泽 表向蚕丝纤维素酶桃皮绒加工分解纤维，产生 变化人造丝细绒毛 天然纤纤维素酶生化洗涤脱色、改善风格 维 人浩幺幺 1 2 苎麻概况 1 2 1 苎麻特点 苎麻纤维【2 93 0 】属于天然纤维的一类。原产于中国，后来传到美国、朝鲜、 日本、菲律宾、巴西以及南美洲一些国家，多分布在热带及亚热带。目前我国 是世界上主要苎麻生产国，其原麻产量约占全球产量的9 5 。由于苎麻织物具 有吸湿散热快，通风透气，易洗快干，穿着凉爽，强力高，能抑菌防腐等特点， 因此苎麻纺织品历来为名贵纺织品之一。其主要化学成分也是纤维素，但在物 理结构和性质上与棉比较有很大的差异，同时两者在含杂方面也有着很大不 同。苎麻除含有纤维素外，还含有些胶杂质，其主要成分为果胶、半纤维素、 木质素等。这些胶杂质大都包围在纤维外表，使纤维之间互相胶结在起而呈 坚固的片条状物质，即原麻。苎麻原麻中一般有2 5 一3 0 的胶质。在纺纱前必 须将胶质去除，释放出纤维并呈单纤维分离状态。苎麻纺纱前的除去胶质的过 程称“脱胶”。经脱胶、纺纱后成为纺织原料。我国主要生产精干麻、麻条、 麻纱及坯布等。并以其出口。为了将苎麻资源优势变为产品优势。以增加出口 创汇，我们必须提高苎麻的加工精度，开创好的脱胶加工工艺。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 2 苎麻纺织工业脱胶方法、 目前苎麻常用的脱胶方法是采用碱液煮炼的化学方法 3 h 。苎麻纤维脱胶 时，先用o 2 h 2 s 0 4 ，5 0 c 浸1 h ，洗净后在煮炼锅内用2 n a o h 溶液于 1 1 0 1 3 0 煮炼2 3 h ，放去碱液，冲洗后用5 n a o h 溶液再煮一次。煮炼时 还可以加入一些助荆，如肥皂、o 3 n a 2 s i 0 3 ，o 5 n a h c 0 3 等，以提高煮炼 的质量。煮毕，放出碱液，出锅杵击( 使胶质易于洗去) ，冲洗。必要时可再 用n a c l o 溶液漂白，随后酸洗，水洗。脱胶后剩余含胶量约为2 左右，麻纤 维的织成率为6 0 左右。 碱液脱胶法会对纤维造成一定程度的损伤，且煮炼废液含碱较多，污水处 理难度大，从环保角度考虑，生物脱胶法被认为是极有前途的脱胶方法。 1 3 苎麻生物脱胶研究进展 为了解决苎麻化学脱胶工艺存在的成本高，污染严重等难题，国内外许多 科技工作者已经在生物脱胶方面迸行了多年的探索。总体来说，这类探索目前 仅局限于实验室中或停留在中间试验阶段，至今还没有在工业生产中大量地推 广应用【3 2 1 。 苎麻生物脱胶包括酶法脱胶和微生物法脱胶。在酶法脱胶方面研究者较 多，如用果胶酶对苎麻纤维或织物进行沤麻( 即脱胶) ，其中湖南益阳苎麻纺 织印染厂就做过试验，但效果不是很理想。酶制剂主要为丹麦n o v o 公司提 供【3 ”。酶法脱胶具有脱胶周期短，设备投资少等特点，但是由于酶的生产成本 高，并且脱胶效率低，因而这种方法应用于生产还有很大距离【3 43 乳。在微生物 脱胶方面，印度学者选用弯孢霉菌和黑曲霉进行脱胶，在实验室中取得了 比较好的效果，不足之处是脱胶周期长达六天，生产效率太慢，企业难以接受。 中国农科院麻类研究所【3 8 】武汉大学生科院，湖南师范大学生物系，益阳 苎麻研究所均选用细菌进行苎麻脱胶，并且作了生产性中间试验，有的研究成 果已经通过鉴定，但至今没有在工业生产中推广应用。据调查，主要存在两个 问题： ( 1 )菌种产酶能力差，不产半纤维素酶，果胶酶活力低，脱胶效率低； ( 2 ) 菌种培养工艺要求高，一般麻纺厂难以接受。 