（应用化学专业论文）LBL自组装法制备酶传感器.pdf

浙江大学硕士毕业论文 摘要 l b l ( l a y e r b y l a y e r ) 分子沉积法( m d ) 是一种以带电聚合物之间的静电 作用力为驱动力的逐层交替沉积制备有序分子膜的一种方法，它具有操作方便， 条件温和，并能从纳米水平设计和控制膜的排列和厚度，被广泛的应用于生物化 学领域。由生物技术与电子学相结合发展而成的生物传感器，使人们找到了- - g e e 探测化学等变化的新型高效探测元器件，它是一种用于物质微量分析以及分子水 平快速检测的方法，在生物医学、生命科学和生物技术等领域必不可少的一种先 进的检测方法与监控方法。 本文采用l b l 分子沉积法分别制备葡萄糖氧化酶( g o d ) 和辣根过氧化物 酶( h r p ) 生物活性膜。实验通过原子力显微镜( a f m ) 表征手段从微观角度 研究了通过l b l 分子沉积法组装的酶膜的表面形貌，观察了分子沉积的形态以 及变化和规律性；同时还通过紫外一可见光吸收光谱法( u v - v i s ) 跟踪分子沉积 的过程，并研究了组装溶液的浓度和组装时间对沉积量的影响。实验的结果表明 l b l 分子沉积法是一种均匀的分子沉积的技术，同时是动态平衡过程，到一定 的时间，组装的量达到平衡。 实验通过酶分子和带相反电荷的聚合物的交替沉积来制备葡萄糖氧化酶 ( g o d ) 电极，以甲酸二茂铁为电子媒介，能在o 3 3 v 的电位下，通过二茂铁的 氧化峰电流的变化检测葡萄糖的浓度。随着组装的g o d 层数的增加，电极的催 化性能提高；当层数增加到4 层以后，催化活性趋于稳定。g o d 修饰电极的检 测灵敏度和p h 有关，在p h 大于7 0 时，g o d 酶电极对葡萄糖的灵敏度最好且 变化不大。电极的重现性能良好。 采用分子沉积法制备的辣根过氧化物酶( h r p ) 电极，在以亚甲基蓝为电子 媒介的条件下，可以检测h 2 0 2 的浓度。改变检测溶液的p h 值，则检测的电位 和电流灵敏度都发生变化；在p h 为5 8 7 0 的范围内，h r p 酶修饰电极的催化 活性基本不变。实验制得a u m p s ( h r e p s s ) 2 电极的重现性能良好。在以亚甲基 蓝( m b ) 为电子媒介检测电极催化反应时，能防止抗坏血酸的电活性物质的干 扰，稳定性好。并且研究和评价了两类酶电极的其他性能。 浙江大学硕士毕业论文 a b s t r a c t an o v e lt e c h n i q u eo fl a y e r - b y - l a y e rm o l e c u l a rd e p o s i t i n gm e t h o dh a sb e e n d e v e l o p e db yd c e h e r v i at h ea l t e m a t ea d s o r p t i o no fo p p o s i t e l yc h a r g e dp o l y i o n s i t w a sp r o v e dt h a tt h i s t e c h n i q u ew a sa ne f f i c i e n tm e t h o dt oi m m o b i l i z e db i o r e l a t e d m o l e c u l ew h i c hw a sc r u c i a li nc o n s t r u c t i o no fb i o r e a c t o r sa n db i o s e n s o rc o n t a i n i n g e n z y m e s a n do t h e r b i o l o g i c a lc a t a l y s t s ，t h r o u g h t h e m e t h o d ，r e m a r k a b l e n a n o m e t e r - l e v e lc o n t r o lo v e rt h et h i c k n e s so ft h er e s u l t i n gl a y e ra n dr e g u l a ru l t r a t h i n f i l m sw e r eo b t a i n e d b i o s e n s o r sh a v eb e e nw i d e l ys t u d i e da n dd e v e l o p e do v e rt h e p a s t 3 0y e a r s ab i o s e n s o ri sa na n a l y t i c a ld e v i c ew h i c hc o n t a i n sab i o l o g i c a l c o m p o n e n tg i v i n g t h ed e v i c e s p e c i f i c i t ya n dp r o d u c e s ar e s p o n s es w i t c h e df r o m p h y s i c a lc o m p o