（光学工程专业论文）显微图像处理和三维图像重构的研究.pdf

硕士学位论文 显微图象处理及其三维重构的研究 摘要 塑堂基基塑造星徵覆统( l c s m ) 是以激光共焦扫描显微镜为核心的现代显微 成像仪器，计算机图像处理和三维重构是系统中的重要部分。本文就是以l c s m 系统为研究对象，针对于显微图像处理及其三维信息重构这。课题进行研究和 讨论的。 文中首先简要地介绍了国内外l c s m 系统的发展现状，分析了激光共焦扫 描原理和l c s m 系统的成像特性。其次，论述了有关数字图像处理的基本理论 及国内外最新成果，提出了一些关于激光共焦扫描显微图像处理的方法，形成 了较为完善的l c s m 系统图像处理技术。第三，讨论了关于三维图像重构的理 论，建立了激光共焦扫描显微系统的三维信息再现方法。第四，探讨了三维图 像的基本变换，研究了三维图像的数学形态学处理。最后，编写了一套l c s m 系统图像处理和三维重构软件程序，用于l c s m 系统的图像采集、处理和三维 重构等方面的研究。 ( 总之，本文结合激光共焦扫描显微图像，对显微图像的二维处理及其三维 信息重构进行了系统的研究，形成了较为完整的l c s m 系统图像处理和三维重 构的方法和理论，并实际应用到我们研究的l c s m 系统中，取得了良好的处理 结聚。卜一= r 一，。、 关键字：l c s m 系统共焦原理。显微成镣图像处癌三维重构数学形态学 、；iv、 子波变换v 里生! 些堕兰一 里燮堕墨竺翌墨茎三丝重塑堕型塞 a b s t r a c t t h el a s e rc o n f o c a l s c a n n i n gm i c r o s c o p i c ( l c s m ) s y s t e mi sak i n do fm o d e m m i c r o s c o p i ci n s t r u m e n ti nw h i c h ac o n f o c a lm i c r o s c o p ei si t sk e y p a r t ，a n dc o m p u t e r i m a g ep r o c e s s i n gi s a l s ot h ei m p o r t a n tp a r to fi t t h i s p a p e ra i ma tt h es u b j e c to f m i c r o s c o p i ci m a g ep r o c e s s i n ga n dt h r e e d i m e n s i o nr e c o n s t r u c t i o no fi m a g e so b m i n e d b y t h el c s m s y s t e m f i r s t , t h ep r e s e n td e v e l o p i n gs i t u a t i o no ft h el c s ms y s t e mi nd o m e s t i ca n d a b o a r di ss u m m a r i z e d t h el a s e rc o n f o c a l p r i n c i p l e a n dl c s ms y s t e m i m a g i n g c h a r a c t e r i s t i c sa r ea n a l y z e d t h e nt h et h e o r i e sa n d 叩一t o d a t ea c h i e v e m e n t sa b o u tt h e i m a g ep r o c e s s i n ga r ed i s c u s s e d ，a n ds o m ei m a g ep r o c e s s i n gt e c h n o l o g i e sa b o u tt h e l c s m s y s t e ma n dt h ei n t e g r a t e dp r o c e s s i n gm e t h o d so fl c s ms y s t e mi m a g e sa r e d e s c r i b e d t h et h i r d ，t h et h e o r i e sa n dm e t h o d so ft h et h r e e d i m e n s i o nr e c o n s t r u c t i o n a b o u tl c s m s y s t e m i m a g e s a r ec o n s i d e r e d t h ef o u r t h ，t h eb a s i ct r a n s f o r m so ft h r e e d i m e n s i o ni m a g e sa n dt h et h r e e d i m e n s i o ni m a g ep r o c e s s