（无机化学专业论文）glu101在八肋游仆虫中心蛋白构象及生物功能发挥中的作用.pdf

摘要 中文摘要 中心蛋白( c e n a i n ) 分子量约为2 0k d a ，属于钙调蛋白超族，含有四个保守的e f - 手结构域( h e l i x 1 0 0 p - h e l i x ) ，每个结构域可结合一个钙离子。它定位于中心体及细胞 核、膜间空间等部位，在中心粒的复制和中心基体纤维的收缩中发挥重要作用。突 变氨基酸的研究方法被广泛用来考察蛋白中某些重要氨基酸在蛋白构象及生物功能 发挥中的作用。其中紫外照射突变法的优点是可以得到大量突变型蛋白，为研究工 作提供较多的实验样本。但其突变结果具有不可知性，需要进行系列的筛选工作。 定点突变法以其明确的突变位点以及能够得到高纯度突变蛋白等优点而在许多研究 工作中被采用。 基于对1 5 0 多种钙调蛋白超族成员序列的分析，e - h e l i x 链的规范序列可以表示 为e n s s n n $ $ n 。其中，e 表示g l u ，1 1 表示疏水性氨基酸，$ 表示任意氨基酸。根据达 尔文生物进化理论，我们推测e - h e l i x 链起始的g l u 可能对c e n t r i n 的正常构象和功能 的发挥起着重要作用。本文用分子生物学的方法表达、纯化得到了纯度较高的八肋 游仆虫中心蛋白( e o c e n ) ，利用定点突变法将e o c e n 中第三个e f 手e - h e l i x 的第一个 氨基酸g l u l 0 1 突变为l y s ，得到突变蛋白e 1 0 1 k 。并从以下几方面研究了保守 的g i u l 0 1 对蛋白构象及生物功能发挥的作用。 首先，采用荧光光谱法、紫外可见分光光度法考察了g l u l 0 1 的突变对蛋白基本 光谱的影响。结果表明保守的g l u l 0 1 的突变对蛋白的激发、发射光谱和吸收光谱均 不产生影响。此外，以n 尹为荧光探针考察了突变对蛋白金属结合性质的影响。结 果表明g l u l 0 1 的突变大大增强了1 r b 3 + 与蛋白第三个e f 手结合位点作用的荧光敏化 强度，推测是由于突变使蛋白构象发生变化而导致蛋白该结合位点与t b 3 + 作用时的 荧光敏化增强。说明g l u l 0 1 对保持蛋白正常的金属结合性质发挥着重要作用。 其次，研究了g l u l 0 1 的突变对蛋白与稀土离子作用的影响。结果表明稀土离子 与蛋白作用时蛋白构象的变化程度远大于钙离子与蛋白的作用。此外，与e o c f f l l 相 比，g l u l 0 1 的突变明显增强了e 1 0 1 k 与稀土离子作用时的共振光散射强度，说明 g l u l 0 1 对保持蛋白与稀土离子作用时正常的构象变化起重要作用。 最后，考察了g l u l 0 1 的突变对蛋白与蜂毒素作用的影响。结果表明蛋白与蜂毒 素作用时形成l ：l 复合物，且g l u l 0 1 的突变对蛋白与蜂毒素的作用影响较小。 关键词：中一t l , 蛋白：定点突变；荧光光谱；稀土离子；蜂毒素 i 摘要 c e n t r i ni sap r o t e i no f2 0 c d a , w h i c hb e l o n g st ot h eh i g h l yc o n s e r v e d e f - h a n dc a ms u p e r f a m i l yo fc a 2 + - b i n d i n gp r o t e i n s c e n ( r i nh a sf o u r c a 2 + - b i n d i n gs i t e s ( e f h a n d ) a n de a c hs i t ec a l lb i n dw i t ho n ec a 2 + 砧e l o c a l i z a t i o no fe e n t r i ni sn o tl i m i t e dt oe e n 仃o s o m e sb u ti sr e l a t e dt oo t h e rc e l l c o m p a r t m e n t sl i k et h en u c l e u so rt h ep e r i m e m b r a n es p a c e c e n t r i u sp l a ya f u n d a m e n t a lr o l ei nc e n t d o l ed u p l i c a t i o na n dc o n t r a c t i o no fc e n t e rb a s a lb o d y f i b r o u s t h em e t h o d so ft h em u t a t i o no fa m i n oa c i d sa r ew i d e l yu s e di nt h e s t u d yo ft h ee f f e c to fc e r t a i na m i n oa c i d st ot h ec o n f o r m a t i o na n dt h e b i o l o g i c a lf u n c t i o no fp r o t e i n s t h ea d v a n t a g eo fu vm u t a g e n e s i si sm o r e m u t a t e dp r o t e i n sc a nb eg o t t e na n dt h ed i s a d v a n t a g ei st h a tt h er e s u l to ft h i s m u t a t i o ni sn o ts u r ea n ds e r i e so ff i l t r a t i o nw o r km u s tb ed o n e 办em e t h o d o fs i t ed i r e c tm u t a t i o ni sb e t t e ru s e dt h a nu v m u t a g e n e s i sj u s