（生物化学与分子生物学专业论文）蛋白激酶akt生物学功能的初步研究.pdf

独铆魁声蹰 y 7 1 7 4 6 7 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是拢 个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，不包含本八或他 已申请学位或其他用途使用过的成果。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了致谢。 申请学1 门论文与资料若肓不实之处，本 承担一切相关责任。 测，音虢羔塑曼日期 保护知识产权声明 o ；咄昂 本人完全了解第四军医大学肓关保护知识产权的规定，即：研究生在校 攻读学位期阔论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本a 保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工1 乍成果时署名单位仍然为第四军医大学。学 校可以公布论文的全部或部分内容( 含电子版，保密内容除外) ，可以采 用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被杳嘲和借闻， 并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。 黼粼：趔竖溅各：丝逑日期 臼兮啦铷 蛋白激酶a k t 生物学功能的初步研究 研究生：沈 岚 学科专业：生物化学与分子生物学 所在单位：第四军医大学 生物化学与分子生物学教研室 导师：药立波 教授 刘新平教授 资助基金项目 关键词 国家自然科学基金n o 3 0 1 7 0 4 6 5 国家杰出青年科学基金n o 3 9 8 2 5 1 1 3 蛋白激酶a k tr n a 干涉细胞周期n d r g 2 p h 结构域融合表达圆二色性 中国人民解放军第四军医大学 2 0 0 5 年0 5 月 第四军医大学硕士学位论文 缩略词表 英文缩写 p k b a k l b s a d m s o e c m e d t a f c m h r p k d a n d r g n m r m v r n f k b o d f a g e p b s p d k l p i 3 k p k a p m s f p t k r t - p c r r i s c r n a i s d s t a q 英文全称 p r o t e i nk i n a s eb b o v i n es e r u ma l b u m i n d i m e t h y l s u l f o x i d e e x t r a c e l l u l a rm a t r i x e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d f l o wc y t o m e t e r c y t o m e t r y h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e k i l od a l t o n n m y cd o w n s t r e a mr e g u l a t e dg e n e n u c l e a r m a g n e t i ci e s o n a r l c e m y r i s t o y l a t i o n n u c l e a rf a c t o rkb o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p i p 3 - d e p e n d e n tk i n a s e1 p h o s p h o i n o s i t i d e3 - o hk i n a s e c a m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ea p h e n y l m e t h ys u l f o n y lf l u o r i d e p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n r n a i n d u c e ds i l e n c e rc o m p l e x r n ai m a r f e r e n c e s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e t h e r m u sa q u a t i c u sd n a 中文名称 蛋白激酶b 牛血清白蛋白 二甲基亚砜 细胞外基质 乙二胺四乙酸 流式细胞仪术 辣根过氧化物酶 千道尔顿 n - m y c 下游调节基因 核磁共振 豆蔻酰化 核因子kb 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 磷脂酰肌醇3 磷酸依赖 激酶 磷脂酰肌醇3 激酶 c a m p 依赖的蛋白激酶 a 苯甲基磺酰氟 蛋白酪氨酸激酶 逆转录聚合酶链反应 r n a 