i n gw i t ht h em a t h e m a t i c s m o r p h o l o g y a r ed i s c u s s e d f i n a l l y , as e to fs o f t w a r et oc o l l e c ta n d p r o c e s st h el c s m s y s t e mi m a g e s a n dr e c o n s t r u c tt h r e e - d i m e n s i o ni m a g e si sd e s i g n e d i naw o r d ，t h ep a p e rd i s c u s s e st h em i c r o s c o p i ci m a g ep r o c e s s i n gm e t h o d sa n d t h r e e d i m e n s i o n i m a g e r e c o n s t r u c t i o nf o r t h el c s mi m a g e s i m a g ep r o c e s s i n g m e t h o d sa n dt h r e e d i m e n s i o nr e c o n s t r u c t i o nt h e o r i e so ft h el c s ms y s t e mh a v eb e e n u s e di nt h el c s ms y s t e md e s i g n e db yu s t h er e s u l t sa r et h a ti m a g eq u a l i t y i s i m p r o v e dg r e a t l ya n dt h e3 - di m a g e sr e c o n s t r u c t e df o ro b j e c t su n d e rt h et e s t h a v e b e e nt og o o d k e y w o r d s ：t h el c s ms y s t e m ，c o n f o c a l p r i n c i p l e ，m i c r o s c o p i c i m a g e ，i m a g e p r o c e s s i n g ，t h r e e - d i m e n s i o n r e c o n s t r u c t i o n , m a t h e m a t i c sm o r p h o l o g y , w a v e l e tt r a n s f o r m - i i - 堡堂型l 堑丝 1 绪论 1 1 选题背景 随着科学技术的发展，科学研究从宏观世界进入微观世界，这种发展迫切 地需要研究微观领域的现代化科学仪器设备，特别是在获得微观领域的三维信 息方面更为迫切。基于这种需求，科研人员近几年成功地研究出激光共焦扫描 显微系统( l c s m ) ，目前主要应用于生物医学研究领域。 激光共焦扫描显微系统是以光学为基础，融机械、电子、计算机为一体的 用于科研的高精度现代化显微测试系统。作为现代化仪器设备，它无论在成像 机理、系统结构、还是在数字图像处理等方面，都采用了近年来发展起来的多 种高新技术。与传统的光学显微镜相比，它既具有一般光学显微镜较高的横向 ( 平面) 分辨率，又克服了普通显微镜观察景深小的缺陷，达到了较高的纵向 ( 纵深方向) 分辨率。结构上，在其探测器的前面增加了一个小孔空间滤波器， 正是由于结构上的这个特点，使得其能抑制共焦点以外的光线进入到探测器的 感光面上，从而提高了系统的分辨率和灵敏度。在成像机理上，扫描显微镜不 象普通显微镜那样，将整幅图像同时成像于像面上，而是通过扫描光束与样品 之间相对运动，使样品位于显微镜焦面上的点与像面上的点建立起一一对应的 映射关系，这种成像方式使得光学显微观察易于数字化，便于计算机进行处霉。 l c s m 系统不仅体现了当代商新技术的发展，而且在许多科究领域中栉有+ 9 着重大的现实意义，特别是在生物医学方面起到了划时代的作用。以往，科研 人员研究生物组织或样品大部分是将其割开、切片，用普通显微镜观察，这样， 不可避免地造成一系列问题，如：样品在切片过程中由于变形而破坏了原有结 构，测量不准、位置错位等，此外，切制过程极为耗时，而且有些样品是不能 切割的，而l c s m 系统的出现则避免了这一系列问题。l c s m 系统最突出的优 越之处是克服了普通光学显微镜在观察三维结构时受到的限黼；它可以将一系 列二维断层图片通过计算机合成为三维立体图像，得到良好的三维观察效果。 在观察生物细胞接受各种药物处理的反应对，l c s m 系统也起到了极为重要的 作用，在计算机控制下，l c s m 系统可以每间隔一定时间记录下细胞图像，从 而使得工作人员可以在实验后从容地观察和研究细胞受药物作用后的变化情 硕上学位论文 绪论 况。 