tb e c a u s eo fi t s c l e a r l ym u t a t e ds i t ea n d i t ss i m p l e xm u t a t i o nr e s u l t t h ec a n o n i c a ls e q u e n c ef o rt h ee - h e l i x ，b a s e do nt h ek n o w na m i n oa c i d s e q u e n c e so fm o r et h a n 15 0m e m b e r so ft h ec a ms u p e r f a m i l y , c a nb e r e p r e s e n t e da se n $ $ n n $ $ n - w i t heb e i n gg l u t a m a t e ，nah y d r o p h o b i ca m i n o a c i d ，a n d $ a n ya m i n oa c i d t h u s ，t h eg l u t a m a t e ( g l u ) a tt h eb e g i n n i n go f t h e e - h e l i xw o u l db ee x p e c t e dt ob ei m p o r t a n tt ot h ep r o p e rc o n f o r m a t i o na n d f u n c t i o no fc e n t r i n i nt h i ss t u d y , w eh a v ee x p r e s s e da n dp u r i f i e d t h e e u p l o t e so c t o c a r i n a t u sc e n t r i n ( e o c e n ) b yb i o l o g i c a le n g i n e e r i n ga n dt h e m u t a n t e dp r o t e i n ( e 1 0 1 k ) w i t hg l u1 0 1 ，t h ef i x s ta m i n oa c i do f t h ee - h e l i xo f t h et h i r de f h a n di ne o c e n ，c h a n g i n gt ol y sw a sg o t t e nb yt h em e t h o do f s i t ed i r e c tm u t a t i o n t h e nm ee f f e c to fg l u l 0 1t ot h ec o n f o r m a t i o na n dt h e b i o l o g i c a lf u n c t i o no fe o c e nw e r es t u d i e da sf o l l o w s ： f i r s t l y , t h ee f f e c to ft h em u t a t i o nt ot h eb a s i cs p e c t r ao fc e n t r i nw a s s t u d i e db yf l u o r e s c e n c ea n du vs p e c t r a t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e e x c i t a t i o n ，e m i s s i o na n da b s o r p t i o ns p e c t r ao fe o c e nw e r en o ta f f e c t e db y t h em u t a t i o no fg l u l 0 1 a d d i t i o n a l l y , u s i n gt b ”i l l sf l u o r e s c e n c ep r o b e ，t h e 1 1 1 八肋游仆虫中心蛋白片段分子与金属离子作用的光谱研究 e f f e c to ft h em u t a t i o nt ot h em e t a lb i n d i n gc h a r a c t e r i s t i co fb d c e nw a s s t u d i e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r a r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ef l u o r e s c e n c e s e n s i t i z a t i o no ft b ”b i n d i n gw i t ht h et h i r de f h a n ds i t eo fe o c e nw a s g r e a t l ye n h a n c e db yt h em u t a t i o no fg l u l 0 1 i tc o u l db ec o n j e c t u r e dt h a tt h e c o n f o r m a t i o no fc e n t r i nw a sc h a n g e db yt h em u t a t i o no fg l u l 0 1 i ti ss u r e t h a tg l u l 0 1w a sc r u c i a lt ok e e pt h en o r m a lm e t a lb i n d i n gc h a r a c t e r i s t i co f e o c s e c o n d l y , t h ee f f e c to ft h em u t a t i o no fg l u l 0 1t ot h ei n t e r a c t i o no f e e n t r i na n dr a r ee a r t hi o n