（光学工程专业论文）纳米光纤传感系统的研制及在单细胞检测中的应用.pdf

专业 目 福建师范大学学位论文使用授权声明 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。本人了解福建师范大 学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交的学位论 文并允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容； 学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名 签名日期 沙 指导教师签名 摘要 于两姜 常规的细胞生物化学分析方法一般以大量细胞为研究对象，只能用平均结果反 映单个细胞的化学信息。利用纳米光纤传感技术可以实现单个细胞水平的研究，可 以获得反映细胞生理状态和过程的更准确、更全面的信息。 集倒置荧光显微镜、单光子计数器和10 0p s 的数据采集卡等，我们搭建了适合 单细胞分析的纳米光纤传感平台，并使用l a b v i e w 编写了采集、处理程序。整机调 试表明：系统稳定可靠，时间累加后可以探测到单个细胞( 导入荧光素) 的荧光强 度。 基于纳米光纤探针和荧光探针c f d a ，使用荧光强度比值法研究了单个酵母细 胞内p h 值的测量。对比使用f l s 9 2 0 全功能稳态瞬态荧光光谱仪测得的群体细胞 的p h 标准曲线，极大地提高了探测的灵敏度( 约3 8 倍) 。 我们测量了在相同的环境条件下的单个细胞之间的p h 值。结果表明个体细胞 p h 是存在差别的，这种差别最大可以达到0 2 p h 。因此传统的用平均的结果并不能 反映单细胞之间化学信息的差异。 我们研究了细胞外p h 值对单个细胞内p h 值影响，发现没有基因敲除的酵母细 胞比基因敲除的细胞( 醇脱氢酶基因a d h 2 和a d h 2 等位基因同时敲除，或只敲 除醇脱氢酶基因a d h 2 ) 具有更强的维持细胞内p h 值的能力。特别是外部p h 大 于9 5 的时候，这种差别更加突出。 关键词： 纳米光纤传感器、单细胞检测、纳米光纤探针、单细胞p h 值标准曲线 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ec o n v e n t i o n a la n a l y t i c a lm e t h o d sw h i c hg e n e r a l l yc h o o s eam a s so fc e l l sa st h e r e s e a r c ho b je c tc o u l do n l yg e ta l la v e r a g er e s u l t so ft h ec h o s e nc e l l s s o ，i ti so f t e n i n a c c u r a t eo re v e nw r o n g b u tt h er e s e a r c hb a s e do nt h en a n o f i b e ro p t i c a ls e n s i n g t e c h n o l o g yc o u l dg i v et h ei n f o r m a t i o no fas i n g l ec e l l w i t ht h er e s e a r c ha tas i n g l ec e l l l e v e l ，m o r ea c c u r a t ea n dc o m p r e h e n s i v ei n f o r m a t i o nw h i c hi n d i c a t e st h ep h y s i o l o g i c a l s t a t ea n dt h ep r o c e s so ft h ec e l lc o u l da l s ob eo b t a i n e d w eh a v eb u i l tas y s t e mw h i c hs u i t ss i n g l ec e l la n a l y s i s t h es y s t e mm a i n l yi n v o l v e s a l li n v e r t e df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，a s i n g l ep h o t o n c o u n t e ra n da10 0 p s d a t a a c q u i s i t i o nc a r d a n dw ea l s oh a v ew r i t t e nal a b v i e wb a s e da c q u i s i t i o np r o c e d u r ef o rt h e d a t aa c q u i s i t i o nc a r d o v e r a l ld e b u g g i n gi n d i c a t e st h a to u rs y s t e mi sv e r ys t a b l ea n di tc a n d