1 9 5 1 年，r o b e r t s 和y o u n g l l 最早提出了扫描显微镜。此后，紫外光源的使 用和激光的发明，对扫描显微镜的发展起了很大的推进作用。1 9 6 1 年明斯基 m m i n s k y 2 l 【3 l 首次在扫描显微镜的基础上提出了共焦扫描光学显微镜的概念，认 识到共焦显微镜具有的纵深分辨性，并于当年申请了专利。之后有许多文献报 道了该系统在理论与实践方面的研究工作。特别是在8 0 年代耒和9 0 年代初， 它引起了人们的高度重视，美国、日本、英国、德国都投入了大量的人力和财 力进行研究，试制激光共焦扫描显微镜，经过近十年的努力，无论是在原理上 还是在图像质量上，都取得了巨大的发展。实践上，现国外有正式产品投入市 场。如美国m e r i d i a n 公司制造的用于遗传工程研究的大功率l c s m 系统， 价格为5 0 万美元；德国l e i c a 公司生产的t s 4 d 型l c s m ，价格为3 0 万美元； 德国c a i s i 公司生产的o p t o n - - l s m 型l c s m ，价格为2 5 万美元以上。这些 公司的产品设备档次高，系统庞大，对我国大多数的科研和应用单位价格过于 昂贵，无力购买，目前，国内仅有上海医科大学、中科院生命科学中心、广州 第一军医大学等几家国家重点科研单位购买了国外的l c s m 系统。 国内激光共焦扫描显微系统的研究较晚，主要原因在于该系统融合了光、 机、电、计算机等众多领域的高新技术，系统的性能与这些技术的应用和发展 有着密切的关系。其次是因为科研经费缺乏。目前国内有少数几家科研机构在 着手研究。我们于1 9 8 7 年向国家自然科学基金委员会申请了项目“高分辨率大 纵源光学显微图像处理技术”，并在1 9 8 8 年开始立项研究。经过近十年的努力， 系统在光学、电予、机械等方面取得了不断进展，课题就是在这种情况下产生 并开始进行研究的。 由于激光共焦扫描显微系统属于九十年代研制的高科技产品，技术保密性 强，加之国内起步较晚，因此，有关激光共焦扫描显微图像处理的资料较少。 但由于l c s m 系统形成的标本断层图像类似于c t 、核磁共振、x 射线层析仪 等医学仪器所形成的图像，因此，我们在进行讨论研究时参阅了相关领域的文 献资料。通过两年多的努力，形成了一套关于l c s m 系统的图像处理和重构理 论方法，基本完成了l c s m 系统的图像处理和其三维信息的重构，完善了我们 研究的激光共焦扫描系统，为尽快推出国产激光共焦扫描显微系统作出了自己 的一点贡献。图1 1 为我们研制的激光共焦扫描显微系统的外形照片。 ，2 皇里塾堡兰一 一 一 堕堡 图1 1 激光共焦扫描显微系统的岁f 形 1 2 研究概况 讨论了共焦扫描系统的基本原理，分析了l c s m 系统的成像特性。激 光共焦扫描显微镜不同于普通光学显微镜的关键在于其不仅具有较高的平面分 辨率，而且具有较高的纵向分辨率。 二在图像处理基本理论的基础上，通过对国内外十多年来有关数字图像 处理领域的文献检索，系统研究和总结了与l c s m 系统有关的图像变换、数学 形态学、子波变换等数字图像处理领域的最新理论和成果。 三结合l c s m 系统的成像特性和数字图像处理理论，讨论了关于激光共 焦扫描系统的二维断层图像处理。针对l c s m 系统图像。就数字图像的噪声去 除、图像增强、图像分割、边缘提取等提出了一些较好的处理方法，提高了图 像质量，奠定了进行三维信息重构的二维处理基础。探讨了肴关二维图像纹理 分析的理论，为科研人员进行图像研究提供了一些有效方法。 四针对l c s m 系统，通过对数字图像处理和计算机图形学的研究，提出 了关于激光共焦扫描系统三维信息蘑构的理论和方法，通过实际编程使用，证 明了方法的可行性和正确性。 五讨论了三维图像的基本变换，研究了三维图像处理的数学形态学处理 方法。 硕士学位论文绪论 六设计了l c s m 系统的软件程序，为l c s m 系统图像处理和研究提供一 个有效软件包。 硕士学位论文 激光共焦扫描短微成像系统基奉原理 2 激光共焦扫描显微成像系统基本原理 2 1 引言 激光共焦扫描系统作为九十年代的高科技仪器，是光学显微领域的重大进 展。自从m m i n s k y l 2 首次提出共焦扫描显微( c o s m ) 系统以来，许多科学工作者 对其理论做了大量的深入研究”1 ”。如t o n yw i l s o n 和c o l i ns h e p p a r d t 4 1 详细讨论 了c o s m 系统相干、非相干、和部分相干成像原理，分析了系统的像差以及平 面和纵深分辨率。t w i l s o n 和r j u s k a i t i s ；5 1 等人利用激光反射方法研究共焦显微 镜的成像特性。j o s ea n g e lc o n c h e l l o 和e r i c w h a n s e n t ”提出了c o s m 系统基于 噪声条件下的图像重构方法。在这些科研入员的努力下，激光共焦扫描显微成 像理论日趋完善和成熟。 激光共焦扫描系统的重要部分是激光共焦扫描显微镜，是基于激光共焦原 理的扫描光学显微镜。