诱导沉默复合体 r n a 干涉 十二烷基硫酸钠 栖热水生菌d n a 聚合 酶 第四军医大学硕士学位论文 s j r n a t e m e d t r i s y h k n i n t a c a s d a s e p k c l b e c o l i 【l k f a k f a d d m a p k m e k s m a l lj n t e r f e r e c er n a n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e t y r o s i n e h i s t i d i n e l y s i n e n i c k e l - n i t r i l o t r i a c e t i ca c i d c y s t e i n y la s p a r t a t e - s p e c i f i cp m t e a s e p r o t e i nk i n a s ec l u r i a - b e r t a n i ( m e d i u m ) e c o l i i n t e g r i n l i n k e dk i n a s e f o c a la d h e s i o nk i n a s e f a s a s s o c i a t e dd e a t hd o m a i n m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m a pk i n a s ek i n a s e 2 小干涉r n a n ，n ，n ，n - 四甲基乙二 胺 = ( 羟甲基) 氨基甲烷 酪氨酸 组氨酸 赖氨酸 镍一次氮基三乙酸 天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶 蛋白激酶c l b ( 培养基) 大肠杆菌 整合素链接激酶 粘着斑激酶 f a s 相关的死亡结构域 丝裂原活化蛋白激酶 丝裂原活化蛋白激酶激 酶 第四军医人学硕十学何论文 蛋白激酶a k t 生物学功能的初步研究 硕士研究生 导师 沈岚 药立波教授 刘新平教授 第四军医大学生物化学与分子生物学教研室，西安7 1 0 0 3 2 中文摘要 蛋白激酶a k t 是一种蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶，因其与蛋白激 酶a 和蛋白激酶c 具有相对高的同源性，亦被命名为蛋白激酶b ( p r o t e i nk i n s s eb ，p k b ) 。它也是病毒癌基因的表达产物( v a k t ) 在细胞内的同源类似物。蛋白激酶a k t 在哺乳动物中存在三种亚型： a k t l 。a k t 2 和a k t 3 。蛋白激酶a k t 是个多结构域蛋白，n 端为p h 结构域，中心为催化结构域，c 端是一个与p k c 调节区类似的区域。 其中p h 结构域可以和脂类第二信使p i p 结合，使a k t 向质膜转位而 被活化，因此p h 结构域对于a k t 的活化发挥重要功能。蛋白激酶a k t 作为磷脂酰肌醇一3 激酶( p 1 3 一k i n a s e ) 的下游分子，它广泛参与细 胞各种功能的调节。蛋白激酶a k t 对代谢的影响主要表现为促进蛋 白质的合成，促进糖原的转运。同时a k t 作为一种介导细胞存活信号 的重要分子，在细胞凋亡过程中的调节作用十分重要，其详细作用 第四军医大学硕十学伉论文 机理研究是细胞凋亡信号转导领域的热点。 本实验研究分为三个相对独立的部分：蛋白激酶a k t 对肿瘤细 胞生长的调节作用；a k t 与n d r g 2 之间相互关系的初探：a k tp h 结 构域二级结构的初步分析。 为了研究蛋白激酶a k t 对肿瘤细胞生长的影响，我们人工干预 a k t 信号通路，增加或降低内源性a k t 表达，持续激活或抑制a k t 的活化以观察其对细胞生长的影响。首先我们通过r n a i 的手段降低 乳腺癌细胞系m c f 一7 中内源性a k t1 和a k t 2 的表达，通过w e s t e r n b l o t t i n g 以及r t p c r 的方法证明a k t 表达下降后，分别运用m t t 比色法观察对m c f 一7 细胞增殖活性的影响、流式细胞术观察对m c f 一7 细胞周期以及凋亡的影响、软琼脂克隆形成实验观察恶性肿瘤细胞 侵袭能力的变化。上述的实验未能检测到m c f 一7 细胞系生长特性的 明显改变。其次，我们将构建的野生型k k t l 以及豆蔻酰化a k t l 的 真核表达载体转染c o s - 7 细胞以持续激活蛋白激酶a k t l ，运用流式 细胞术也未能检测到细胞周期出现明显影响。再次，我们运用蛋白 激酶a k t 以及其上游p i 一3 k 的小分子化学抑制剂，通过m t t 法可以 观察到两种p i - 3 k 抑制剂w o r t m a n n i n 和l y 2 9 4 0 0 2 都分别抑制了 m c f - 7 细胞的增殖活性，但是a k t 的抑制剂未能对其增殖活性出现明 显影响。