i s t i n g u i s ht h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f as i n g l ec e l l ( c e l lw a si n j e c t e df l u o r e s c e i n ) w i t hn a n o f i b e rp r o b e sa n df l u o r e s c e n c ep r o b e s ，w eh a v em e a s u r e di n t r a c e l l u l a rp h v a l u eo fas i n g l ey e a s tc e l lu s i n gt h er a t i om e t h o do ft h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y c o n t r a s t 、析t 1 1t h er e s u l to b t a i n e df r o mm u l t i t u d i n o u sc e l l sb yu s i n gt h ef l s 9 2 0c o m b i n e d f l u o r e s c e n c el i f e t i m e & s t e a d ys t a t es p e c t r o m e t e r , w eh a v eg r e a t l yi m p r o v e dt h ed e t e c t i o n s e n s i t i v i t y ( a p p r o x i m a t e l y3 8t i m e s ) w eh a v em e a s u r e dt h ep hv a l u e so fd i f f e r e n t s i n g l e c e l l su n d e rt h es a m e e n v i r o n m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a td i f f e r e n ts i n g l ec e l l sh a v ed i f f e r e n tp hv a l u e s ，e v e n t h o u g ht h e ya r eu n d e rt h es a m ec o n d i t i o n t h em a x i m a ld i v e r g e n c eb e t w e e nt h e mc o u l d r e a c h 0 2 p h s o ，t h ea v e r a g er e s u l t so b t a i n e db yt h ec o n v e n t i o n a la n a l y t i c a lm e t h o dc a r l t i n d i c a t et h ec h e m i c a li n f o r m a t i o nd i f f e r e n c e sb e t w e e nt h ec e l l s w eh a v es t u d i e dt h ee f f e c to ft h ee x t r a c e l l u l a rp ho nt h ei n t r a c e l l u l a rp hv a l u eo fa s i n g l ec e l l b yc o m p a r i n gt h ee f f e c t so fe x t e r n a lp h oo np h io fb o t hn a t u r a ly e a s tc e l la n d i t sh e t e r o z y g o t es t r a i n s ( o n e 晰t ha d h 2g e n er e m o v e d ，t h eo t h e rw i t hb o t ha d h 2a n di t s a l l e l er e m o v e d ) ，ad i f f e r e n tb e h a v i o rw a so b s e r v e db e t w e e nt h e s es t r a i n s ，a n dt h en a t u r a l y e a s tc e l l sh a v es t r o n g e rp o w e rt or e g u l a t ea n dm a i n t a i np h ia sar e s p o n s et ot h ep h 。 c h a n g i n g t h i sd i f f e r e n c ew i l lb em o r eo u t s t a n d i n ge s p e c i a l l yw h e nt h ep h 。