n e n t t oa ne l e c t r i c a lo ro p t i c a ls i g n a l i nt h e p r e s e n tp a p e r , t h eu l t r a t h i n f i l m s c o n s i s t i n g o fg l u c o s eo x i d a s ea n d h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ew e r ef a b r i c a t e d b yl a y e r - b y l a y e r m o l e c u l a rd e p o s i t i n g m e t h o d t h ec o n f i g u r a t i o n so ft h eu l t r a t h i nf i l m sw e r ei n v e s t i g a t e db ya t o m i cf o r c e m i c r o s c o p e ( a f m ) u l t r a v i o l e t v i s l el i g h ta b s o r p t i o ns p e c t r u m ( u v - v i s ) w e r e p e r f o r m e dt os t u d yt h eb e h a v i o ro fm o l e c u l a rd e p o s i t i n ga n dt h ei n f l u e n c eo fs o m e c o n d i t i o n ss u c ha st i m ea n dc o n c e n t r a t i o ne t c i naw o r d ，t h el b l s e l f - a s s e m b l i n gi sa u n i f o r m l ya n db a l a n c e d l yd e p o s i t i n gp r o c e s s g l u c o s eo x i d a s ee l e c t r o d e sw e r e p r e p a r e db ya l t e m a t e l yd e p o s i t i n go f p o s i t i v e l y c h a r g e dp o l y m e r sa n dn e g a t i v e l yc h a r g e dg l u c o s eo x i d a s e s t h ec o n c e n t r a t i o n s o f g l u c o s e s w e r ed e t e c t e d b y e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s a tt h ee x i s t e n c eo f f e r r o c e n e c a r b o x y l i ca c i d s t h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo f t h ee l e c t r o d ew a se n h a n c e dw i t h t h ei n c r e a s eo f t h en u m b e r o f l a y e r sb e l o w f o u ra n dv a r i e di nd i f f e r e n tp hv a l u e s t h ec o n c e n t r a t i o no fh 2 0 2w a sd e t e c t e db yh o r s e - r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) e l e c t r o d e sf a b r i c a t e dv i al b l s e l f - a s s e m b l y m e t h o da tt h ee x i s t e n c eo f m e t h y l t h i o n i n ec h o r i d e w h e np h v a l u e sv a r i e dw i t h i nt h el i m i t sp r o m5 8t o7 0 ，t h e h r pe l e c t r o d e sm a i n t a i n e ds t a b l ec a t a l y t i ca c t i v i t y t h ee l e c t r o d e sh a v eah i g h s t a b i l i t ya n d t h ei n t e r f e r eo fa s c o r b i ca c i dc o u l db e e n n e g l e c t e d 1 i 浙江大学硕士毕业论文 第一章文献综述 绪论 有序分子膜( o r g a n i z e dm o l e c u l a rf i l m s ) 研究不仅有助于人们认识生物体系中 有机分子的组装与自组装行为，而且可以按照人为设计去组装特定功能的有机薄 膜与超薄膜体系，进而构造分子器件或超分子器件，因此有序分子膜的组装与功 能研究是一个十分活跃的多学科交叉领域。