扫描光学显微镜具有普通光学显微镜所不具有的一些独 特性质。它可通过光学断层扫描来进行三维成像，具有较高的信噪比和高精度 的测量性能等。扫描光学显微成像系统，一方面通过计算机进行扫描控制，包 括扫描方向和扫描速度。另一方面，通过计算机实时采集样品扫描点信息，形 成图像并经过计算机预处理后在监视器上显示和三维再现。c j r s h e p p a r 等将 光学显微系统分为两种类型：第一类型扫描光学显微镜，它又分为两种形式， 一是扩展光源，用扫描的点探测器来探测目标成像，如图2 1 ( a ) 所示，二是扫描 点光源，用面探测器记录目标成像，如图2 1 ( b ) 所示。第二类型扫描光学显微 镜，即共焦扫描显微镜，如图2 2 所示，它也有两种形式，透射式激光共焦扫 描显微成像和散射式激光共焦扫描显微成像。 l i g h t s o u r c e ( a ) - 5 兰生竺笙堕婆- _ 一一 堂垄茎堡塑塑望塑壁堡墨堑茔查坚些 i g h ts o u r c e ol “ s p e c i m e n jl k 限7 。弋专 ， ，爿巨忑髟 ：a n n e d ( b ) 图2 1 第一类型的扫描光学显微镜 在第一类型光学扫描显微镜中，像面上的光强可以表达为 ： h e - m i ( g ，儿) 2 k j _ 。j - 。l b ( x ，朋) l 。l 。乇( t x 3 ，只一儿) 魄( 屯，乃) e x p 一竽( 石3 x 4 + y 3 y 4 ) ) 曲q 谚吩f 2 西r 4 咖4 a 3 = k e e c ( m ；p ，q ) t o ( m ，竹) 巧( 刖) e x p 2 珂【( m p ) x 。+ ( 竹一q ) y 。 d m d n d p d q( 2 1 ) 式中k 为常数，并且假定x j d 3 l ，y f f d 3 l ，且t o ( m x t ) 是被观察物体的振幅透 射率的傅立叶变换。令： 虿= 2 d 3 q ，筇= 2 d 3 ，多= 2 d 3 p ，藏= a d 3 m ( 2 ，2 ) 则： c ( m ，n ；p ，g ) = f j 只( - - x 4 , - - y 4 ) p 。( x 。+ 而，y 。+ 鬲) p ? ( x 4 + f ，y 。+ 彳) 出一砂。( 2 - 3 ) 式中p 和p ：分别为物镜和聚光镜的孔径函数。对于普通透射显微镜，像面上的 强度分布与式( 2 1 ) 相同，只是现在c ( m ，n ；p ，q ) 由下式计算： c ( m ，以；p ，g ) = f 只( x 4 y 。) p ，( 工。+ 耐，y 4 + 石) p ：( x 。+ f ，y 。+ 彳) 出一a y 4 ( 2 4 ) 式( 2 3 ) 和式( 2 4 ) 的区别仅在于孔径函数p ：的自变量符号，如果孔径函数是x 4 和 y 4 的偶函数，则c ( m ，n ；p ，砂在这两种情况下是相同的，因此，其成像性质是等价 的。因而，如果一是一个轴对称函数，该结论是成立的，显然，在大多数情况 6 硕l 学位论文 激光共焦扫描显，傲成像系统采奉原理 下。这个条件是满足的。 。 关于第二类扫描光学显微镜，是我们要详细讨论的共焦扫描显微镜，在后 面的分析中，可以看到其不仅具有很高的平面分辨率，更主要的是其具有非常 高的纵向分辨率。 o l l l 一土 il l k a n e d 口il 砸卜1 s o u r c e r r i ， s p e c i m e n 图2 2 第二类型扫描光学显微镜 2 2 激光共焦扫描显微成像原理1 1 2 1 1 1 3 1 l c s m 系统分为透射式和反射式两种。图2 3 是基于物体透射的l c s m 系 统成像原理图。 ( x 1 ，y i ) s ( x 2 ，y 2 ) d 图2 t 3 透射式l c s m 成像原理图 从点光源s 发出的光线，经系统之后成像在接收面( x 2 ，y 2 ) 上，在接收面上 放置空间滤波器d 。设( x 。，y s ) 代表被探测物体上扫描点位置，t y 0 ) 为物体透射 率函数。光源面坐标用( x 。y ) 表示，接收面坐标用( x ：，y 。) 表示，则光线经过物体 之后的光场复振幅为： u ( x o ，y o ；x 。，y ，) = h l ( x o ，y o x ( 工，一x o ，y ，- y o ) ( 2 5 ) 颀士学位论文 徽光共焦扣描显微成像系统基率原理 其中h i 佴。，u 是l ，透镜的振幅脉冲响应函数，可以表示为： 岛( ，y o ) = f 阳( 点，编) e x p 学( 毒气+ q y o ) d 孝f l r t l ( 2 6 ) 一o ；a 2 式中p ，( f 。，目。) 是l 。透镜的瞳孔函数。 经过l 。透镜，在( x 。，y 。) 接收平面上的光场复振幅分布为： u z ( b 蹦b = f u 一( x o , y o ；x s , y 如( 鲁一嵩一虬) d x o d y 。 ( 2 | 7 ) 式中m 为系统成像放大倍数。 