i sa b o v e9 5 a b s 仃a c t k e y w o r d sn a n o f i b e rs e n s o r , s i n g l ec e l ld e t e c t i o n , n a n o - f i b e rp r o b e ，i nv i v oi n t r a c e l l u l a r p hm e a s u r e m e n to fas i n gc e l l i i i 中文文摘 中又又手两 对单个细胞的研究不仅有利于解释细胞及生物体的生理活动，而且有利于阐明 各种疾病( 如癌症) 的发病与治疗机理。由于受取样技术及检测灵敏度的限制，细胞 化学成分的常规分析方法一般以大量细胞为研究对象，用平均结果反映单个细胞的 化学信息。然而，由于生物组织中各种化学成分分布及细胞本身的高度不均匀性， 大量细胞分析常常得出不准确甚至错误的结论。因此直接分析单个细胞的化学成分 十分重要。它可以揭示不同细胞在化学组成、生理响应等方面的差异性，进而有助 于解释细胞的一些生理现象。有利于疾病的早期诊断。在发病期，仅有极少量细胞 发生病变，如果采用大量细胞同时分析，微弱的致病信号就会被来源于大量正常细 胞的平均信号完全掩盖，只有逐一分析单个细胞，才有发现极少量病变细胞的可能 性。有利于药物设计及疾病的合理治疗。不论是正常细胞和病变细胞之间，还是病 变组织内部各个病变细胞之间，在药物吸收、释放、分布、代谢等方面都可能存在 很大差异，准确、客观地揭示这种差异对设计靶向药物、靶向药物剂型以及个性化 药物治疗方案都是非常有利的。 所以单个细胞水平的研究，可以获得反映细胞生理状态和过程的更准确、更全 面的信息，还可以使人们能更好地了解细胞群体中某些特殊的细胞功能，更深入地 认识细胞个体差异、细胞间相互作用和信息传递以及神经递质、药物或毒物刺激的 生理影响等更深层次的信息。因此，单细胞分析具有重大而深远的意义。光纤传感 技术的发展极大地推动了生物研究的发展，特别是生物检测手段的革新。光纤纳米 传感器是近年来在光纤传感器基础上利用近场光学显微术和纳米探针制备技术发展 起来的。我们研制的光纤纳米传感器主要由纳米级的光纤探针构成，它不但具有传 感响应时间短，所需样品少，损耗小，不受电磁辐射影响，抗腐蚀能力强等优点， 而且还具有体积小、分辨率高、对活细胞测量损伤小等特点，是医学诊断和病理研 究的重要手段。 本论文的主要内容如下： 第一章，首先概述了本课题的研究背景和选题意义；简要介绍了国内外的研究 动态；最后阐述了本论文的主要工作和研究成果。 第二章，首先介绍了纳米光纤传感技术与单细胞分析技术；接着分析了纳米光 纤传感技术与单细胞分析技术相结合的意义；最后，提出搭建了基于纳米光纤传感 中文文献 技术的单细胞分析平台，编写了基于l a b v i e w 的采集驱动程序、数据记录处理程序、 数据实时显示程序，并对系统整机、灵敏度进行了调试，对单个细胞的荧光强度进 行了测量。结果表明，我们的系统非常适合单个细胞的分析，灵敏度很高，能分辨 出单个细胞( 导入荧光素) 的荧光强度。 第三章，首先对光纤进行了简介；接着介绍了光纤纳米探针的常用制备方法， 分析了他们的优缺点，提出了火焰熔融化学腐蚀修正的纳米光纤制备方法，并分析 了不同实验参数对拉制结果的影响，定性总结了拉制、使用纳米探针过程中应该注 意的一些问题。最后获得了重复性较好的尖端4 0 0n m 左右的探针拉制参数。单细胞 分析特别需要尖端1 0 0n m 以内的探针，因此我们又购买了一台标准的p 2 0 0 0 拉制 仪，这台仪器可以将光纤拉制到3 0n m 左右，为我们的后续实验奠定了基础。 第四章，在福建师范大学生命科学学院制备了酵母细胞的原生质体。提出了基 于纳米光纤探针和荧光探针的单个细胞的荧光测量方法。这个方法只需要移动纳米 探针，就可以测量单个细胞的总荧光和背景荧光。这种移动代替了传统的离心，大 大降低了实验误差。使用这种方法，我们对单个活体酵母细胞胞内的p h 值进行了 测量。对比使用f l s 9 2 0 全功能稳态瞬态荧光光谱仪测得的群体细胞的p h 标准曲 线，极大地提高了探测的灵敏度( 约3 8 倍) 。 第五章，使用上述提出的分析单个细胞的方法，我们测量了在相同环境下的细 胞之间的p h 值。结果表明个体细胞p h 是存在差别的，最大可以到0 2 p h 。所以用 传统的大量细胞的平均p h 值做为细胞内的p h 值是不合理的。另外我们研究了细胞 外p h 值对单个细胞内p h 值影响。对比了没有基因敲除的酵母细胞和基因敲除的细 胞( 醇脱氢酶基因a d h 2 和a d h 2 等位基因同时敲除，或只敲除醇脱氢酶基因 a d h 2 ) 的不同响应，发现他们维持细胞内p h 值的能力不相同，没有基因敲除的 酵母细胞具有更强的维持细胞内p h 值的能力。并且在细胞外p h 升到9 5 以上的时 候，这种能力差别表现的更突出：因细胞的碱化，细胞维持胞内p h 的能力大大下 降；基因敲除的细胞荧光素的溢出量是没有基因敲除的酵母细胞的两倍。 结束语部分，总结了本论文所做的工作，阐述了本论文的意义，指出本论文的 新颖之处以及工作中的不足之处，列举了下一步有待开展的工作。 v 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 引言 研究单个细胞的化学组分的信息将使人们能更好地了解细胞中某些特殊的细胞 功能，从大量的细胞群体中筛选并检测出单个特异性细胞的生理、病理的变化，从 而在重大疾病早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、病理过程的研究方面有重要 意义。