基于分子间静电作用力的分子沉积 法所制各的分子沉积膜是一种有序分子膜，它被广泛应用于相反电荷的聚合电介 质、生物大分子( 包括酶、d n a 、抗体、蛋白质等) 、纳米颗粒等的组装。酶、 蛋白质、d n a 等生物分子自组装体系，不仅保持了生物分子独特的生物功能， 同时生物分子自组装膜由于具有模拟生物膜的选择性分子识别功能，被广泛的用 于生物传感器、生物芯片、功能材料的研究和开发上，研究生物大分子的自组装、 自组装膜结构及自组装膜的应用因而具有重要的意义。 二十世纪中后期发展起来的生物传感器是一门由生物学、分析化学、物理学、 医学等多学科互相渗透而成的新技术，它具有快速、灵敏、专一、准确等特点， 在医药、化工、环境检测、食品分析等方面具有广泛的应用价值。葡萄糖是许多 催化反应的中间或最终产物，因而葡萄糖浓度的在线检测对于控制反应进度非常 重要，这在食品化学、生物化学、临床化学和环境化学等领域具有重要意义。葡 萄糖传感器是研究最早也是最多的传感器。辣根过氧化物酶是一种供体过氧化 氢氧化还原酶，其修饰电极可以检测过氧化氢、酚类化合物、胺类化合物以及各 种酶抑制剂等，还可以用于制备双酶电极，间接用于氧化还原酶的检测。随着酶 固定化技术的发展和新的检测方法的应用，酶修饰电极的应用领域在不断扩大。 生物传感器的灵敏度和稳定性是其是否能进入实际应用的关键，生物物质的固定 化技术是提高传感器这两项指标的关键技术 2 】。由于多数酶的外部包有重重的蛋 白质外壳，使得酶活性反应中心和电极之间的电子转移受到了限制，因此实现高 效的电子转移是酶传感器的一个关键问题。其中采用电子媒介体是常用而有效的 浙江大学硕士毕业论文 方法之一。 本文研究l b l 分子沉积法通过酶分子和带相反电荷的聚合物的交替沉积来 制备葡萄糖氧化酶( g o d ) 电极和辣根过氧化物酶( h r p ) 电极，分别用甲酸二 茂铁和亚甲基蓝为电子媒介体，通过电化学的方法检测溶液中的葡萄糖和过氧化 氢的含量，并研究了酶电极的性能。 1 1 生物大分子逐层自组装l b l 技术 1 1 1 化学反应法自组装 1 1 1 1 酰胺反应自组装 利用分子中羧基( 一c o o h ) 和氨基( n h 2 ) 直接的化学反应生成酰胺键 ( c o n h 一) ，从而形成生物大分子多层自组装膜的方法，将含有氨基或者羧基的 生物大分子通过酰胺键连接到含有羧基或者氨基反应基的基材表面，以形成单分 子层薄膜。若生物大分子上还含有氨基或羧基，则可以与含有羧基或氨基的另一 分子发生酰胺反应，如此的重复循环下去，可以制得生物大分子的l b l 的多层 膜。 d u s a n 等【3 1 利用这种方法构造了酶的单分子层膜，他们将硫醇修饰的金表面 的自组装单分子层( s a m ) 的末端羧基化，将其转化成活性的中间体，该活性 中间体的c o o h 受到葡萄糖氧化酶( g o d ) 上赖氨酸的氨基的亲核进攻，通过 酰胺化反应在g o d 与s a m 之间形成了共价键，从而得到酶的单分子层膜。y o o n 等【4 】利用这种手段在金表面构造酶的l b l 交替沉积多层膜。他们通过酰胺化反 应将聚氨基酰胺树状高分子核葡萄糖氧化酶( g o d ) 交替沉积到金表面，这样 构造出来的电极可用于生物传感器。y o o n 等【5 】还在实验中组装成另一种可应用 于生物传感器的g o d 多层酶修饰的金电极，他们将高碘酸氧化的g o d 和链接 有荧光素的呈树状的高分子f c d ( f e r r o c e n y l - t e t h e r e dd e n d r i m e r s ) 通过酰胺化反应 交替沉积到金表面，这种电极具有电化学性质和酶的活性。 由于蛋白质具有羧基和氨基，这种方法被广泛应用于蛋白质的自组装，因此 可以通过这种方法将其固定到氨基或者羧基的表面。 浙江大学硕士毕业论文 1 3 。1 2 其他化学反应自组装 此外，还可以通过氢键、光反应、席夫碱反应等化学反应得到l b l 自组装 膜。比如2 , 5 二烷基胺基一l ，4 一苯醌分子含有氢键的受体和给体，因此可以形成 分子内和分子间的氢键，形成一种聚合物带状的结构。沈家骢等【6 1 人利用它的这 个特征，研究了氢键在形成逐层组装的超分子膜的作用。 x i z h a n g 等【在实验室，将光反应活性的重氮树脂为聚阳离子，和骨架带有 磺酸根或者羧酸根的基团聚阴离子静电交替沉积，然后通过光反应，将离子键转 换成化学键，使得逐层之间的稳定性大大增加。 h y u n c y o o n 等人【8 】利用席夫碱反应构筑逐层组装的葡萄糖氧化酶电极。首 先，他通过席夫碱反应将醛基二茂铁衍生物结合到树状的含有多个氨基端基的聚 合物上，形成了电子媒介高分子聚合物，用于酶和电极之间的电子传递和构筑酶 电极的桥梁。