4 硕士学位论文 l 、! 汀e r si h e s i s ! ! ! ! ! ! ! ! ! = ! ! ! ! ! ! ! ! ! = ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 为了在苎麻细菌酶脱胶方面有所突破，我们希望选育优良菌种，优化脱胶 工艺，力求解决生物脱胶技术应用于工业生产中的许多难题，促进苎麻纺织行 业的进步。 1 4 苎麻生物脱胶原理 苎麻纤维的前处理，传统方法是先将纤维发酵，然后用碱精炼来去除其中 的果胶质。果胶是原麻中的一种伴生物，除了果胶质外，还伴有其他些天然 杂质，但一般人认为沤麻( 或称脱胶) 的生物处理最好工艺是利用果胶酶来处 理。果胶质的结构也很复杂，在用酶催化水解时，不同结构的果胶质应由不同 的果胶酶来完成。果胶酶也不是单一的酶，它是一个多组分酶体系的总称，一 般说，果脱酶包括以下几种 3 9 1 ： ( 1 ) 原果胶酶它能将不溶性原果胶水解为水溶性果胶( 多聚半乳糖醛 酸的甲酯) 和切断聚甲氧基半乳糖醛和阿拉伯糖之问的化学键。 ( 2 ) 果胶酯酶它能够分解水溶性果胶分子中的甲氧基与半乳糖之间的 酯键，形成半乳糖醛和甲醇。 ( 3 ) 聚半乳糖醛酸酶它也称果胶半乳糖醛酸酶，俗称果胶酶，能切断 果胶酸的a 1 ，4 糖苷键，形成游离的半乳糖醛酸。这种酶主要来自各种细菌和 霉菌。 将果胶酶于4 0 。c ，p h 值4 5 条件下处理苎麻，不仅可去除果胶，提高毛 细管效应，而且对苎麻潜在损伤少。有人曾对酶精炼和烧碱煮炼对麻纤维进行 比较，经过氧化氢漂白后，烧碱煮炼的麻纤维漂自后失重率远高于酶煮炼的麻 纤维，而且白度也以酶精炼后漂白的高。 a k b i lk u m a r 等人【4 2 】利用多种酶制剂，包括纤维素酶、果胶酶、脂肪酶 和蛋白酶来处理麻，以去除各种杂质，并取得一定的效果。基于杂质主要存在 于初生胞壁里，用烧碱精炼时，虽然可使果胶、蜡状物质和蛋白质等杂质去除， 但初生胞壁也几乎全部去除，纤维有定损伤。 据管映亭等人1 4 3 】报道，如果用原果胶酶作用苎麻纤维表面的不溶性果胶， 不仅可以使果胶呈游离状态，还可以随之使表面其他杂质脱落，达到精炼的目 的，而初生胞壁中的纤维索成份得以保护，织物手感也丰满。这种处理条件是， 硕士学位论文 m a s t e r s1 1 f e s i s 1 2 原果胶酶( 对织物重) ，p h 值为5 ，温度为4 0 c ，处理时间为8h 。 原果胶酶是一种作用于不溶性的原果胶，使它变成可溶性果胶而分离的酶 的总称，可溶性果胶则被称为果胶酶的作用下逐渐分解去除。 原果胶酶按作用机理可分为a 和b 型两种：a 型原果胶酶是切断原果胶 中的聚半乳糖醛酸部分：b 型原果胶酶则是切断其他部分，使水溶性果胶分离 除去。 用作煮炼，脱胶的原果胶酶最适用的是在弱碱性( p h 值8 ) 反应的酶。为 提高酶对纤维的渗透性，加入适当的表面活性剂和进行搅拌是有效的。表面活 性剂的种类、脱胶条件与效果也有影响。果胶去除速度随酶农度增加而加快， 但时间过长，去除速度会变得很慢。处理的p h 值视酶来源而不同，b a c i l l u s s u b t i l i si f o3 1 3 4 酶( 含原果胶酶n 、r 、c ) 处理适合的d h 值为8 0 ，温 度为5 0 。c 。 经酶法脱胶的麻织物的润湿性一般不及传统的碱煮炼织物，但手感柔软厚 实。酶法精炼织物的色泽比化学法精炼的深浓，减量少，强力好。