由于细胞极小，细胞内所测组分均为超痕量( z m o l f m 0 1 ) ，胞内组分十分复杂。 因此，要在单细胞水平研究细胞内组分，分析方法须具有能处理极小体积( 单个全细 胞) 、同时测定多种化合物，并能给出良好的定性定量等特点。 生物传感器是研究生命科学的重要工具，他能实时监测生物体内、组织细胞内 各种成分和性质。纳米光纤生物传感器是纳米光纤技术和生物传感技术相结合的产 物。纳米光纤生物传感器是研究单细胞的尖端技术之一，它已应用于生物研究、医 学研究、环境监控等领域【】。 本论文提出了一种基于纳米光纤探针和荧光探针的传感系统。本系统可以实现 单个细胞的分析，能较大地提高探测灵敏度，提高单细胞内p h 探测的精度。同时 提出了一种不须将纳米光纤探针插入细胞便可探测细胞内p h 的方法。该方法相对 简化了实验操作，减少了人为误差，提高了实验数据的准确性。我们的工作为单个 细胞内生物化学物质的定性定量检测，特别是为单个细胞内微量检测提供了一些参 考。 1 2 纳米光纤生物传感器研究进展 生物传感器是感应生物量并将其转换成可用输出信号的传感器。它是生物活性 材料( 酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、生物膜等) 与物理化学换能器交叉学科的 产物， 是发展生物技术必不可少的检测与监控技术。 纳米生物传感器研究起源于2 0 世纪6 0 年代，1 9 6 2 年c l a r k 等最先提出酶电极 的设想，他们把酶溶液夹在两层透析膜之间形成薄的液层，再将透析膜紧贴在p h 电极、氧电极或电导电极上，制成了初级的酶电极用于检测液层中的反应。1 9 9 6 年 u p d i k e 等把葡萄糖氧化酶( g o d ) 固定化膜和氧电极组装在一起，构成一种“酶电 极 ，用于分析生物和化学样品，并获得较理想的结果。这样利用葡萄糖酶电极制 成了世界上最早的生物传感器。 福建师范人学硕十学位论文 19 9 2 年t a n 等1 2 j j 创建了一种近场光学显微镜和近场光学传感器的新技术，它属 于纳米光纤荧光生物传感器。将一束激光通过一个1 5 0 的小孔，然后把光聚焦在光 学显微镜上的物体中，以实现高达纳米级的分辨率。他们将氩离子激光用一个高精 度光纤耦合器耦合进5 0 - 5 0 0n r l l 的单模光纤，其尖端被拉成纳米级并在端点固定上 分子识别物质，再通过微操作器将此传感器直接插入置于o l y m p u s 倒置荧光显微镜 台上培养皿中的活细胞内，通过c c d 检测器或者a p d 检测器进行相关成分的在位 活体检测。 1 9 9 8 年，v o d i n h 等【4 】制造出第一种以抗体为基础的纳米光纤免疫生物传感器。 他们首先用光纤拉制仪制成直径1 0 1 0 0i 珊的石英光纤，然后将光纤头部硅烷化， 并用b p t 的抗体修饰光纤头部，随后将光纤全长( 修饰的光纤头部除外) 镀银以防 止光漏出，最后在单细胞操作的显微操纵仪显微注射器上进行细胞穿刺及检测实 验，用光电倍增管记录b p t 与抗体结合后产生的荧光，通过测定荧光强度的变化 检测细胞内b p t 的含量。 2 0 0 0 年，v o d i n 等1 5 】采用熔拉法与真空蒸发镀膜技术制出用来检测b p t 的抗 体纳米光纤生物传感器，其纳米探针是一根直径为5 0n l t t ，外面包银的光纤，并传 导一束氦一镉激光。其尖部贴有可识别和结合b p t 的单克隆抗体。3 2 5n l t l 波长的激 光激发抗体和b p t 所形成的分子复合物产生荧光，荧光进入探针光纤，再由光探测 器接收。这种高选择性和高灵敏度的纳米传感器能用于探测多种细胞内物质，可以 监控活细胞的蛋白和其它所感兴趣的生物化学物质。 2 0 0 4 年v o d i n 等f 6 3 用纳米光纤生物传感器探测到了细胞传递信号的生物化学 成分：a p o p t o s i s 。a p o p t o s i s 是有机体抵抗疾病( 如癌症) 的主要成分。这个预设好 的细胞死亡机制是通过在疾病细胞复制前使细胞自我破坏来达到阻止疾病传入有机 体。当身体的某个细胞受到毒素或炎症的攻击而遭到破坏，它会杀死自己。这是制 止很多疾病细胞( 如癌症) 繁殖的原始方法。他们在单个活体细胞内发现了a p o p t o s i s 的存在。a p o p t o s i s 触发主体产生了一种c a s p a s e s 的“说谎 酶。他们在癌症细胞中 引入一种光激活抗癌药物，然后插入针尖附有b i o m a k e r ( 生物标志化合物，用来针 对c a s p a s e s 9 ) 的纳米光纤探针。c a s p a s e s 9 的存在导致b i o m a k e 从纳米生物传感器 的针尖上分裂。b i o m a k e 的荧光强度变化反映了光激活抗癌药物已经触发了“细胞 死亡”机构。 最近，v o d i n 等开发了纳米光纤生物传感器在单细胞内检测的新技术，在接近 2 第l 章绪论 活体细胞的分子作用上又进了一步。 1 3 单细胞分析的研究进展及重要意义 细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单位。