将这个聚合物共价结合到带有单层半胱胺酸的金电极表面，然后再 次通过席夫碱反应，将聚合物上没有反应的氨基端基和事先用高氯酸氧化的葡萄 糖氧化酶( g o d ) 在n a b h 3 c n 的催化下共价结合。反复交替在电子媒介聚合物 和g o d 溶液中沉浸反应，可以得到多层交替酶膜。 1 1 2 生物大分子的特异识别自组装 利用某些生物大分子和特定的生物分子之间的特异识别进行生物大分子的 l b l 自组装，是一种简易的自组装方法。例如抗生素蛋白对生物素，伴刀豆凝 集素( c o n a ) 对甘露糖等。 通过这种方法，r a o 等 9 1 获得了蛋白质的l b l 多层自组装薄膜。他们先将辣 根过氧化物酶( h r p ) 用b c a p n h s ( b i o t i n a n i d o c a p r o a t en h y d r o x y s u c c i n i m i d e e s t e r ) 进行生物素化得到b c a p - h r p ( b i o t i n y l a t e dh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ) ，其中 每个h r p 分子含有两个生物素分子，然后利用抗生物素蛋白和生物素的相互作 用进行交替沉积得到聚苯乙烯( p s ) 胶体颗粒上，实验发现这种方法组装的h r p 比酰胺反应组装的活性高，也比游离的b c a p h r p 溶液的活性高，因为它能容纳 更高浓度的h 2 0 2 ，而且减少对底物的抑制作用。a n z a i 等【加】在石英晶体表面进行 抗生物素蛋白和连接有生物素分子的抗体的交替沉积，并研究了它的活性。另外 还通过c o n a 与糖酶的糖链的生物特定的络合作用进行糖蛋自的l b l 交替沉积 浙江大学硕士毕业论文 组装。a n z a i 等【1 1 1 通过c o n a 和天然葡萄糖氧化酶( g o d ) 的相互作用，在铂电 极表面进行交替沉积以形成g o d 的多层薄膜，并将其应用为葡萄糖传感器。对 于一些本身无糖链的生物大分子，如乳酸氧化酶( l o x ) u 2 先用甘露糖等进行修 饰后，再与c o n a 进行络合反应，这样就可以得到l b l 交替沉积的多层薄膜。 1 1 3 分子沉积法( m d ) 自组装 分子沉积法是对带有电荷的生物大分子，以静电的相互作用为推动力进行的 交替沉积。1 9 9 1 年，d e c h e r 基于阴、阳离子静电吸引而组装有序薄膜【l ”。这种 技术十分简单，只需将离子化基片交替浸入带有相反电荷的聚电解质溶液中，静 置一段时间，取出冲洗干净，循环以上过程，则得到多层膜体系。改变聚合物的 浓度、离子强度，膜厚可以在纳米尺度微调分子沉积法被广泛应用于大多数水 溶性的蛋白质与带有相反电荷聚电解质的交替沉积。m d 膜具有制备简单、热稳 定性和长期稳定性好，不受衬底形状与面积的限制等优点。m d 膜及其技术已引 起国际学术界的注意，m d 膜在应用方面已有不少报道，美国麻省理工学院 r u b n e r 教授【1 4 】利用这种技术成功地将导电高分子组装入膜体系，并实现了寿命 达2 5 0 h 的聚合物发光器件。日本九州大学k u n i t a k e 教授近期尝试了近1 0 种酶 的静电组装 1 5 1 。美国s y r a c u s e 大学的f e n d l e r 教授将表面修饰负电荷的多种纳米 微粒组装入聚合物膜体系【1 6 1 。 a n z a i 等 1 2 , 1 7 1 通过l b l 沉积法将抗生蛋白质和聚阴离子聚苯乙烯磺酸钠 ( p s s ) 、聚乙烯硫酸盐( p v s ) 和葡聚糖硫酸酯( d s ) 交替沉积到石英晶片表 面。实验结果发现沉积的聚电解质不同，则沉积的状态也不同。如在p s s 和p v s 交替沉积的多层膜中，每一层沉积着大量的抗生物素蛋白，且与抗生物素蛋白和 聚电解质的浓度有关。但在d s 的l b l 组装膜中，每一层只沉积着单层或少于 单层的蛋白质，并且和浓度无关。实验证明组装后的抗生物素蛋白分子依旧保留 着对生物素的键合作用。 c a r u s o 等 1 8 1 研究了在p s 胶体颗粒上的f i t c b s a ( f l u r e o s c e i n i s o t h i o c y a n a t e l a b e l e d ) 牛血清蛋白和免疫球蛋白( i g g ) 与聚电解质的交替沉积， 葡萄糖氧化还原酶，过氧化物酶( p o d ) 和酶一聚电解质络合物与带相反电荷的 聚电解质的交替沉积，b 糖苷酶( 3 - g l s ) 和带相反电荷的聚电解质p s s 的交替 4 浙江大学硕士毕业论文 沉积19 1 。由于颗粒具有表面积大，组装密度高等优点，与平面组装相比较具有一 定的优势。当然也可以用其他的物质如纳米颗粒等代替聚电解质进行交替沉 积。 1 2 表面表征技术 1 2 1 表面形貌结构的表征技术 1 2 1 1 原子力显微镜( a f m ) a f m 是在扫描隧道显微镜( s t m ) 基础上发展起来的一种具有原子级分辨 率的新型表面分析仪器，它是通过盟测探针尖端原子与样品表面原子之问的极弱 相互作用力来获取样品的表面信息，克服了s t m 在测量中需用导电衬底的缺陷。 