如果空闻滤波器孔径为6 函数时，即而= 弘= o 。把式( 2 5 ) 代入式( 2 7 ) 得到通 过空间滤波器后的光场复振幅分布为： u 2 ( o ，o ；b n ) = jj h i ( x 。，y 。，( t x o , y ，一) h 2 ( - x o , 叫。) a y 。 ( 2 8 ) 其光强分布为： l ( x ，y ，) = | ff 啊( x o ，y 。y ( 工。一x o 儿一y o ) h ：( 一x 。，一，o ) 西虮1 2 ( 2 9 ) 当采用反射坐标，即h 2 ( - x o ，- y o ) = ：执) 时，式( 2 9 ) 可写成： i ，= l h l h 2 * t 1 2 但- t o ) 其中+ ”表示卷积。同样，当l ：透镜采用瞳孔函数p 。( ft ，r 。) 表示时，光 线t 描a ( x 。y 。) 经空问滤波器后探测刭的光强戈： j ( t ，y ，) = i f n ( 孙y 。y ( t 一，y ，一儿) 只( 邑，玎z ) e x p 【华鸲+ r 2 y 。) a k o d y 。d 孝2 d r h1 2 ( 2 1 1 ) 由式( 2 1 0 ) 和式( 2 1 1 ) n t 缶u ，当光源和空间滤波器孔径均为6 函数时，系统 是相干成像系统。 对于散射式l c s m 系统，其原理图为图2 4 ，同理可以推出与式( 2 1 0 ) 相同 的结果，这里不再讨论。 8 硕士学位论文 激光共焦扫描轻微成像系统摹奉原理 图2 4 散射式l c s m 系统原理图 图2 5 显示了普通扫描光学显微成像系统。由下面的推导可以进一步说明 共焦扫描显微成像系统是普通的扫描光学显微成像的一种特殊情况。 图2 5 普通光学扫描成像系统 s ( x 。，y ) 是面光源的光强分布，设面光源是非相干的。在( x ：，y z ) 接受面上放 置一空间滤波器，空间滤波器孔径函数为d ( x 2 ，y 2 ) ，则经过l ：透镜和空间滤波 器后的光强可表示为1 ： ，( ) = fffp ( 工。谛。( 一m x ，) 砰 ：一m x ) r o ，一) f ( t 一) 琏( 一x 2 m ) g ( x o 一而m ) d ( x 2 ) 如氐氐出， ( 2 1 2 ) 在特殊情况下，当物为6 ( x ；一x 。) 时，式( 2 1 2 ) 可化简为：1 硕士学位论文 激光共焦扫描显徽成像系统基本原理 i ( x ，) = j j s ( x l 溉( x 。一m x 。) a ：( z j 一胁。) 6 ( t 一矿( t 一矗) h 2 ( x o z 2 m ) e ( z ：一为m ) d ( x 2 ) d x l d x o 出j 出2 = fp ( x 。) ( t m x ，) 巧( z ：一胁；) 如( t x 2 f ) 鹾( t j 2 m ) o ( x 2 ) c k d x 2 = p ( 一) ih i ( t m x l ) i 2 d x 。 f d ( x ：) ih 2 ( x ，一心m ) 1 2d x ：) ( 2 1 3 ) 式( 2 1 0 ) 为实际的光强度分布。当： s ( x 。) = 6 ( x 1 ) ，d ( x 2 ) = 6 ( x 2 ) ( 2 1 4 ) 即考虑光源与空间滤波器均为6 函数时，将式( 2 1 4 ) 代入式( 2 1 2 ) 有： ，( x ，) = f f 肛( 墨妒( 一m x 。) 舛( x ：一m x - ) r ( t 一) f ( t 一) h 2 ( x o x 2 m ) h ：；( x o x 2 m ) 6 ( x 2 ) d r i d x o 西d x 2 = h ( ) i ( x j ) 啦；一) f ( 一x j ) ( ) h ；( x o ) d x 。出j 即l 产阻l h 2 + 砰 它与式( 2 1 0 ) 有相同的形式，是一种共焦扫描成像相干系统。由此可见， 系统只是普通光学扫描成像系统的一个特例。 为分析l c s m 系统的平面分辨率，下面我们考虑其两种特殊情况： 一在图2 3 中，如果透镜l 。、l 2 是具有相同参数的圆形透镜即： 只( 卣，彳) = b ( 最，可z ) = c i r c ( - - ) 则振幅脉冲响应函数为： 啊( ：如( ，) ：( 掣) 其中v ：2 n r a a d 是归一化坐标分量，山俐为一阶贝塞尔函数。 - 1 0 - 影m 回 d 1 s _ g q 0 硕士学位论文 激光共焦扫描显微成像系统幕本原理 考虑点物体t 瓯 y o ) = 6 ( x s - x 。y 。一y o 时，代入式( 2 1 0 ) q ，得： ，( v ) ：( 丝盟) 一( 2 1 8 ) v 此时，其强度分布如图2 ，6 中点划线所示。 二若图2 3 中的l 。是环外径为a 的薄圆环透镜，k 仍然是圆形透镜，则 有 “t ： h i ( v ) = j o ( v ) ，( v ) ：( 塾熊塑) z ， f 2 1 9 ) ( 2 2 0 ) 它的强度分布在图2 6 中为虚线所表示。 