为了掌握生命过程的规律，必 须以研究细胞为基础，深入探索细胞的行为。长期以来由于检测方法的灵敏度不够， 只能进行细胞群体分析，从中获得细胞中的化学信息。通过细胞群体分析获得的统 计平均结果，掩盖了单个细胞之间的差异，使生物学及医学等很多领域的发展受到 限制。众所周知，医学上早期诊断癌症，将会挽救无数人的生命。目前诊断癌症往 往依赖于生物组织出现肿瘤，但这时通常已是癌症晚期。若在细胞水平发现癌细胞， 进行早期治疗，将使癌症不再成为不治之症。 单细胞分析是分析化学、生物学和医学之间渗透发展形成的跨学科前沿领域。 进行单细胞分析研究就是进行细胞的生长与分化、代谢与繁殖、运动与联络、衰老 与死亡、遗传与进化等生命过程中的分析化学研究。且目前细胞研究已经从细胞整 体( 单细胞) 深入到亚细胞( 局部细胞质、细胞膜、囊泡) 和分子水平( d n a 等生物大分 子及单分子) 。因此，单细胞分析向分析化学提出了严峻的挑战，也带来众多机遇。 现今国内外细胞分析普遍采用榨取细胞液的方法，然后分析分离出来的物质， 以此来表征细胞的一些特性。显然，这种分析方法在细胞被分析以前就接近死亡了， 更是不能做到“监测”，也就不能研究活的、自然状态或自然环境下的细胞的整个 生理活动过程。而纳米光纤生物传感器则可以实现单个细胞的活体无损在线监测。 基于纳米光纤探针和荧光素探针，我们搭建了适合单细胞分析的实验平台。实 验中使用同一根纳米光纤探针来传递激发光和收集荧光，不需插入细胞，更不需在 纳米光纤头共价连接生物活性物质，而只需移动纳米光纤就可以方便地探测到单个 细胞的荧光，进而可以探测单个细胞内的p h 值。 1 4 本论文完成的工作 本论文依托福建省闽江学者专项基金( 2 0 0 5 2 0 0 8 ) ，教育部科学技术研究重点 项目( 2 0 6 0 7 0 ) 一新型分布式光纤温度传感器的研究。在导师的指导下，我协作完 成了这套仪器的搭建。主要工作涉及仪器的购买和搭建，特别是采集模块的硬件搭 建、基于l a b v i e w 采集程序的编写、整套系统的调试。系统主要包括倒置荧光显微 镜、单光子计数器、滤波器和1 0 0p s 数据采集卡等。这套基于纳米光纤探针和荧光 探针的传感系统，可以实现单个细胞的分析。此外我们提出的测量单个细胞荧光强 福建师范人学硕十学位论文 度的方法能较大地提高探测灵敏度，提高单细胞内p h 探测精度。该方法以纳米光 纤的移动代替传统的离心方法，相对简化了实验操作，大大减少了误差，提高了实 验数据的准确性。为单个细胞内生物化学物质的定性定量检测，特别是微量检测提 供了可能的途径。本论文主要包括如下几个方面内容： 第一章概述了纳米光纤生物传感器及单细胞分析的进展。 第二章深入分析纳米光纤生物传感技术及单细胞分析技术的方法及其优缺点。 提出并搭建了适合单细胞分析的纳米光纤生物传感系统，编写了采集程序，并进行 了系统调试。 第三章介绍纳米光纤生物传感系统中涉及的关键技术，纳米光纤探针的制备， 并利用氢气熔拉，化学腐蚀法制备了纳米探针，并使用电镜进行了表征。 第四章介绍一种基于荧光探针和纳米光纤探针的单个细胞胞内p h 值测量的方 法。以纳米光纤的移动代替传统的离心方法，相对简化了实验操作，大大减少了误 差，提高了实验数据的准确性。并分析了这种方法的优缺点。 第五章基于提出的单细胞分析的方法，进行了细胞外p h 值对细胞内p h 值的影 响实验。实验表明没有基因敲除的细胞维持胞内p h 的能力较基因敲除的细胞强。 本论文的新颖之处在于：( 1 ) 提出并搭建了一套集光机电体的单细胞传感分 析系统。这套系统主要包括倒置荧光显微镜、单光子计数器、滤波器、1 0 0p s 采集 卡等。该系统融合了纳米光纤传感技术和单细胞分析技术的优点，能实现单个细胞 的分析，且系统稳定，灵敏度较高。( 2 ) 利用光纤拉制仪，使用氢气火焰熔融一化 学腐蚀修正法自制了纳米光纤探针。并在不同加热温度、拉伸速度、拉伸距离等参 数条件下进行了拉制实验。使用电镜对这些探针进行了表征。对比这些不同参数条 件下拉制得到的纳米光纤探针，我们找到了一些提高拉制成功率的实验参数。 ( 3 ) 基于纳米光纤探针和荧光素探针，使用荧光强度比值法测量了单个细胞胞内的p h 值。实验中使用同一根纳米光纤探针激发和收集荧光，以纳米光纤的移动代替传统 的离心方法，相对简化了实验操作，大大降低了荧光素的泄露，提高了实验数据的 准确性。( 4 ) 基于提出的单细胞分析的方法，进行了细胞外p h 值对细胞内p h 值 的影响实验。实验表明没有基因敲除的细胞维持胞内p h 的能力较基因敲除的细胞 强。这种差别在细胞外p h 大于9 5 的时候更加突出。 第2 章纳米光纤传感技术及单细胞分析技术 第2 章纳米光纤传感技术及单细胞分析技术 2 1引言 细胞是人体的基本组成元件，人体所有病理过程的发生、发展、好转或恶化都 能在相应细胞成分和结构的变化中得到反映。所以研究单个细胞对于疾病的早期诊 断、病程监测、疾病预后等均有重要意义。传统的生物传感器体积较大，这使得他 的使用范围受到限，如只能用于组织、细胞悬液等的测量。当检测样品的尺寸缩小 到微米级时，如检测活细胞或其它亚细胞组分时，实时、准确、无干扰地测量样品 内化学和自然成分变得极为困难。随着新技术、新工艺的发展，制造纳米光纤探针 和纳米敏感材料的技术逐步成熟，运用纳米光纤探针和纳米级的识别元件检测微环 境中的生物、化学物质成为可能。