有的织物还 要进行纤维素酶的处理，则织物强度的降低程度以酶精炼的为低。酶精炼的织 物在纤维素酶处理时反应较化学法煮炼的缓和，手感好，强度损伤少。事实上 酶制剂还可以连续使用，成本更低，另外考虑到初生胞壁中的纤维素含量很高， 同时果胶又不是连续分布在整个纤维表面，而是间断地分布在纤维素分子之 间，如果单纯用果胶酶，不但处理时间长，而且去除杂质不够充分。所以主张 用果胶酶和纤维索酶共同作用。这种作用，纤维素酶不会损伤纤维内部( 次生 胞壁) 的纤维素分子，由于纤维素表面存在的不溶性果胶质使纤维素酶在短时 间内难以进入纤维内层( 时间过长，内层纤维素分子也会被水解，应控制处理 时问) 。这样的处理比单纯果胶酶处理的效果好。 1 5 苎麻生物脱胶的设想： 虽然酶法脱胶的研究有很大进步，但主要局限在酶制剂脱胶，酶制剂太贵， 很多厂家无法接受，致使生产中难以应用。微生物脱胶，许多专家考虑的主要 是果胶酶的产生，因而脱胶率很低，一般残余含胶率在1 3 以上。而微生物脱 胶实质上是利用微生物在生长过程中产生和分泌的胞外酶来降解苎麻的含胶 6 硕士学位论文 m a s l e r sf h e s l s 物质。针对实际情况，我们认为要使微生物脱胶技术有实用价值，在选育脱胶 菌株时，菌株产生的酶要有效地降解胶质，一是要求酶的种类齐全，二是要求 酶的活力高。在自然界，满足该条件的菌株并不多见1 4 4 - 5 7 】。从酶的种类上看， 由于苎麻胶质含有半纤维素，果胶和木质素，因此，所需脱胶菌株要有产生半 纤维素酶，果胶酶和木质酶的潜能。并且这三种物质均为高分子多聚物，而每 种聚合物的降解又要求多种酶的联合催化作用。所以，苎麻脱胶酶的组份是十 分复杂的。另外又要保证苎麻纤维不被脱胶菌株所破坏，因此不需要产生纤维 素酶。在酶的活力方面，第一、要求脱胶菌株产生的脱胶酶能分泌到胞外；第 二、要求酶对以胶质状态存在的底物有较高的降解活力。部分嗜碱细菌能满足 该条件，并要求它分泌的脱胶酶在碱性条件下要稳定，酶作用最适p h 值最好 与嗜碱细菌生长的最适p h 值一致。 由于以上考虑，我们首先要选育优良菌种，然后在充分利用现有脱胶设备 的基础上，优化脱胶工艺，使产品的各项指标达到化学脱胶水平，促进成果推 广运用。 本项目的研究力求达到以下目标： ( 1 ) 选育出具有优良脱胶性能的菌种； ( 2 ) 优化脱胶工艺，使研究成果能用于现有麻纺企业所期待的技术改造： ( 3 ) 减轻煮炼废滚中氢氧化钠浓度，保护环境。 。一l a s t e r s t e s i 。 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1苎麻原料采用湖北省成宁头等麻经晒干后所得。 2 1 - 2嗜碱细菌脱胶酶：从不同土壤中筛选出一些碱性细菌作为出发菌 株，分别利用果胶培养基和半纤维培养基培养出酶活力较高的菌株，接种到苎 麻培养基中，观察脱胶能力。 2 1 3 果胶培养基1 5 8 1 ：柑橘果胶粉，1 m n a o h 调整p h 至8 1 l ，h a c - n a a c 缓冲液，乙醇。 2 1 4 半纤维素培养基：蛋白胨或甘油，1 mn a o h 调整p h 至8 - 1 1 ， h a c n a a c 缓冲液，乙醇。 2 1 5 苎麻培养基：苎麻粉，1 mn a o h 调整p h 至8 1 1 ，h a c - n a a c 缓冲液，乙醇，琼脂。 