对于普通扫描光学显微镜，其强度分布如图2 6 中用实线表示。根据瑞利 判据当一个物点象的主极大和另一个物点象的第一极小相重合时，这两个物点 刚好被分辨开。因此，当采用删= 0 的第一个零点作为扫描光学显微镜的平面 分辨率本领时，根据图2 6 中的曲线求得普通扫描光学显微镜其零点v 。= 2 9 5 情况一时其零点v d = 2 9 0 ；情况二时其零点v d = 2 3 4 。由此可知，l c s m 系统比 普通扫描光学显微成像具有更高的平面分辨本领。 图2 6l c s m 系统点物体成像光强分布 2 3l c s m 系统的纵深分辨率分析【1 5 1 l c s m 系统最重要的特性是其显著的纵深分辨率，因此许多学者研究了其 硕士学位论文 激光拭焦扫描显微成像系统基本原理 纵深响应特性。图2 7 显示了由l e i c a 公司l c s m 系统采集的不同深度的细胞 断层图片。研究光学系统的纵深分辨率的方法有多种，我们可以定义纵深分辨 图2 7 不同深度的细胞断层图片 率函数如下”】： i ，( “) = lc ( 氟“) 1 2 确 0 式中u 是离焦量，光学坐标u 与实际的轴向位移量之间的关系为： “= 4 k z s i n 2 ( c t 2 1 c ( m ，n ) 是共焦传输函数，它表示为： c ( m ，“) = 日最 式中表示卷积运算，p 1 和p ：是考虑离焦因素时两个透镜的孔径函数， 射式共焦，p ，= p ：= p ，且孔径为圆形时，有： 。，n 、| e x p 三m q 2 q 1 地) 2 唧j 弘 口：1 0 v ，1 痢是归一化的空间频率，由下式给出： m 2 于是有： c ( m ，“) = e x p j “而2 2i e x p j “q 2 q a q 1 2 f 2 2 1 ) r 2 2 2 ) f 2 2 3 ) 对于反 f 2 + 2 4 ) r 2 2 5 ) 里生! 笪兰茎一一一 堂垄茎堡垫塑里堂壁堡墨堑茎查堕里 + 1 4 山r 2 。血1 生熹笋 c x p 棚z 蚴)(226)7 l 品2 鲕。”。 ” j ( u ) 函数随着离焦量u 的变化衄线如图2 8 所示。随着离焦量的增加，函数 值的确在下降，体现出其纵深分辨性。对于普通相干成像系统，由于 c ( m ，u ) _ p ( m ，u ) ，此时，j ( u ) 是一个常数，因而普通光学系统没有任何纵深分辨 性能。 jl w i 1 0 l ol ou 图2 8 共焦系统深度函数j ( u ) 随离焦量u 变化曲线图 由于函数j ( u ) 非常复杂，所以为了与横向分辨率一样确定一个共焦系统的 纵深分辨率，可以先作出j ( u ) 与u 的关系曲线，则当与两个轴向物点相对应的 两个j ( u ) 函数的叠加分布曲线的极大值和极小值之间差异为1 ：o 7 3 6 时，纵深 分辨率就等于是两个轴向象点之间的间隔。另一种定义纵深分辨率的方法是用 系统对点光源所成的象的最大强度随着离焦量的减小来表示纵深视场，我们知 道，单个透镜的焦点附近的强度变化由下式给出： ，v ) = | ( ，d | 2 ( 2 2 7 ) 式中h 是透镜的脉冲响应，即为孔径函数的傅立叶变换，并且脉冲响应和强度 均在焦点处归一化为l ，u 和v 是两个光学坐标，由下式定义： “= 了2 j r 【弘a ( 2 2 8 ) 羔生! 堂型鎏王 整垄茎堡塑堂星垡堕堡墨竺苎查堕些 v = 2 7 c 尹= 等号f 可 ( 2 2 9 ) 对于圆形通光孔径的透镜和给定的物体位置，象的最大强度沿轴的变化 为： l ( u ，o ) = ( s m u ) 2f 2 3 0 ) 在共焦扫描显微镜中，象的强度由物镜和聚光镜两者的性质决定，设聚光 镜的脉冲响应为h ：，则象的强度由下式给出： l ( u ，v ) = l 扛( “，v ) ，v ) f ( 2 3 1 1 如两个透镜相同，则这时的强度为第一类扫描显微镜中象的强度的平方， 沿轴方向的最大强度按下式变化； l ( u ，0 ) ：( s m u ) 4 “ ( 2 3 2 ) 因此，如果纵深视场定义为单个物点的象的最大强度沿光轴的变化，则共 焦扫描光学显微镜的纵深视场相对于普通显微镜有所减小，但两者之间的差别 并不大。 t a 图2 9l c s m 系统纵向分辨率与断层间隔的关系 u 以上这些分析只是以各种不同的方式来揭示共焦系统的纵深分辨性能，而 对于一个具体的系统，其分辨率的数值还与探测器有关。以上的分辨率仅仅是 一种的理论上的分辨率，用来比较两个共焦系统可能有的分辨率的大小。对于 一个实际的共焦扫描显微系统丽言，探泓器所测量到的值是撼应于每个扫描 点的光的强度，那末，如何把系统的纵深分辨率与探测器所测量到的光强值联 系起来昵? 我们知道，共焦系统最显著的特点是其纵深分辨率本领，可以通过 光学断层扫描来实现三维成像，问题在于实际扫描过程中，两个光学断层之闯 一1 4 - l 硕十学位论文 激光共焦扫描显微成像系统基本原理 的间隔取多大才合适? 这个纵深间隔显然与纵深分辨率有关。