因此，在m c f - 7 细胞中，a k t 可能不是其存活的关键分子。 在上述实验的基础上，我们分别将质粒w t a k t j ，m y r - a k t l s i a k t 与v d r 9 2 ( n m y c d o w n s t r e a mr e g u l a t e dg e n e2 ) 共转c o s 一7 细胞，通过免疫沉淀的方法发现当a k t 持续激活时n d r 9 2 磷酸化水 平增加，从而证明这种新基因n d r 9 2 的编码产物是蛋白激酶a k t 新 的底物。 第四军医人学硕十学能论文 另外，我们还对蛋白激酶a k t 的p h 结构域进行了融合表达 ( 6 h i s - p h ) 和纯化，对纯化的蛋白进行圆二色性分析。结果发现该 分子中，螺旋占1 7 ，b 折叠占8 0 5 ，无规则卷曲占1 7 8 ，这 与生物信息学分析的结果相近。 关键词：蛋白激酶a k t ：r n a 干涉：细胞周期：n d r g 2 p h 结构域：融合表达：圆二色性 第四军医人学硕十学佛论文 p r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t i o no f t h e b i o l o g i c a lf u n c t i o n s o f p r o t e i nk i n a s ea k t p o s t g r a d u a t e ：l a n s h e n s u p e r v i s o r ：p r o f l i - b o y a o p r o f x i n - p i n gl i u d e p a r t m e n t o fb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y t h ef o u r t hm i l i t a r y m e d i c a lu n i v e r s i t y x i n i l7 1 0 0 3 2 a b s t r a c t t h ep r o t e i nk i n a s ea k ti sas e r i n e t h r e o n i n ek i n a s e ，w h i c hi sa l s o t e r m e dp r o t e i nk i n a s eb ，b a s e do ni t sh o m o l o g yt op r o t e i nk i n a s eaa n d p r o t e i nk i n a s ec i t i st h ec e l l u l a rh o m o l o gt ot h er e t r n v i r a lo n c o g e n e v i r a la k t ( v a k t ) a k ti nm a m m a l sc o m p r i s e st h r e eh i g h l yh o m o l o g o u s m e m b e r sk n o w na sa k t l ，a k t 2 ，a n da k t 3 a k ti sam u t i d o m a i n s p r o t e i n t w h i c hi n c l u d e san t e r m i n a l p l e c k s t r i nh o m o l o g yd o m a i n ，a c e n t r a lk i n a s ec a t a l y t i cd o m a i na n dar e g u l a t o r yd o m a i na tt h ec a r b o x y l t e r m i n a lr e g i o n a m o n gt h e m ，p hd o m a i nc a l lb i n dp i p 3 ，al i p i ds e c o n d m e s s e n g e re s s e n t i a l f o rt h et r a n s l o c a t i o no fa k t p k bt ot h ep l a s m a m e m b r a n ew h e r ei ti sp h o s p h o r y l a t e da n da c t i v a t e d s op hd o m a i np l a y a l li m p o r t a n tr o l ei nt h ea c t i v a t i o no f a k t t h ep r o t e i nk i n a s ea k ta c t sa s t h e m a j o rd o w n s t r e a mt a r g e t o fp i 一3 ka n dr e g u l a t e st h eb i o l o g i c a l 6 第四军医人学硕十学位论文 f u n c t i o no fc e i l sa k t p k bc a np r o m o t ep r o t e i ns y n t h e s i