2 1 6 苎麻培养基二：需脱胶原麻，一定量的苎麻脱胶残液，e d t a ，l m n a o h 调整p h 至8 1 1 ，h a c - n a a c 缓冲液，乙醇。 2 1 7 试剂：果胶粉果胶酶纤维素酶氢氧化钠硫酸草酸钠碳 酸钠草酸铵苯无水乙醇氯化钠氯化铁盐酸 2 1 8 仪器 u v 吸收光谱仪n i c o l e t 仪器公司产品 x 射线结晶度测试仪v a r i a n 仪器公司产品 紫外分光光度计 y g 0 0 1 a 型单纤维电子强力仪上海纺织仪器厂产品 t g 3 2 8 a 型电光分析天平上海天平仪器厂产品 h h 4 型恒温水浴锅北京长安科学仪器厂产品 电动鼓气机武汉电机厂产品 p h 2 5 型p h 计上海雷磁仪器厂产品 家用电冰箱广东科龙电器厂 a 硕士学位论文 u s t e r si jh e s i s 电热烘温干燥箱 煮布锅 常州纺织仪器厂产品 常州纺织仪器厂产品 2 2 测试方法 2 2 1 酶活力测定： 按照1 9 7 8 年人民教育出版社出版的生化技术导论中的测定方法【5 9 6 0 o 2 2 1 i 纤维素酶活力测定：分g ，酶、g ，酶测定方法。 g ，酶活力测定： 取o 5 羧甲基纤维素钠溶液l m l ，加入0 1 m 醋酸- 醋酸钠缓冲液4 m l ， 蒸馏水l m l ，酶液l m l ，于4 0 0 水浴中糖化3 0 m i n ，取出，立即于沸水中煮沸 1 5 m i n 使酶失活，得糖化液。取糖化液l m l ，按制标准曲线时一样加显色剂比 色。同时以i m l 煮沸的酶液代替酶做一空白对照。 每分钟催化纤维素水解生成l 微克葡萄糖的酶量定为一个活力单位。 纤维素酶活力单位：生坚l 兰窖罄 3 0 l 二 1 0 式中： h 为按标准曲线的固体原料重量加水浸泡所得酶液的稀释倍数； 3 0 为酶解( 糖化) 所用的时间； l 为反应中酶液毫升数： 1 0 一为反应总体积。 g ，酶活力测定： 取酶液6 m 1 于2 0 0 m l 锥形瓶中，加入p h 4 5 的0 2 m 醋酸缓冲液2 m l ， 放入1 c m 2 的新华滤纸二张，然后将瓶置于4 0 c 磷i ，在往复式摇床( 振幅8 c m ， 频率1 0 0 次m i n ) 上分别在不同时间( 如3 0 、6 0 、9 0 m i n ) 观察崩坏情况，以 9 硕士学位论文 m a s 】e r si i e s i s 此表示酶的相对活性。 2 2 1 2 半纤维素酶活力测定： 取0 5 半纤维醋酸缓冲液l m l ，酶液0 5 m l ，混匀，于4 0 水浴保温1 5 m i n ， 加5 m l 乙醇终止反应，并使过剩的半纤维素沉淀( 沉淀要完全，否则干扰比色) 。 放置6 0 m i n 后，以3 0 0 0 转m i n 离心1 0 m i n ，取上清液o 5 m l ，加水2 5 m l ，氯 化铁一盐酸溶液3 m l ，地方酚试剂0 3 m l ，摇匀，在沸水浴中煮2 0 m i n ，冷却至 室温后，于6 7 0 m u 处比色。查标准曲线得木糖微克数( a ) 。比色对照用煮沸 1 5 m i n 之酶液，其余操作同前。 每分钟催化半纤维素水解生成1 微克木糖的酶量定为一个酶活力单位。 半纤维素酶活力单位2 五：趣 6 5 式中： h 为酶液浓度； 1 5 为处理时间o o 5 为反应系统中酶液毫升数； 6 5 为反应总体积； o 5 为取反应液进行比色的毫升数。 2 2 1 3 果胶酶活力测定： 取】果胶溶液1 0 m l ，加入5 m l 酶液和5