a f m 能提供可视性的成像图，用于对自组装膜表面的形貌、取向分布和表面规 整性进行分析。 p e t e r k h h o 和r i c h a r d h f r i e n d 2 1 应用a f m 研究了聚( 对苯二甲基一四 巯基苯) 和聚苯磺酸在功能化石英片上的组装结构。这两种聚合物是在溶液中通 过静电作用力交替沉积的。结果表明其表面的结构和离子环境有着密切的联系。 如d n a 分子在云母表面的沉积，当线性聚( 腺嘌呤和胸腺嘧啶) p o l y ( d a d t ) 的浓度低时( 2 5 t g m l ) ，用a f m 可观察到合成的d n a 分子相互连接形成网状 1 2 2 1 。又如牛血清蛋白( b s a ) 和透明质酸钠( n a h a ) 在 p m l g p o l y ( t m e t h y l l g l u t a m a t e ) 表面上的吸附现象，用a f m 显像可观察到b s a 在p m l g 表面的沉积是单分子层，而吸附在b s a 表层的n a i - i a 形成了六边形的 网状结构。可从a f m 的探针与b s a 或n a h a 表面的粘附力的大小估计它们的 表面张力r s 2 3 1 。d u s a n 等 3 】用a f m 观察g o d 在金表面的结构，发现g o d 分子 形成无规则的五边形或者六边形的簇团。 1 2 1 2 透射电镜( t e m ) t e m 可以得到可视性的成像图。c a m s o 等 1 8 , 1 9 1 在观察g o d ( 葡萄糖氧化酶) ， p o d ( 过氧化物酶) ，酶- 电解质络合物包裹的p s 表面的t e m 显像图，与未有任 何修饰的p s 颗粒相比较，发现表面的粗糙度显然增加，还用t e m 表征技术观 浙江大学硕士毕业论文 察到f i t c b s a 和i g g 在p s 表面的均匀覆盖。s e k i 等使用a f m 和t e m 两种 表征手段对合成肽进行结构形态的研究，发现t e m 所得组装肽的一般形态外形 和尺寸与a f m 结果相似。 1 2 2 循环伏安法( c v ) 电化学方法表征化学修饰电极是通过研究电极表面修饰剂发生相关的电化 学反应的电流、电量、电位和电解时间等参数间的关系来定性、定量地表征修饰 剂的电极过程和性能。电化学方法更侧重研究膜内电荷的传输过程。循环伏安法 是其中的一种电化学表征方法。被广泛的应用于研究聚合物薄膜修饰电极的电荷 传输过程t 2 引。c v 通过屏蔽效应研究组装膜的结构，影响因素及最佳成膜条件， 可用于估计表面吸附剂的覆盖率。 y o o n 等【5 】从g o d d e n d r i m e r 多层膜修饰的金电极的c v 测定中揭示了电极的 生物电催化活性与金表面沉积的生物层数有着直接的关系：从电位信号分析估计 多层膜的形成过程中每层g o d d e n d r i m e r 多层膜中酶覆盖率，从而知道多层膜的 构造是空间有序的。c a r u s o 等用c v 表征手段研究了乳蛋白在铂电极表面，在 不同的p h 值( 酸、碱、中性) 不同温度( 2 7 3 3 5 3 k ) 条件下的吸附行为，结 果表明吸附蛋白质的量与表面的电荷密度成比例，且伴随着电荷的转换。q i 等【2 6 j 通过c v 等方法研究，表明在金表面通过共价键合吸附法来固定d n a 是可行的。 n a i f e ih u 等【2 7 1 通过l b l 分子沉积法交替沉积带负电荷的二( 十六烷基) 磷 酸酯( d i h e x a d e c y l p h o s p h a t e ，d h p ) 和带有正电的聚二甲基烯丙基铵 ( p o l y ( d i a l l y d i m e t h l a m m o n i u m ，p d d a ) ，然后包埋血红蛋白( h b ) 于其中。采用 了c v 扫描，得到了h b 中f e ( ) f e ( i i ) 一对可逆的氧化还原峰，电位为一0 3 4 v ( 相对饱和甘汞电极) 。通过c v 研究了p h 对l i b 电化学反应的影响，实验结果 发现p h 的改变使得电位发生了位移，结合紫外可见光( u v - v i s ) 技术，推测p h 对h b 结构的影响。并用c v 法检测了h b 对0 2 、t c a 和n 0 2 等响应电流的变 化。 c h a n g q i n gs u n 等【2 8 j 采用静电交替沉积带有负电荷的硅酸钼( s i m o l 2 ) 和带有 正电荷的聚烯丙基二甲基铵( p d d a ) ，并用循环伏安法测定了它的催化亚硝酸 的能力，并测定p h 的影响，试验结果是在p h 为l 3 范围内，电位随着p h 值 6 浙江大学硕士毕a c e 文 的增大而负移。 1 2 3 紫外见光光谱( u v ) 紫外可见吸收光谱是一种常用的分析方法，可用于分子水平研究和原位跟 踪分子沉积膜成长过程。对于蛋白质多层分子沉积膜，可通过蛋白质的特征吸收 波段，对蛋白质的组装量进行定性研究， n a i f e i h u 和l i w e n w a n g l 2 9 】使用u v 的方法研究了负电荷的聚乙烯基磺酸盐 和带有正电荷的血红素蛋白( h b ) 的线性沉积过程，从而得出了均匀沉积的结 论。