sa n dg l y c o g e n t r a n s p o r t a t i o n a k t p k bh a se m e r g e da s ac r u c i a lr e g u l a t o ro fw i d e l y d i v e r g e n t c e l l u l a r p r o c e s s e si n c l u d i n ga p o p t o s i s ，p r o l i f e r a t i o n ， d i f f e r e n t i a t i o n a k t p k b a p p e a r s t o p l a y a n i m p o r t a n t r o l ei nt h e p r o g r e s s i o no f h u m a nt u m o r s ，a n di t sp o t e n t i a lm a c h a n i s mi st h ef o c u so f s i g n a lt r a n s d u c t i o no f a p o p t o s i s i no r d e rt oe x p l o r et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no f p r o t e i nk i n a s ea k t ，t h e r e s e a r c hw a s c o m p o s e d o ft h r e e r e l a t i v e l yi n d e p e n d e n tp a r t s ：t h e r e g u l a t i o nf u n c t i o no f a k ti nt u m o r i g e n e s i s ；t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na k t a n d n d r g 2 ；a n a l y s i s o ft h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo f a k tp hd o m a i n t oi n v e s t i g a t et h er e g u l a t i o nf u n c t i o no fa k ti nt u m o r i g e n e s i s ，w e t r i e dt oi n t e r v e n ei nt h ea k ts i g n a lp a t h w a yb yi n c r e a s i n go rr e d u c i n g e n d o g e n o u sa k te x p r e s s i o n ，a c t i v a t i n ga k to ri n h i b i t i n ga k ta c t i v i t yt o i n v e s t i g a t e t h ee f f e c to nc e l l g r o w t h f i r s t l y , w es u c c e s s f u l l yr e d u c e d e n d o g e n o u se x p r e s s i o n o fa k t la n da k t 2i nb r e a s tc a n c e rc e l ll i n e m c f 一7b yr n ai n t e r f e r e n c ea n dd e t e c t e dt h er e s u l tv i aw e s t e r nb l o t t i n g a n dr t - p c r t h e nw eb e g a nt oo b s e r v em c f 一7c e l l sv i a b i l i t yb ym t t , c e l lc y c l ea n da p o p t o s i sb yf l o wc y t o m e t r y ，i n v a s i o ne f f i c i e n c yb ys o f t a g a rt r a n s f o r m a t i o na s s a 矿w e c a nn o td e t e c ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h e b i o l o g i c a lc h a r a c t e r so f m c f 一7c e l l sb e t w e e np s i l e n c e r a k tt r a n s f e c t i o n g r o u p a n dn e g a t i v ec o n t r o lg r o u p s e c o n d l y , w ei n h i b i t e dp r o t e i nk i n a s e a k ta n dp i 3 k i n a s ea c