sw a si n v e s t i g a t e d r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ed e g r e e o ft h ec o n f o r m a t i o nc h a n g eo fc e n t r i n sw h i c hw a si n d u c e db v 也ei n t e r a c t i o n o fc c n t r i n sa n dr a r ee a r t hi o i l sw a sl a r g e rt h a nt h ei n t e r a c t i o no fc e n t r i n sa n d c 铲+ m o r e o v e r , t l a ei u ，si n t e n s i t i e sw h i c hw e r ei n d u c e db yt h ei n t e r a c t i o no f e 1 0 1 ka n dr a r ee a r t hi o n sw e r eo b v i o u s l ys t r o n g e rt h a ni n t e r a c t i o no f e o c e n a n dr a r ee a r t hi o n s i tw a sd e d u c e dt h a tg l u l 0 1w a sc r u c i a lt ok e 印t h e n o r m a lc o n f o r m a t i o nc h a n g ew h i c hw a si n d u c e db yt h ei n t e r a c t i o no fe o c e n a n dr a r ee a r t hi o n s l a s t l y , t h ee f f e c to ft h em u t a t i o no fg l u l 0 1t ot h ei n t e r a c t i o no fe o c 锄 a n dm e l i t t i nw a ss t u d i e d r e s u l t si n d i c a t e 也a tt h e1 ：1c o m p o u n dw a sf o r m e d b yt h ei n t e r a c t i o no fe o c e na n dm e l i t t i na n dt h ei n t e r a c t i o no fc e n t r i na n d m e l i t t i nw a sn o tb e e na f f e c t e db y 也em u t a t i o no f g l u l 0 1 k e yw o r d s ：c e n t r i n ；s i t ed i r e c tm u t a t i o n ；f l u o r e s c e n c es p e c t r a ；r a r ee a r t h i o n ；m e l i t t i n i v 承诺书 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指 导下独立完成的，学位论文的知识产权属于山西大学。 如果今后以其他单位名义发表与在读期间学位论文相 关的内容，将承担法律责任。除文中已经注明引用的 文献资料外，本学位论文不包括任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的成果。 靴2 0 论0 7 黼霈嗜财年岁月招日 u 。u 第一章中心蛋白简介 第一章中心蛋白简介 1 1 引言 细胞内许多动力学过程严格依赖于微管这一细胞器。微管的数量、方向和极性 的部位由微管组织中心( m t o c ) 调控。m t o c 是细胞质内的细胞器，存在于所有真核 细胞中，它在微管成核以及微管的动力学调节等方面发挥着重要的作用【1 1 。在人类等 高等真核生物的细胞中，中心体起着m t o c 的作用。低等生物中也包含m t o c ，典 型的如海藻中的基体和酵母中的纺锤极体等。m i d c 包含大量的蛋白质，而且不同 的真核细胞中所含蛋白质差异很大。尽管这样，所有真核细胞中的m t ( ) c 都包含一 定数量的保守的蛋白质成份其中，有两种蛋白因为他们的分子及功能数据已经知 道而受到特别注意。 - t u b u l i n 是两者之一，它被认为是m t o c 的一个广泛的标记物； 另一个是中心蛋白( c e n n i n ) ，它是属于钙调蛋白( c 心i ) 超族的一个酸性蛋白【2 川。自从 2 0 多年前在绿藻t e t r a s e l m i ss t r i a t a 中发现c e n t r i n 的第一个成员以来，c e n t r i n 家族一 直在扩展【5 】。c e n t r i n 在中心粒的复制和中心基体纤维的收缩中起重要的作用，与细 胞中纤维的收缩、细胞的分裂等密切相关。 c e n t r i n 与c a m 的同源性高，结构也类似，同样含有两个相似的球形区域：n _ 端 和c 端区域，中间由中心螺旋链相连。每个区域中包含两个c a ( i i x e f 手) 结合位点， 每个位点是由两个被称为e 和f 螺旋的a - h e l i c e s 分别连接于l o o p 区的两端而形成，每 个l o 叩区包含1 2 个氨基酸残基【6 1 。e f 手蛋白的功能是不同的。有一些，如小清蛋白 是在特定组织或细胞中用做钙离子缓冲剂的。其他象钙调蛋白和肌钙蛋白c 能与其他 蛋白作用并使其本身能够感知自由钙离子浓度的大小。c e r t a i n 结合钙离子后，能与 特定靶肽结合从而调节细胞行为【7 】。然而，相对于c a m ，c e n t r i n 只有有限数量己知的 细胞内靶肽，这意味着c e n t r i n 可能在细胞内发挥着更加特殊的生物功能。有实验表明， 中心蛋白过表达或中心蛋白磷酸化增加可能会引起中心体复制异常从而导致恶性肿 瘤的产生。