基于纳米光纤的传感系统，是生物传感技术领域 最近迅猛发展起来的。它是研究单细胞最基本的技术。它具有体积小、能在细胞内 实时测量、对细胞无损伤或微损伤等诸多特点。 本章首先回顾了纳米光纤传感技术和单细胞分析技术的进展，然后提出并搭建 了基于纳米光纤传感技术的单细胞分析实验平台。采用l a b v i e w ( g 语言) 编写了采 集、处理程序，并对整个系统进行了调试。 2 2 纳米光纤传感技术 纳米光纤生物传感器的应用与进展随着纳米光纤探针和纳米敏感材料技术逐 步成熟，用纳米光纤探针和纳米级的识别元件检测微环境中的生物、化学物质已成 为现实。纳米光纤生物传感器在单细胞内的检测和监控技术发展非常迅速。 纳米光纤生物传感器是近场光学原理的具体应用：激光经过光纤( 探针尖端固 定有敏感试剂送入调制区，使被测物质与试剂发生相互作用，引起光的强度、长、 频率、相位、偏振态等光学特性发生变化，被调制的信号光经过光纤送入纳米传感 器转化为电信号再通过信号处理装置，最终获得待分析物的信息。 2 2 1 纳米光纤生物传感技术 所谓生物传感器( b i o s e n s o r ) ，简单地说，是指利用生物功能物质作为敏感元 件探测器，将探测器上的所产生的物理量、化学量的变化，通过热电、压电、光电 等转换元件转换成电信号输出的传感器【7 1 。与化学分析法相比具有很多优越的特性： ( 1 ) 对被测物理量有极好的选择性，躁声低；( 2 ) 操作简单，需用样品少，能直 福建师范人学硕十学位论文 接完成测量；( 3 ) 经固化处理以后，能长期保持其活性； ( 4 ) 能在短时间内完成 测定： ( 5 ) 不要求样品具有光学透明度；( 6 ) 信息是以电信号方式直接输出，容 易实现自动化。 生物传感器主要有两元件：一个是分子识别元件或称感受器，由具有分子识别 能力的生物活性物质构成；另个是信号换能器，是一个电化学或光学转换元件。 当分子识别元件与底物( 待测物) 特异结合后，所产生的复合物( 或光、热等) 通过信号 转换器转变为可以输出的电信号、光信号，从而达到分析检测的目的。生物传感器 是基于电化学或光学传感的原理，原则上可分为电化学式和光学式两大类。其中电 化学式包括电位式、电流式和电导式；光学式包括吸光式、反光式和发光式【引。 光纤传感器在分析化学、生物学、生理学和药理学领域中，有十分广泛的应用 【9 】在很多方面具有电子传感器无法比拟的优点，但是，尺寸和响应时间是阻碍 其应用拓展的主要障碍，为了克服这一缺陷，人们进行了许多尝试。1 9 9 2 年， k o p e l m a n 和他的同事们首先研制成功了亚微米光纤p h 传感器，这种传感器结合了 纳米制造技术和近场技术。使传感器的体积缩小了一千倍，样品用量减少到干分之 一，同时，响应时间至少缩短至百分之一。从那以后，就有不同的纳米光纤传感器 用于p h 值、离子浓度测量的报道。 2 2 1 1 生物探针的纳米光纤传感器 这种生物传感器的探针结合的敏感膜不是p h 染料，而是在探针表面交联了抗 体或酶。由于生物实体的特异性极高，所以它具有很好的选择性，对活细胞几乎没 有损害。1 9 9 6 年，v o d i n h 第一个报道了一种抗体基础的纳米生物传感器，该传感 器用于探测四醇苯并芘( b p t ) 。通过三个步骤来制作这种生物传感器：首先，用拉 伸法制备纳米光纤并在基上沉积一层厚约为1 0 0n t n 的银膜，优化光纤的传导。t i 工t 4 - 台日匕e , 之后，将光纤硅烷化；制作一个抗体的结台点，抗体通过共价键连接于光纤上。将 光纤深入单个细胞中，抗体与相应的抗原产生反应，游离出荧光素，在激光的激发 下，荧光素产生荧光。探测这个荧光信号，可以得到细胞内的信息。 2 2 1 2 纳米光纤免疫传感器 免疫传感器是指用于检测抗原抗体反应的传感器，根据标记与否可分为直接免 疫传感器和间接免疫传感器；根据换能器种类的不同，又可分为电化学免疫传感器、 光学免疫传感器、质量测量式免疫传感器、热量测量式免疫传感器等。光学免疫传 第2 章纳米光纤传感技术及单细胞分析技术 感器是将光学与光子学技术应用于免疫法，利用抗原抗体特异性结合的性质，将感 受到的抗原量或抗体量转换成可用光学输出信号的一类传感器，这类传感器将传统 的免疫测试法与光学、生物传感技术的优点集为一身，使其鉴定物质具有很高的特 异性、敏感性和稳定性。而纳米光纤免疫传感器是在其基础上将敏感部制成纳米级， 既保留了光学免疫传感器的诸多优点，又使之能适用于单个细胞的测量。d i n h 等人 成功地研制出一种用于检测b p t ( b e n z o a p y r e n et e t r o l ，是一种与暴露于致癌物 f , a 嘲m r h m 1 1 l ! l e f 图2 - 1 用纳米光纤传感器检测单个细胞的实验平台 f i g 2 - 1n a n o - f i b e ro p t i c a le x p e r i m e n t a lp l a t f o r mf o ras i n g l ec e l la n a l y s i s 质相关的d n a 损伤的生物标志物) 的纳米光纤免疫传感器，如图2 1 。传感器头部 的生物探针上结合了特异性单克隆抗体，通过抗原抗体特异性结合，能够检测单个 细胞内的生物化学物质1 5 】。