t i v i t yb yc h e m i c a li n h i b i t o r sa n do b s e r v em c f 7 c e l l v i a b i l i t yb y m t t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp i 3 ki n h i b i t o r s w o r t m a n n i na n dl y 2 9 4 0 0 2 b u tn o ta k ti n h i b i t o rc a l lw e a k e nm c f 一7 7 第四军医人学硕十学位论文 c e l lv i a b i l i t y t h e r e f o r e ，a k ti sn o tt h ek e ym o l e c u l ei nm c f - 7c e l l s s u r v i v a l t h e r em a ye x i s to t h e rm o l e c u l e st or e p l a c et h ef u n c t i o no f p r o t e i nk i n a s e a k t b a s e do nt h ea b o v ee x p e r i m e n t s ，c o s 7c e l l sw e r ec o t r a n s f e c t e d w i t hn d r 9 2 ( n - m y cd o w n s t r e a mr e g u l a t e dg e n e 2 1a n dw i l dt y p ea k t l ， m y r i s t o y l a t i o n a k t l ，s i a k t l ，r e s p e c t i v e l y i m m u n o p r i c i p i t a t i o n a n d w e s t e r nb l o t t i n ga s s a y sw e r ep e r f o r m e da n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t n d r 9 2p h o s p h o r y l a t i o n l e v e li n c r e a s e dw h e na k t1w a sc o n s t i t u t i v e l y a c t i v a t e d s ow ep r o v e dt h a tn d r 9 2m i g h tb ean e ws u b s t r a t eo fp r o t e i n k i n a s ea k t i na d d i t i o n ，w ee x p r e s s e da n dp u r i f i e dt h es o l u b l e6 h i s p k bp h d o m a i na n da n a l y s e dt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft h ef u s i o np r o t e i nb y c i r c u l a rd i c h r o i s mt h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h ep hd o m a i nw a s c o m p o s e do f q h e l i x 1 7 b p l e a t e d s h e e t s8 05 a n dr a n d o mc o i l 17 8 w h i c hi ss i m i l a rt ot h er e s u l t so fb i o i n f o r m a t i ca n a l y s i s k e y w o r d s ：p r o t e i nk i n a s ea k t ；r n ai n t e r f e r e n c e ；c e l lc y c l e ； p h d o m a i n ；n d r g 2 ；f u s i o ne x p r e s s i o n ；c i r c u l a rd i c h r o i s m 8 第四军医犬学硕十学位论文 文献回顾 一、蛋白激酶a k t 的研究进展 蛋白激酶a k t 又称为蛋白激酶b ，因其具有与蛋白激酶a ( p k a ) 和蛋白激酶c ( p k c ) 相对高的同源性而被命名为蛋白激酶b ( p k b ) 。 a k t 最初是s t a a l 等人从小鼠的胸腺瘤所构建的细胞系中分离到的 一种反转录病毒，命名为a k t 8 ，该病毒接种新生小鼠可诱发肿瘤。用 小鼠基因组d n a 进行转染实验，发现了一种非病毒类似序列，称为 c - a k t 。大约在a k t 8 发现8 年后，几个研究组同时克隆了v - a k t 的 同源序列c - a k t 。c a k t 的编码产物能使s e r t h r 磷酸化，故称之为 蛋白丝氨酸苏氨酸激酶a k t 。