同时还在不同的p h 条件下研究h b 的索雷氏谱带，发现和自由态的h b 一 致，因此静电交替沉积的h b 的立体结构没有发生什么严重的变化。f r a n k c a r u s o 3 0 】研究了一种混合聚电介质的纳米颗粒。他是采用非计量混合两种不同电 荷的聚电介质，然后交替沉积制备。通过u v 和q c m 两种表征方法对这种组装 的纳米颗粒进行观测，其膜的厚度比不混合的大4 5 ，平均每十层的厚度为 4 0 n m ，有着良好的通透性和机械性能。h i r o s h if u k u m o t o 等【3 l 】采用静电交替沉积 多层的菁蓝染料和p d d a ，用紫外一可见光谱检测j 一带吸收( 4 6 5 n m ) 处，其 吸收峰的大小和层数呈线性关系。 也可以用紫c b - 可见吸收光谱法检测酶的活性。比如y u r im l v o v 等人 3 2 j 采用了一种对p h 值敏感的染料溴甲酚红紫来检测多酶电极对l 精氨酸的反 应。多酶电极是采用静电交替沉积的方法逐层沉积p d d a 和脲酶( u r ) 和精氨 酸酶( a r ) 。a r 先催化l 一精氨酸分解为脲，然后脲进一步在u r 的催化下分解为 氨，同时伴随着溶液的p h 的变化，于是引起u v 吸收峰的变化。 1 2 4 石英晶体微天平( q c m ) q c m 是6 0 年代发展起来的一种非常灵敏的质量检测器，可以进行纳克级的 质量测定。q c m 的基本原理是利用石英共振腔的频率变化值与质量变化值之间 的简单的线性关系，将频率的改变转换成质量的改变。 y u r il v o v 等人田j 采用q c m 的跟踪检测的方法具体的研究了逐层静电交替 沉积的过程。静电交替分子沉积法一般包括浸泡、冲洗、n ：吹于。在带有相反 电荷的溶液中浸泡时，带电聚合物在静电的作用力沉积在表面，随着时问的延长， 浙江大学硕士毕业论文 很快就达到了平衡，不同的物质所需要的时间不同。水的冲洗，沈下了那些弱吸 附的分子，n 2 的吹干，结合a f m 的图像中发现分子沿着气流方向排列，表面粗 糙度增加，有利于沉积量增多。同时通过q c m 研究发现增加组装溶液的离子强 度，有利于增加组装的量。 f r a n kc a r u s o 3 0 】研究了一种混合聚电介质的纳米颗粒。他是采用非计量混合 两种不同电荷的聚电介质，然后交替沉积制备。通过u v 和q c m 两种表征方法 对这种组装的纳米颗粒进行观测，其膜的厚度比不混合的大4 5 ，平均每十层 的厚度为4 0 n m ，有着良好的通透性和机械性能。 1 2 5x ，射线光电子能谱( x p s ) x p s 是利用单色光照射样品，x 光子与样品表面原子内层的电子相互作用， 并传递能量给电子，当电子有了足够的能量便从表面逸出，这种电子即为光电子。 光电子带有聚合物表面的信息，所得的x p s 谱图便可对聚合物表面进行表征。 c a r u s o 等【3 4 1 在铁蛋白的表征中，利用x p s 测定束计算金表面吸附的铁蛋白 的厚度和表面覆盖率。g u i o m a r 等【3 5 】利用x p s 表征手段证实了葡萄糖氧化酶 ( g o d ) 在单层膜表面的出现。w e ic h e n l 3 6 】及其合作者对在p e t 薄膜以及表面 带电荷的p e t 膜上的聚丙烯胺的盐酸盐( p a h ) 和聚苯乙烯磺酸钠( p s s ) 的多层膜 进行了x p s 测试并得出如下结论：多层膜中各层间分层清晰；膜厚受基片表面 性质影响，带电荷基片上的膜比中性p e t 表面的膜厚。 1 2 6 红外光谱法( m ) 红外光谱是研究自组装膜的稳定性和膜中分子堆积、取向的常用手段，为研 究膜的结构和功能间的关系提供了分子水平上的信息。其中衰减全反射红外光谱 ( a t r ) 和掠角反射红外光谱( g a ) 是较常用的方法。 j er a b o l t 等【3 ”应用g a 法对聚二甲基硅氧烷( p d m s ) 在金表面形成的自 组装膜中的分子取向进行了研究，根据s i o 键伸缩振动峰的峰强变化证明了在 硫醇含量降低时( 如1 3 s h ) ，p d m s 的分子链与金表面平行。沈家骢等人口龇 应用a t r 法研究了两亲聚合物的自组装膜的结构，根据亚甲基( c h 2 ) 的对称和 反对称伸缩振动出现的位置来判断，最终表明在自组装膜中烷基链是高度有序 浙江大学硕士毕业论文 的。w b s t o c k t o n 等0 9 1 利用f t i r 检测了聚苯胺( p a n ) 与非离子高分子( 如p v p , p e o ) 的多层沉积膜，根据聚苯胺中的n h 的伸缩振动峰位置的变化，汪明了 p a n 与p v p 或p e o 之间的多层膜是靠氢键键合的；根据其峰强的变化可推算出 多层膜中p a n 的比例。 1 , 2 。7 x 射线衍射 x 射线衍射可以研究表面的形状厚度等。沈家骢等t 4 0 1 用x 射线衍射研究了 沉积在薄膜上的两极吡啶盐和葡萄糖异构酶的厚度，由于两极吡啶盐的长度为 3 n m ，因此得出葡萄糖异构酶层的厚度为1 0 n m ，这个和葡萄糖异构酶本身的分 子直径大小相当，所以葡萄糖异构酶在沉积时形状没有明显的改变。 