制造这样的传感器大致需要三步：首先，他们用光纤拉 制仪将石英光纤拉得极为细小( 1 0 1 0 0n m ) ，然后将光纤头部硅烷化，目的是为抗 体产生黏附位点。将特异性识别并结合b p t 的抗体结合到光纤头部。随后光纤全长 ( 结合了特异性抗体的光纤头部除外) 镀银以防止光漏出。纳米传感器制好后，在专 用于单细胞操作的显微操纵仪显微注射器上进行细胞穿刺及检测实验，见图2 2 。 实验过程中使用细胞培养箱控制操纵台温度，使其保持在实验细胞所需3 7 。c ， 使用光电倍增管记录b p t 与抗体结合后产生的荧光。实验者将传感器固定在三维操 纵杆上，在亮视野、放大系数4 0 0 的条件下，移动传感器探头至细胞外穿刺部位。 此时关闭实验室和显微镜上的光源，打开氦一镉激光光源( 3 2 5n l i l ) 后读数。关闭激 光光源，将探针小心地刺人细胞，针尖停留于细胞质中，激光将激发抗体和b p t 所 福建师范大学硕士学位论文 形成的分子复合物产生荧光，此荧光进人探针光纤后，由光探测器接收( 见图2 1 ) ， 通过测定光强度的变化检测细胞内b p t 的量。 ( a ) 纳米光纤刺入细胞前( b ) 纳米光纤刺入细胞 图2 - 2 一根纳米光纤探针携带一束激光刺入一个活细胞( a ) 纳米光纤刺入细胞前；( b ) 纳米 光纤刺入细胞。 f i g 2 - 2aa s _ r i o p r o b ec a r r y i n gal a s e rb e a mp e n e t r a t e sal i v i n gc e l l ；( a ) n a n o - f i b e rp r o b ew a sj u s t o u t s i d et h ec e l l ；( b ) n a n o - f i b e rp r o b ew a si n s e r t e di n t ot h ec e l l 2 2 1 3 纳米光纤荧光传感器 纳米光纤荧光传感器是发展最快的一类纳米光纤传感器。一些蛋白质类生物物 质自身能发荧光，另一些本身不能发荧光的生物物质，可以通过标记或修饰使其发 荧光；基于此，可构成将感受的生物物质的量转换成可用于输出信号的荧光生物传 感器。荧光生物传感器测量的荧光信号可以是荧光猝灭，也可以是荧光增强，t 可测 量荧光寿命，也可以测量荧光能量转移【l o l 。 k o p e l m a n 在1 9 9 2 年最早构建并使用了基于荧光法的纳米光纤传感q 器1 2 , 3 】，用于 检测微环境中的p h 值。其工作原理是在光纤头部固定荧光剂，荧光剂与质子发生 可逆反应时，引起试剂相光学性质的变化，光变信号由光纤传输，测定荧光强度的 变化，以检测p h 值。k o p e l m a n 用光纤拉制仪将光纤拉制成头部直径为1 0 0 10 0 0n m 的光纤探针，然后用真空蒸发器在光纤表面镀上铝以防止光在传输过程中外泄。铝 光纤在表面沉积时，操作中一定要确保铝不能沉积在光纤头部，使光纤头部能够结 合荧光剂或受体分子。镀铝完成后，将暴露的光纤头部硅烷化。硅烷化的作用是使 光极形成含羟基或氨基的活性表面，再直接进行抗原或抗体的固定或使用双功能交 联剂( 如戊二醛等) 连接识别分子。随后在光纤头部结合上一种p h 选择性荧光染料聚 合物。纳米传感器制好后，测定样品液检测传感器性能( 包括检测范围、响应时间、 使用寿命、稳定性等) 该纳米传感器响应时间为3 0 0m s ，比传统的光纤传感器响应时 莹 第2 章纳米光纤传感技术及单细胞分析技术 间缩短l 以上，p h 浓度检测下限低于传统传感器六个数量级。这些特性使之适宜 于对单个细胞和亚细胞结构的检测。 纳米光纤荧光生物传感器具有荧光分析特异性强，敏感度高等优点，而且无需 用参比电极，使用简便、体积微小等诸多优点，具有广泛的应用前景。 单细胞体积微小，细胞内化学成分复杂，大多组分结构相似，而且含量极微， 所以单细胞分析需要高效率分离和高灵敏检测的分析方法。荧光及其有关技术，如 激光诱导荧光检测、荧光相关光谱和荧光偏振等显得日益重要，获得飞速发展。特 别是激光诱导的荧光检测的高灵敏度，在单细胞分析和单分子检测中，以及在分子 生物学及细胞生物学研究中成为了注目的焦点。 荧光检测所采用的荧光团，分为天然的荧光和标记荧光。蛋白质分子的天然荧 光主要来自色氨酸和酪氨酸残基荧光团，荧光发射波长分别为3 4 0n l t l ( 在蛋白质中 为3 3 3n m ) 和3 0 3n l t l ，量子产率均为o 2 。采用不同的荧光方法、技术和先进的仪 器，研究分析生物大分子本身所具有的荧光团( 内源荧光) 和标记的外源荧光，可 以获得大分子结构、功能、相互作用等信息。从爱滋病毒检测到人类基因组测序， 从蛋白质溶液构象到细胞内部组分的活动研究，都用到荧光探针，如利用色氨酸做 内源荧光探针，研究蛋白质溶液构象、结构、功能。利用天然荧光，激光诱导荧光 检测了血红蛋白中的血红蛋白变异体和胰腺细胞中的胰岛素。但是具有天然荧光的 物质较少，能用于灵敏检测的天然荧光更少。需要对细胞中被测组分通过化学反应 标记上荧光团，由此可能高灵敏度检测。因此荧光探针和荧光试剂起到关键作用。 有的荧光探针或标记试剂自身无荧光，而标记反应产物有较强的荧光，称为荧光生 成试剂。