如果两个断层之 间的间隔au 小于纵深分辨率u 0 ，如图2 9 所示，那末探测器所探测到的图像 在u 0 内随轴向扫描并不变化，因此，间隔取1 1 0 可咀说是最合适的。 系统的分辨率还与探测器的灵敏度有关。在共焦系统中，对于任一轴向扫 描位置，显然共焦面上的信号最强，而来自其它面上的信号强度随着离焦量的 增加而迅速下降。设探测器所能探测的光强最小值为i 。那么，很明显与i 。 相应的位置便是探测器的轴向分辨率。因此，为了使显微镜高的分辨率值能被 探测出来，探测器所能探测的最小强度应大于该纵深分辨率所要求的最小信号。 为了确定共焦扫描显微镜的实际纵深分辨率，应该将分辨率与探测器的探 测强度联系起来。对扫描显微镜来讲，每一个扫描点在探测器上便有一个相应 的强度分布。因此，需要选择一种适当的方式将纵深分辨率与探测面上的积分 强度联系起来，即计算点源的象的积分函数随离焦量的变化函数。由于积分强 度是到达像面的总功率的一种度量，因此这个量可以揭示出显微镜系统区分焦 面外物体的能力。积分强度定义如下【1 4 】： l l a t ( “) = n ( “，v ) 咖 ( 2 3 3 ) 对于第一类型扫描显微镜，根据p a r s e v a l 定理，我们知道，这个量就等于 等效( 即离焦) 孔径函数的模的平方的积分，而由于离焦的作用仅仅是引入一个 相位园子，当取模时，该相位因子便消失，由此我们可以得出结论：对于第一 类扫描光学显微镜，该积分强度并不随离焦量的变化而变化，因而不具有这种 性质的分辨率。 对于共焦扫描显微镜，利用单个透镜焦点附近的强度表达式m l l l 8 1 ： 式中 “) = jn ( 妒) e x p ( 吾，妒2 ) p d p1 4 曲 00 一 = 且c 2 + s 2 ) 2 v 办 】5 ( 2 3 4 ) 硕十学位论文 激光共焦扫描显微成像系统基本原理 跗，v)=i“(妒)sin(圭印2)砌0 s ( “，v ) = “( 妒) s i n ( 寺印2 ) 户印 - f 2 3 5 ) c ( “，v ) = i j o ( u p ) c 。s 0 妒2 ) p 咖 ( 2 - 3 6 ) 0 i 。随u 的变化曲线如图2 1 0 所示，其中已将焦面上的强度归一化为1 。 08 1 6 u 圈2 1 0i n 随u 变化的曲线 由图中可以看出，积分强度随着离焦量u 的增加单调下降，对于单位数值 孔径，则在距离焦面0 7 0 处达到其强度半高点。当u 值较大时，则积分强度 如几何光学近似所揭示的那样按平方反比定律减小。 对于反射式扫描光学显微镜，其焦深可由中央峰的3 d b 给出： ( 止) ，m = 五0 4 而5 2 ( 2 3 7 ) 而s i n0o = n a 是透镜的数值孔径。同时，由于同一个透镜既用于传输探测光束 又用于接受从样品反射回来的信号光束，因此，系统的点扩展函数被平方，而 空间频率响应的频带宽度加倍，因而，横向响应的3 d b 点宽度比采用同样透镜 的普通显微镜减小了o 7 倍”l 。 1 6 0 5 l 0 h口tcgrate4亨tell曲茸 硕士学位论文 激光共焦扫描显微成像系统基本原理 2 4l c s m 系统结构的描述 l c s m 系统是由激光光源、共焦光学显微成像、扫描控制接收、计算机处 理与分析四部分组成。图2 1 1 显示了l c s m 系统的整体结构方框图。 图2 1 1激光共焦扫描显微成像系统的结构方框 一1 7 - 里兰兰焦堡苎 堂垄茎垡塑苎里垡盛堡墨丝苎查堕型 l c s m 系统采用激光光源，可大幅度提高成像信噪比，因而在不破坏样品 的情况下，尽量提高光源功率。共焦显微成像光路可根据使用要求有不同的结 构设计。对不透光的具有反射性能的体样品采用反射式光路，而透光性能较好 的样品可采用透射式设计。如果样品是类似于细胞等生物组织的部分透光的体 样品，采用两种结构均可，这时我们可以通过给细胞染色从而使其在激光的激 发下发出荧光，晟后采用共焦荧光扫描显微成像的方法不经过切片而直接形成 细胞的断层图像，它对医学研究有着很重要的价值。 系统扫描方式分为机械扫描和光学扫描两种形式。机械扫描方式是指被探 测物体在高精度微移动机构实时控制下作x ，y 水平方向扫描，其特点是光路静 止不动，成像质量易保证。光学扫描是指在成像过程中，光线不断偏移，而被 探测物体静止不动，其特点是扫描速度快，扫描范围大，振动影响小，可供选 择的扫描器件多等优点，但图像的精度、线性度较差，图像有枕形失真。 计算机图像处理与分析部分就是对共焦图像的全面处理和三维信息重构。 由于共焦扫描光学显微镜本身性能的限制，及系统各部分的干扰，使得显微镜 所成图像需进一步处理。采用图像处理中的高新技术，去除噪声、滤除背景、 进行图像增强等方法以提高图像质量成为l c s m 系统中极为重要的一部分，边 缘提取、图像分割等是图像研究的重要方法。构造三维图像；再现样品立体形 貌是l c s m 系统的精髓。因此，计算机图像处理在l c s m 系统中占据着很重要 的位置，直接影响着系统的性能。 2 5 激光共焦扫描显徽系统成像特性分析 通过分析共焦扫描原理和对l c s m 系统的剖析，我们可以得到激光共焦扫 描系统的成像特性如下： 一激光共焦扫描显微镜比常规光学显微镜的散射背景小，图像反差好， 探测灵敏度高，成像质量好。