蛋白激酶a k t 功能最初的认识集中在 对代谢的影响，包括对蛋白质以及糖代谢的影响。但是近年来的研 究发现蛋白激酶a k t 可能是细胞生存相关的重要调节因子，在细胞 凋亡过程中的调节作用十分重要，其详细作用机理研究是细胞凋亡 信号转导领域的热点。研究蛋白激酶a k t 在肿瘤细胞中的调节作用 可以进一步认谚 肿瘤发生发展的病理过程，为肿瘤药物治疗的靶点 提供相应的理论基础和思路。 1 蛋白激酶a k t 的结构和定位 目前发现在人类至少存在三种a k t 家族成员：a k t l p k b c t 、a k t 2 p k b 3 、a k t 3 p k by 。此外还存在两种c 术端的剪接体：p k b 3 l 在p k b 3 的c 末端延长了4 0 个氨基酸，p k bvl 有一个与p k by 不同的c 端。 图l 是蛋白激酶a k t 的全部亚型。 蛋白激酶a k t 在结构组成上有三个功能结构域：n 末端的p h 结 构域，中间的催化结构域和c 米端的调节结构域。蛋白激酶的p h 结 构域在进化上是高度保守的，通过介导蛋白质一脂质和蛋白质一蛋白 质之间的相互作用而发挥重要的功能。 第四军医人学硕十学位论文 蛋白激酶a k t l 中存在两个磷酸化位点，即第3 0 8 位苏氨酸( 催 化结构域) 和第4 7 3 位丝氨酸( 调节结构域) 。这些位点均为反式 磷酸化位点。 图1 p k b 亚型及变异体的结构域组成 f i g d o m a i ns t r u c t u r eo fp k bis o f o r m sa n dv a r i a n t s 2 蛋白激酶a k t 的组织分布及表达 a k t l 和a k t 2 分布广泛，在脑、胸腺、心和肺中水平较高。而 a k t 3 则主要在脑和睾丸中表达，在心脏、肺、脾和骨骼肌较低。但 是所有的组织中却至少含有一种a k t 。在一些肿瘤组织中a k t 基因出 现明显的扩增，在1 2 1 的卵巢癌和2 8 的乳腺癌中可以见到明显 的基因扩增，在胃癌中亦可以检测到a k t 基因近2 0 倍的扩增。 有关a k t 的表达调控，目前所知不多，但似乎在终未分化的细 胞中表达水平较高。例如，a k t 在多能纤维母细胞中表达水平较低， 但是如果转染由少卯基因使细胞分化成肌细胞则a k t 表达显著增加。 3 。蛋白激酶a k t 的活性调节 3 1p i 一3 k ( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 一3k i n a s e ) 依赖的a k t 活化 p i 一3 k 是由s u g i m o t o 和m a c a r a 等在1 9 8 4 年发现的一种胞内磷脂 第四军医人学硕十学债论文 酰肌醇激酶。它可以特异性地使肌醇环上的3 位羟基磷酸化，其产物 是在3 位上有磷酸根的多磷酸肌醇酯，包括3 ，4 一二磷酸磷脂酰肌醇 ( p i 一3 ，4 - p ：) 和3 ，4 ，5 一三磷酸磷脂酰肌醇( p i 一3 ，4 ，5 - p 、) 等，它们都是 位于质膜上的第二信使。p i 一3 k 由一个催化亚基( 1 1 0 k d ，p l1 0 ) 和一 个调节亚基( 8 5 k d ，p 8 5 ) 所构成。p 8 5 亚基的氨基端含有s h 3 结构域 和能与s h 3 结构域结合的富含脯氨酸区域，羧基端含有两个s h 2 结构 域和一个与p 1l o 亚基结合的区域。p ll o 亚基具有s e r t h r 激酶的活 性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。 蛋白激酶a k t 是p i 一3 k 下游的信号分子。a k tn 端的p h 结构域是 p i 一3 k 产物p i p ：和p i p ，作用的位点，p i p 。和p i p ：。均可以高亲和力结合 p h 结构域。p i p ；的结合对a k t 的活性没有影响，p i p ：可以引起a k t 活 性的轻度升高。尽管如此，a k t 的p h 结构域与p i p ：或p i p 。结合的主要 作用是向质膜的移位，使之靠近上游活化它的激酶类分子。 肿瘤抑制基因p t e n 作用机制与p 1 3 k a k t 信号通路相关，人体很 多肿瘤p t e n 基因缺失。p t e n 可以使p i 一3 k 的脂类产物p i p ：以及p i p , 脱去磷酸，下调由p 1 3 k a k t 途径调控的细胞生长和存活。 3 2a k t 是p d k i ( p i p ；一d e p e n d e n tk i n a s e1 ) 的底物 在p i - 3 k a k t 信号通路中，蛋白激酶a k t 被磷脂酰肌醇依赖的蛋 白激酶l ( p h o s p h o i n o s t i d e d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e1 ，p d k i ) 磷 酸化而激活。p d k i 是一个6 3 k d 的丝苏氨酸蛋白激酶，其c 末端含有 一个p h 结构域。