有的标记试剂本身带有较强的荧光团，标记产物的荧光是由标记试剂的荧 光团产生，如丹磺酰氯，荧光素异硫氰酸脂( f i t c ) ，m b b r 等就是荧光标记试剂。 2 3 单细胞分析技术 细胞是生物体的基本结构和功能单位。生命运动都在细胞内实现，如：细胞的 新陈代谢、呼吸作用、光合作用等都与细胞的整体状态有关。对单个细胞的研究不 仅有利于解释细胞及生物体的生理活动，而且有利于阐明各种疾病( 如癌症) 的发病 与治疗机理。由于受取样技术及检测灵敏度的限制，细胞化学成分的常规分析方法 一般以大量细胞为研究对象，用平均结果反映单个细胞的化学信息。然而，由于生 物组织中各种化学成分分布及细胞本身的高度不均匀性，大量细胞分析常常得出不 准确甚至错误的结论。因此直接分析单个细胞的化学成分十分重要，主要体现在( 1 ) 9 福建师范大学硕士学位论文 揭示不同细胞在化学组成、生理响应等方面的差异性，进而有助于解释细胞的些 生理现象。( 2 ) 有利于疾病的早期诊断。在发病期，仅有极少量细胞发生病变，如 果采用大量细胞同时分析，微弱的致病信号就会被来源于大量正常细胞的平均信号 完全掩盖，只有逐一分析单个细胞，才有发现极少量病变细胞的可能性。( 3 ) 有利 于药物设计及疾病的合理治疗。不论是j 下常细胞和病变细胞之间，还是病变组织内 部各个病变细胞之间，在药物吸收、释放、分布、代谢等方面都可能存在很大差异， 准确、客观地揭示这种差异对设计靶向药物、靶向药物剂型以及个性化药物治疗方 案都是非常有利的。 所以单个细胞水平的研究，可以获得反映细胞生理状态和过程的更准确、更全 面的信息，还可以便人们能更好地了解细胞群体中某些特殊的细胞功能，更深入地 认识细胞个体差异、细胞间相互作用和信息传递以及神经递质、药物或毒物刺激的 生理影响等更深层次的信息。因此，单细胞分析具有重大而深远的意义。 2 3 1 常见的单细胞分析法 2 0 世纪8 0 年代毛细管电泳单细胞分析技术的发展，加快了单细胞分析发展， 目前单细胞分析已经成为2 1 世纪分析化学前沿的热点课题。而近几年，随着新技术 的诞生和各种仪器的改进和完善，单细胞的分析手段日新月异，己有多种技术用于 单细胞分析。常见的方法f i l 】有毛细管电泳( c e ) 分离方法、荧光图象技术、伏安微电 极法、毛细管电泳、微流控芯片、细胞影像分析、光电显微技术、微型玻管电极法、 微型薄层色谱法等方法。下面主要介绍毛细管电泳分析法、色谱分析法、微电极分 析法、显微分析法等。 2 3 1 1 毛细管电泳分析分类 毛细管电泳技术因为其突出的特点：所需样品量少、仪器简单、操作简便；分 析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高；操作模式多，开发分析方法容易； 实验成本低，消耗少；应用范围极广等已经发展成为单细胞分析的主要工具。它是 以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度 和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。胡深等f 眩】采用组装的毛细管 电泳微电极安培检测系统对鼠单个交感神经细胞进行了分析，对鼠单个突感神经 细胞中儿茶酚胺类神经递质去甲肾上腺素附e ) 和肾上腺素( e ) 的检测限分别达5 7 8 1 1 1 0 1 和5 9a m o l ：c h r i s t o p h e 等【1 3 1 利用激光微柱相结合的方法对单细胞进行分析，采 1 0 第2 章纳米光纤传感技术及单细胞分析技术 用这种方法可测量到在毫秒到秒时间内发生改变的细胞内分子的浓度，例如细胞酶 的基质等。y e u n g 等【1 4 】提出将毛细管电泳与激光诱导荧光检测方法相结合，来测量 单个肾上腺髓质细胞中的儿茶酚胺含量该方法在较低p h 值条件下具有高灵敏度( 检 测下限为1 0 母m 0 1 ) 。 2 3 1 2 色谱分析法 色谱分析法【1 5 】是基于混合物各组分在体系中两相的物理化学性能差异( 如吸附、 分配差异等) 而进行分离和分析的方法。作为一种分折方法，其最大特点在于能将 一个复杂的混合物分离为各个有关的组成，然后一个个地捡测出来。宋玲等【l6 】用高 效液相色谱一电化学检测法研究了原代培养大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞分泌的儿茶酚 胺，结果表明，在静息状态下，细胞在2 0m i n 内分泌的儿茶酚胺为每1 0 6 个细咆( 7 3 2 9 1 5 3 2 ) n g ，用乙酰胆碱等药物刺激后儿荼酚胺的分泌量明显增加；徐修容7 j 用高 效液相色谱一电化学检测法测定帕金森症患猴脑组织中的多巴胺( d a ) 和其代谢产 物，并观察了抗帕金森症药物对其含量的影响结果表明患有帕金森氏症猴脑尾状 核中d a 、d o p a c 和h v a 的含量同对照相比都下降9 0 以上，如给肌抗帕金森症 药物，可使脑内d a 水平下降程度减轻或保持正常水平。 2 3 1 3 微电极分析法 t a y l o r 等【1 8 采用碳纤维微电极和安培检测法测定了鼠的嗜铬细胞瘤( p c i 2 ) 细胞 在严重低氧条件下释放儿茶酚胺的情况。在正常情况下，将细胞浸入【k + 为5 1 0 弓 m o l l 溶液中时，没有任何分泌；而当 k + 为1 0 1 0 弓 - 一，1