1 。3 生物大分子自组装的应用 生物分子具有复杂的分子结构和特殊的生物功能，生物活性分子膜的构筑， 在分子水平上实现了具有识别信息、储存信息、转移信息和催化功能的新型功能 材料，在生物传感器、分子器件、医用生物材料、高效多功能催化材料、微反应 器等方面具有诱人的应用前景。 1 3 1 生物传感器与酶电极 生物传感器是一类以酶、抗体、d n a 等生物活性物质做敏感元件，配上适 当的换能器，通过生物分子与被测物特异生物反应而发挥检测和定量测定功能的 工具。生物分子自组装体系的研究和发展，为生物传感器向着微型化、智能化方 向发展，及生物传感器在特殊环境如人体内的使用，创造了条件。利用烷基硫醇 在金表面的自组装分子膜( s a m ) ，通过表面生物活性材料密度和距离的均匀排 布可控制金表面的氧化还原隧道性质：界面结合受体蛋白的功能化生物分子可作 为化学和生物传感器材料及界面性质可控材料的基础。酶电极通过在电极上固定 酶，利用底物与酶的作用发挥电极高效、灵敏的检测功能。m k r a m 等【4 1 1 研究 了g o d 在导电聚合物聚砒咯( p p y ) 原位自组装膜上的组装，利用带正电的p p y 浙江大学硕士毕业论文 以静电力组装g o d ，原子力显微镜( a f m ) 研究显示g o d 组装量与酶浓度有 关。p p y 能将还原态g o d 酶重新变成氧化态，并在酶与电极间起着电予转移作 用。g o d 在p p y 上自组装的研究，为构筑葡萄糖生物传感器开创了一条重要途 径。 1 3 2 分子器件 微电子学和信息技术的发展，要求大规模集成电路的尺寸微型化。以硅材料 为基础的集成电路的加工已达到物理极限( o 2 um ) ，要想进一步提高集成度必 须另辟蹊径4 2 1 。生物大分子自组装体系实现了在分子尺寸范围对电子的控制，从 而为将分子聚集体构筑成有特殊功能的器件分子器件创造了条件。 d n a 分子以核苷酸碱基编码方式存储遗传信息，是种存储器的分子模型 4 2 1 。d n a 分子组装膜的研究，为分子存储器的研制提供了合理的方向。 细胞色素c ( c y tc ) 是一种阳离子型电子转移蛋白，具有氧化和还原两种状态， 其导电率相差1 0 0 0 倍，可做记忆元件。n k i m i z u k a 等1 4 那研究的c y t c t i 0 2 组装 膜，为实现分子开关、分子记忆元件提供了一种思路。 细菌视红紫质( b r ) 是一种嗜盐菌紫膜内的蛋白质，是具有能量转换和活性 离子输送功能的膜缔合蛋白，具有光驱泵的功能，是一种光驱动开关的原型，由 光辐射启动的质子泵在膜两边形成的电位，经离子灵敏场效应放大后，可给出较 好的开关信息。m l l i 】等研究的b r 自组装膜，为进一步制备光电器件提供了 新的途径。 1 3 3 医用生物材料 生物材料表面蛋白质的吸附、细胞在材料表面的粘连、信号传递等，决定了 生物材料表面所占的特殊位置，对生物材料表面进行生物分子的自组装修饰，能 改善材料的生物相容性，降低非特异性作用。蛋白质、酶、抗体等生物活性分子 在金属、活性生物陶瓷表面的组装h5 1 ，对研究将植入金属转变成能从周围细胞 组织引起特异响应的基材、生物陶瓷与骨细胞之间相容性及骨细胞在生物陶瓷表 面生长基等方面具有应用价值。 浙江太学硕士毕业论文 1 3 4 高效生物催化剂 s v r a o 等【7 1 在p s 胶乳上组装h r p 的研究表明：游离的b c a p h r p 的活性为 4 1 3 u m g ，而组装成p - a v h r p 膜后，h r p 活性提高到6 9 9 u m g 。酶在胶乳粒子上 自组装的研究，增加了固定酶的简单而实用的方法，提高了单位重量固定酶的活 力，从而进一步提高了酶的催化效率。 1 3 5 其它方面的应用 f c a r u s o 等h 5 研究以酶晶体为模板，在其表面组装聚电解质膜的方法。包 裹后的酶胶囊的外壁是可渗透性，可以让小分子底物自由出入，为微反应器的开 发、药物缓释体系的研究提供了思路。 1 4 1 概述 1 4 电流型酶传感器的概述和发展 随着杜会的发展和信息量的逐渐增多，人类感官能直接感知的“视野”日渐 缩小。作为一种能接收各种信息并将其转化为人类可接收信号的器件或装置，传 感器的作用正曰昼显现。生物技术的发展使人们找到了一种探测化学等变化的新 型高效探测元器件，这就是由生物技术与电子学相结合、生物活性物质与电化学 或其它传感器有机结合而形成的生物传感器，它具有识别各种活性生物高分子、 模拟甚至超过生物优秀感官功能的能力 4 。生物传感器是发展生物技术必不可少 的一种先进的检测方法与监控方法、也是物质分子水平的快速、微量分析方法。 在2 l 世纪知识经济发展中，生物传感技术将是介于信息和生物技术之间的新增 长点，在国民经济中的临床诊断、工业控制、食品和药物分析( 包括生物药物研 究开发) 、环境保护以及生物技术、生物芯片等研究中，有着广泛的应用前景【4 ”。 生物传感器根据传感器的分子识别元件上的敏感物质可分为；酶传感器、微 生物传感器、组织传感器、细胞器传感器和免疫传感器 4 8 1 。