当蛋白激酶a k t 的p h 结构域与p i p ，结合以后向质膜 转位，并暴露出磷酸化位点t h r 3 0 8 ，p d k l 使后者磷酸化而激活。p i p ： 在这个过程中具有双重作用，一方面它可以结合a k t 的p h 结构域将其 携带至质膜，同时又可以激活p d k i 的活性。 3 3 蛋白激酶a k t 活化的机制 蛋白激酶a k t 在没有受到外界刺激条件时以非活化形式定位于细 胞浆中。当细胞受到生长因子如血小板衍生生长因子，胰岛素样生长 因子，成纤维细胞生长因子等刺激以后，细胞膜上受体酪氨酸激酶磷 第四军医人学硕十学位论文 酸化，从而活化p i 一3 k ，使p i p ：的3 位羟基磷酸化产生p i p ，。p i p 。可 以和a k t 的p h 结构域结合使之募集到质膜上，质膜上的p d k l 分子催 化t h r 3 0 8 磷酸化。t h r 3 0 8 单一位点的磷酸化只能部分激活a k t ，全部 激活需要$ 4 7 3 的磷酸化。但是s 4 7 3 磷酸化的机制仍然存在争议，其 可能的途径包括：自主磷酸化p d k - l i l k ( i n t e g r i n l i n k e d k ir l s s e ) p d k 2 。蛋白激酶a k tt h r 3 0 8 和$ 4 7 3 的磷酸化是分别独立 的，而且单独$ 4 7 3 的磷酸化对a k t 的活性没有出现明显的影响和改变。 图2 蛋白激酶a k t 活化的机制 f i 9 2 m e c h a n is mo fa c t i v a t i a no fp k b a k t 还有报道指出a k t 的活化可以不依赖于p i - 3 k 途径。c a m p p k a 途 径可以激活a k t 但并不影响p i - 3 k 的活性。除此以外，c a mk i n a s e ， h s p 2 7 均可以激活a k t 关于蛋白激酶a k t 活化的调控机制是一个复杂的过程。最近仍有 文献报道：蛋白激酶a k t 的活化还需要两个酪氨酸位点的磷酸化即 y 3 1 5 和y 3 2 6 ，这些位点的修饰依赖于s r c 家族酪氨酸激酶的活性。如 果上述的结果得到证实，蛋白激酶a k t 的调控机制将更加复杂。但是 这种结果也与肿瘤细胞中s r c 家族蛋白激酶过表达相关。 3 4 蛋白激酶a k t 的去磷酸化调节 a k t 磷酸酶负向调节a k t 的活性，抑制该酶能使a k t 激活。此外， p t e n 、含s h 2 功能区的肌醇磷酸酶( s h 2 一d o m a i nc o n t a i n i n gi n o s it o l 第四军医大学硕十学伉论文 p h o s p h a t a s e s ，s h i p ) 等磷酸酯酶通过水解p i p ，的磷酸基团，使p i p ，去 磷酸化，间接抑制a k t 的活性。目前研究证实：热休克蛋白9 0 能阻止 磷酸酶负性调节a k t 活性，神经酰胺可以使$ 4 7 3 去磷酸化进而抑制 a k t 的活性。 近年来也有报道蛋白激酶a k t i 的负向调控蛋白c t m p ( c a r b o x y 卜t e r m i n a lm o d u l a t o rp r o t e i n ) 可以和a k t l 的c 末端结 合，通过t h r 3 0 8 和s e r 4 7 3 的去磷酸化负向调节a k t l 的活化。但是在 胰岛素刺激条件下能够使a k t l c t m p 复合物解聚，说明c t m p 对a k t 的负向调控作用较弱。 4 蛋白激酶a k t 的底物 a k t 的下游信号分子包括转录因子c r e b ( c a m p 反应元件结合蛋 白) 、e 2 f 、转录抑制因子4 e b p ( e i f 4 e 结合蛋白) 、糖原合成激酶一3 ( g s k 一3 ) 、蛋白丝氨酸苏氨酸激酶p 7 0 s 6 k 、葡萄糖转运分子g l u t 4 及促凋亡分子b a d 等。 a k t 适合的底物多肽序列为r x r y z ( s t ) 一h y ，其中x 代表任何氨基 酸，y 和z 代表除了甘氨酸以外的小氨基酸残基，h y 代表疏水基团。 4 1c r e b a k t 催化c r e b 的s e r l 3 3 磷酸化，促进其与c r e b 结合蛋白( c b p ) 结合，c r e b c b p 复合物进入胞核内与靶基因增强子中的c a m p 反应元 件( c r e ) 结合，诱导多种细胞生长相关基因的表达。 4 2e 2 f e 2 f 是一种通用转录因子，可启动二氢叶酸还原酶、细胞周期 蛋白e 等多种d n a 合成及细胞周期调节蛋白基因的转录。在细胞进 入细胞周期前，e 2 f 与二聚体伴侣蛋白d p i 2 结合形成复合物，在胞 浆内与p r b b 、p 1 0 7 和p 1 3 0 等袋状分子结合而处于无活性状态。当 这些袋状蛋自在c y c l i n c d k 作用下磷酸化时，e 2 f 被释放丽得以发 挥转录调节活性。