特别是对生物组织，如果采用传统的光学显微镜， 由于照明光照射整个样品，使得系统景深以外的样品构成离焦图像，叠加在景 深断层以内的有效散射光图像上，因而不可能获得清晰的有效图像。在l c s m 系统中，由于探测器前增加的小孔空间滤波器的作用，使得在扫描时除与正在 扫描象点对应的物点以外没有照明光，因而没有散射光叠加在扫描象点上，进 而提高了图像的清晰度。 1 8 硕士学位论立激光共焦扫描显微成像系统基本原理 二由于l c s m 系统不仅可以在计算机的控制下进行逐点、逐行的扫挞成 像，而且可对样品不同断层成像，形成三维扫描，这就使得l c s m 系统可采用 计算机处理技术再现样品的三维立体图像研究样品的三维信息。 三采用激光光源，可以使成像系统色差小。大孔径、高放大倍率的显微 物镜均不可避免存在残留色差，用激光光源可以提高光学系统的分辨能力。 四空间分辨率比普通光学扫描显微镜要高，横向和纵向分辨率的提高使 得图像质量得到有效改善，它是激光共焦扫描显微镜最为突出的特点。 - 1 9 ! 塑苎垡塑兰曼一 墼! 型堡些些查些 3 数字图像处理方法 3 。1 引言 数字图像处理是研究利用计算机完成图像信息处理的基本理论和方法。 早在本世纪初，人类为了用图片及时地传输世界各地发生的新闻事件，便开 始了对图像处理技术的研究。然而，图像处理技术的真正发展还是在本世纪 六十年代以后。特别是近十几年中，随着计算机技术的迅速发展，图像处理 理论和应用也得到了快速发展，并在八十年代中期到九十年代形成了独立的 学科体系。 图像处理理论作为一门迅速发展的学科，一方面，一些传统的方法在不 断发展与完善；另一方面，一些新的理论还在出现。早期，由于计算机技术 的限制，图像处理一般在频域内进行，频率域图像变换是图像处理的主要方 法。进入九十年代以后，计算机在速度上得到了极大的提高，空间域图像处 理方法被广泛地采用，空间域图像处理理论得到了较大的发展，特别是数学 形态学1 2 0 - 2 1 1 正逐渐成为空间域图像处理主要理论。伴随数学领域的新成就， 子波变换i2 “、马尔可夫随机场汹l 、神经网络等许多新理论也发展起来，它 们在图像处理领域的某些方面得到了成功的应用。这里，我们仅对一些主要 图像处理方法进行探讨和研究。 3 2 图像变换方法 图像变换是指二维正交变换，对一幅图像u = 伽( x ，y ) ，0 x s n - 1 ，0 y 墨n 一1 1 ，有定义： 一l 一1 v ( 膏，f ) = u ( m ，h ( m ，n ) o s n t , o s f ( n 一1( 3 1 ) m = on = o 我们称y = v ( 工，y ) ，o s x s n 一1 , 0 s y s n 1 ) 为图像变换， 口 - j ( m ，n ) 为一 组完备的标准正交基函数。图像变换在图像处理中具有重要作用。如：傅立 叶变换后平均值正比子图像灰度的平均值，高频分量指示图像边缘的幅度和 方向，可以通过高通滤波提取边缘，同时，它又代表着噪声成分，可通过低 2 0 皇型兰塑垄生兰一 塑! 鬯堡竺型互鲨 通滤波去除噪声；我们可以通过图像的变换编码实现压缩频带等。图像变换 算法纷繁，这里仅给出一些主要的图像变换。 3 2 1 傅立叶变换( f o u r i e rt r a n s f o r m ) 对于n n 数字图像阵列f ( j ，k ) ，其二维离散傅立叶变换的级数形式定义 为： ，( 州) = 寺丢n - i 荟n - i f ( i ，的e x p 鲁( 巧+ 慵) 】 ( 3 2 ) 其反变换为： ，( ，) = 万1 刍n - 1 缶n - i ，( “，v ) e x p 百2 h i ( 巧+ 俯) 】 ( 3 1 3 ) 式中i = 一l ，j 、k 表示图像阵元的行、列位置数，u 、v 被称为变换域中的 空间频率。二维f o u r i e r 交换具有许多性质，下面是其一些主要性质； ( 1 ) 变换核具有可分离性和对称性，由于： e x p 2 z i ( u j + v k ) 】= e x p + 2 t a ( u j ，n ) e x p ：k 2 , , r i ( v k ，| ) 】 ( 3 ，4 ) 我们可以将二维傅立叶变换分成两个一维傅立叶变换的积，因此我们可以将 图像傅立叶变换看作是先对行( 或列) ，再对列( 或行) 作一维变换，即： f ( u ，v ) = 寺, e x p - e z d ( u i n ) f ( ，k ) e x p - 2 r a ( v k n ) ( 3 。5 ) v f = o k - - o ( 2 ) 空间域具有平移性，是指在空间域平移( j 。，k ) 等价于在频域中引起线 性相位因子改变值e x p 一2 , a 0 。+ v c o ) ，而幅度不变，即： f ( j j o 一k o ) 铮f ( u ，v ) e x p - 2 n i ( u j o + v k o ) n 】 ( 3 , 6 ) l ，( “，v ) e x