酶传感器是问世最早， 成熟程度最高并已商品化的一类生物传感器。自1 9 6 2 年c l a r k l 4 9 】以氧为中继体的 浙江大学硕士毕业语文 电催化原理构造酶传感器的设想提出以后，1 9 6 7 年u p d i k 和h i c k s 5 o 首次研制出 以铂电极为基体的葡萄糖氧化酶电极，用于定量检测血清中葡萄糖含量。酶生物 传感器是由一个固定化的生物敏感膜和与之密切结合的换能系统组成，它把固化 酶和电化学传感器结合在一起，因而具有独特的优点：( 1 ) 它既有不溶性酶体系 的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；( 2 ) 由于酶的专属反应性，使其具有高 的选择性，能够直接在复杂试祥中进行测定。因此，酶电极在生物传感器领域中 占有非常重要的地位【5 l 】。 酶生物传感器可分为电位型和电流型两类传感器。电位型传感器是指酶电极 与参比电极间输出的电位信号，它与被测物质之间服从能斯特关系。而电流型传 感器是以酶促反应所引起的物质量的变化转变成电流信号输出，输出电流大小直 接与底物浓度有关。电流型传感器与电位型传感器相比较具有更简单、直观的效 果，且灵敏度也高。 1 4 2 电流型酶传感器的发展 电流型酶传感器的发展经历了三个发展阶段： 第一代酶生物传感器是以氧为中继体的电催化。反应结果通过检测产物 h 2 0 2 浓度的变化或氧的消耗量来测定底物。这个方法有一定的缺点：溶解氧的 变化可能引起电极响应的波动；由于氧的溶解度有限，当溶解氧贫乏时，响应电 流明显下降，从而影响检出限；生物传感器的响应性能受溶液中p h 值及温度影 响很大。氧化h 2 0 2 时，电位高达o 8 v ，在如此高的电位下进行氧化测定，试样 中共存的其它电活性物质，如：抗坏血酸( 维生素c ) 和尿酸等，也可以在此电位 下氧化而产生氧化电流，给测定带来干扰，因此该方法的灵敏度和选择性相对较 差酬。 为了改进第一代酶生物传感器的缺点，现在普遍采用的是第二代酶生物传感 器，即介体型酶生物传感器，它是以媒介体修饰刹为基础的电催化。电子媒介体 的作用是能促进电子传递过程，降低工作电位，以排除其它电活性物质的干扰。 电流型生物传感器所要解决的中心问题就是使反应能够在恒电位下快速进行，将 电子从反应中心转移到电极表面，形成响应电流。电子转移的难易和速度决定着 这类传感器的性能 5 2 】。x iz h a n g 等人【5 3 通过分子交替沉积的方法成功的制备了 1 2 浙江大学硕士毕业论文 葡萄糖氧化酶( g o d ) 传感器，其中聚乙烯吡啶锇络合物为酶和金电极之间电 子起传递作用。通过紫外一可见光谱分析发现g o d 和聚合物存石英表碰的规律 沉积，循环伏安法进一步测得这个电极的生物活性，对溶液中的葡萄糖起来催化 作用。vy e g n a r a m a n 等人f 5 4 】通过将电子媒介体1 ，4 - 二氨基蒽醌( d a a q ) 和葡萄 糖氧化酶( g o d ) 层层共价交联制备葡萄糖传感器。d a a q 主要是对g o d 催化 产生的h 2 0 2 催化电子转移的作用，因此间接的测定了葡萄糖的浓度。灵敏度随 着层数的增加而增加。 第三代酶生物传感器是酶在电极上的直接电催化，目前为止只发现少数物质 能在电极上直接电催化。酶直接电化学已成为生物电化学研究的重要发展方向之 一。在理论上，酶与电极之间直接电子传递过程更接近生物氧化还原系统的原始 模型，为揭示生物氧化还原过程的机理奠定了基础；从应用方面而言，酶直接电 化学的实现可用于发展人工心脏用的生物燃料电池。因此，寻找更有效的方法和 手段实现更多酶的直接电化学，以满足生物医学、环境监测和工业快速分析的需 要，必将成为这个领域的发展趋势。如k v e n g a t a j a l a b a t h yg o b i 和f u m i o m i z u t a n i ”5 1 利用微过氧化物酶的直接电子转移的特征制备了胆固醇传感器。由于 微过氧化物酶分子小，能够和电极表面进行可逆的电子转移，而且它可以检测氧 化酶在催化反应过程中产生h 2 0 2 ，因此利用这个特征可以结合过氧化物酶和氧 化酶制备多种电流型传感器。n a i f e ih u 5 6 】等采用静电交替沉积的方法制备了 h b d h p p d d a 电极，实现h b 和电极之间的直接电子传递，在一0 3 4 v 处出现 f e ( i i i ) f e ( i i ) 的氧化还原峰。通过紫外可见光谱分析，发现组装在电极表面的酶 的其二级结构没有发生变化，而且还保留有它的电活性，对氧气，氯酸以及亚硝 酸等有催化活性。 1 5 电子媒介和高分子聚合物在传感器中的应用 电子媒介体( 又称媒介体，电子传递介体，电子转移媒介体，电子介体等) 是 指能将酶反应过程中产生的电子从酶反应中心转移到电极表面，使电极产生相应 电流变化的分子导电体。 浙江大学硕士毕业论文 1 5 1 二茂铁及其衍生物 二茂铁及其衍生物之所以能在生物学、医学、微生物学等方面得到广泛应用， 这是由它们结构和性质的特殊性决定。首先，二茂铁及其衍生物具有亲泊性，使 得这些化合物能顺利地通过细胞膜，从而与细胞内的各种酶、d n a 、r n a