a k t 通过下调c y c l i n l c d k 抑制剂p 2 7 “”，上调 c y c l i n d 3 ，使p r b b 、p 1 0 7 和p 1 3 0 分子高度磷酸化，促进e 2 f 的转 第四军医火学硕十学仲论文 录活性，使细胞从g l 期进入s 期。 4 34 e b p 真核细胞转录起始因子e f f 4 9 是一种m r n a5 帽结合蛋白，与 细胞的生长、增殖密切相关，被视为一种重要的原癌基因。e i f 4 e 结合蛋白4 e b p 是e i f 4 e 的抑制因子，当4 e b p 被a k t 磷酸化后， 不能结合e l f 4 e ，丧失了对e i f 4 e 的抑制作用，e i f 4 e 活性升高而 活化多种基因的转录。 4 4p 7 0 s 6 激酶 p 7 0 s 6 激酶的生理功能是在丝裂原刺激下磷酸化核糖体4 0 s 亚单位中的s 6 蛋白，促进m r n a 的转录。p 7 0 s 6 激酶的磷酸化与活 化主要由a k t 催化，同时也需要p d k l 的参与，但是不依赖于p i p 。 和p i p 。 4 5 糖原合成激酶一3 ( g s k 一3 ) 在体内作为第一个a k t 底物被发现的是g s k 3 ，用胰岛素或i g f i 刺激2 9 3 细胞均可以引起g s k 第9 位丝氨酸磷酸化使之失活，从而 导致糖原合成增加。g s k 3 还在其它数条细胞内信号转导途径中发挥 作用，例如调控a p l 和c r e b 的表达。 4 66 1 u t 4 g l u t 4 是胰岛索敏感的葡萄糖转运分子之一，在胰岛素的作用 下，g l u t 4 从胞浆向质膜移位。a k t 可以促进葡萄糖的转运和g i u t 4 向质膜的移位，并可促进脂肪细胞的分化。 4 7b c l 2 家族成员b a d 在细胞内和细胞外实验中均有证据表明a k t 可以磷酸化b c l 2 家族 成员b a d 。磷酸化位点是其第1 3 6 位丝氨酸，这一位点的磷酸化导致 其丧失与b e l 一x l b c l - 2 结合能力，防止其细胞凋亡的促进作用。 4 8p r o c a s p a s e 一9 p r o c a s p a s e 一9 是c a s p a s e 级联反应的起始蛋白酶，在凋亡信号转 导中起着中间的转接作用。c a s p a s e 一9 的活化可以引起c a s p a s e 一3 、 4 第四军医大学硕十学位论文 c a s p a s e 一6 、c a s p a s e - 7 等蛋白酶的激活，主要参与线粒体有关的细胞 凋亡过程。a k t 可以磷酸化p r o c a s p a s e 一9 从而阻断内源性蛋白酶的活 性。因而在凋亡调控过程中发挥重要功能。 4 9f o r k h e a df a m i l y f o r k h e a df a m i l y 的成员f k h r 、f k h r l l 以及a f x 都含有蛋白激酶 a k t 磷酸化的序列，在体外都可以被a k t 磷酸化。f o r k h e a df a m il y 的蛋白被磷酸化修饰以后可以改变它们的亚细胞定位。在未被a k t 磷 酸化修饰时它们大部分定位于细胞核，促进凋亡相关基因愚s 屯， 粥脚和肋的转录，促进细胞凋亡。被a k t 磷酸化活化以后它们从 胞核转位至胞浆与1 4 - 3 3 蛋白结合，抑制细胞凋亡。 4 1 0i kbk i n a s e n f kb 可以被多种细胞外刺激活化，参与凋亡、炎症等多种条 件下的基因调控，具有重要的生理和病理作用。在多数细胞中，n f kb 与其抑制蛋白i kb 家族的成员结合，以复合物的形式存在于胞 浆中。当细胞受到活化刺激以后，n f hb 与i kb 解离，并褥以进入 胞核中，与相应的靶序列结合，调节基因的表达。i 一“b 解离的前提 是其自身的磷酸化，催化i kb 磷酸化的激酶是i kbk i n a s e 。蛋 白激酶a k t 可以激活i kbk i n a s e 参与n f 1 1b 的转录调控。 蛋白激酶a k t 的部分底物见图3 4 蛋白激酶a k t 的生物学功能 蛋白激酶a k t 的生物学活性主要受到各种生长因子、胰岛素和细 胞外基质的调控，因此对其功能的最初认识集中在对代谢过程的调节。 但是自从发现a k t 的抗细胞凋亡效应后，a k t 作用研究的热点更多的 集中到了细胞凋亡领域。 ，n p t ， a s k is e r 8 3 i n h i b i t i o no fn e # 一 a ：矗y a 培d 上i i 埔s - b s b a d c r b b s e 订3 6 f 1 3 3 f 瞰k b 嘴df a m i l y ( f i 饵r t h r 2 a b i ( i - i r , t ，a f ? x )( f 髓r i ku bk i n a 船 a 描妇t 弧d8 a dw i t h 1 4 0 - 3 i x “e m s ：q r 目 s i o no fb a d 咖d l ，c o d n d 黯t h i i 霉r t t 辩dn _ n $ c 栅硼o f c r e 丑h 聃i a m 。d s u r v i v a l 掌 s a 2 5 6 s c f 3 1 9m 州骼a u a h ra 雌i n - s 蝴：