由此可见，深入研究中心蛋白的结构、性质、功能，以及它与细胞其它 成分的关系，可以了解中心体的自身复制以及中心体周期与细胞周期的关系，并且 可以揭示肿瘤的发生机制，研究有针对性的癌症治疗手段。 到目前为止，关于c e n t r i n 的研究主要集中在其生物功能和结构上。生物功能的研 究主要从以下三方面展开：一是通过基因的定点突变、侧链修饰进一步研究c e n t r i n 活性功能区域；二是通过设计特定的引物，构建得到碎片蛋白进而研究其对整个蛋 白的作用；三是通过c e n t r i n 在细胞中的定位进而研究其作用机制。前两者在体外进行， g l u l o l 在八肋游仆虫中心蛋白构象及生物功能发挥中的作用 而第三者是在体内研究。 基于对c a m 超族中超过1 5 0 种成员的序列分析，e - h e l i x 链的规范序列可以表示为 e n $ $ n n $ $ n 。其中，e 表示g l u ，n 表示疏水性氨基酸，$ 表示任意氨基酸m9 1 。因此， e - h e l i x 链起始的g l u 被认为对e e n t r i n 的正常构象和功能起着重要的作用。 本章主要围绕中心蛋白相关的一些研究进展来做一介绍。 1 2 中心蛋白的结构 中心蛋白氨基酸序列分析表明，它与钙调蛋白有较高同源性( 5 0 ) 1 1 0 l ，因此推测 中心蛋白含有四个螺旋环螺旋结构，即所谓的e f 手性结构，e f 手性是k r e t s i n g e r 儿】 等在用x 射线衍射分析钙结合蛋白三维晶体结构时提出的一种结构模型，代表着钙 离子的可能结合位点，是中心蛋白中最保守的区域。图1 1 中半圆形部分为蛋白中的 钙结合区。与钙调蛋白类似，中心蛋白的四个e f 手性结构也分为两个结构域，即 n - 端结构域和c 端结构域，每个结构域都可以结合一个钙离子 上一如厶“照二二霉熟。一 k 霉乜呲盏辞莲砌嚣 图1 1c d c3 i p 氨基酸序列中的钙结合区 f i g u mi in 嵋f o u r p o t e n t i a l c a 2 + b i n d i n g l o o p o f c d e 3 1 p 钙是一种生命必需元素，也是人体中含量最丰富的宏量金属元烈1 2 】。c a 2 + 在细 胞的许多生理活动中都起着重要的作用，这些作用几乎都是通过与一些特殊的蛋白 质( 受体) 相结合的形式进行的【1 3 1 。c e n t r i n 就是细胞 j c a 2 + 结合蛋白的一种特异性蛋 白。e f 手性结构是蛋白中的一个重要的钙结合模式，它包含一个由2 9 个连续氨基酸 残基组成的螺旋环一螺旋( h e l i x 1 0 0 p - h e l i x ) 结构，两个螺旋之间是1 2 个氨基酸残基的钙 结合区，l ! p l o o p 区( 图1 1 ) 。e f 手性结构一般成对出现，形成含四个螺旋在内的球 状结构。从钙调蛋白的构象【1 4 i 推断，c e n t r i n 的三级结构呈哑铃形，氨基端和羧基端 分别为哑铃的两头，各含两个e f 手性钙结合区。不含c a 2 + 时，c e n t r i n 分子采取“关 闭”构象，e f 手性结构的两个螺旋折叠在一起( 图1 2 a ) 。c a 2 + 的结合使得e f 手性结 2 第一牵中心蛋白简介 构内部的螺旋角度发生改变，转为以“开放”的构象存在( 图1 2 b ，这样就导致了疏 水残基的暴露，进而结合靶肽( 图1 2 c ) 。因此推测在c e n 仕i n 与靶肽的结合过程中c a 2 + 起着很重要的作用。可以与c e n l r i n 键合的肽链通常长度是2 0 到3 0 + 氨基酸，这种较短 的c e n t r i n 靶肽可以与蛋白结合区反应形成l ：l 的配合物，而更短的肽链可与c e n t r i n 的结 合形成2 ：l 配合物。 图1 2 丝带状钙调蛋白表示图【1 4 l 。( a ) 脱钙钙调蛋白，( b ) 钙结合时，( c ) 与靶肽结合后。 f i g u r e1 2r j b b o np r o t e i nc a r t o o nr e p r e s e n t a t i o n si nt h e ( 幻c 一f r e ec o n f o r m a t i o n ( r c s be u c y l d m o ，m o d e l2 8 1 ，( b ) c 十- l o a d e dc o n f o r m a t i o n ( r c s be n t r yl 砷，a n d ( c ) i nc o m p l e xw i t h t h ec a mb i n d i n gd o m a i no f c a mk i n a s ei i ( r c s be n t r yl c m 4 ”) t h en a n dc t e r mc r 卞- b i n d i n g d o m a i n sa r eh i g h l i g h t e di nd i f f e r e n tc o l o r sc o r r e s p o n d i n gt ot h ec o l o rc o d i n go f t h er e l a t e d i r a i e c t o r i e si no t h e rf i m z r c 螭 e l n ap i d e o c k l l 5 1 等在大量文献调研的基础上归纳总结出了钙离子与蛋白的成键 情况：其一，钙离子与蛋白质上连续的氨基酸短序列成键；其二，钙与蛋白质中连 续的氨基酸大部分短序列成键，同时需要远离蛋自主链的一个氨基酸配位；最后一 种情况就是提供配位的氨基酸不是连续的，而是间隔一个氨基酸提供一个配位原子。 研究表明，蛋白中处于螺旋及片层处的氨基酸与钙离子形成具二齿状配位键，较转 角及环区的氨基酸和钙离子更能很好地配位。因此，虽然钙离子和蛋白结合的平均 配位数是6 ，但钙离子与e f - h a n d 区域氨基酸配位的平均配位数却是7 。 e f 手性结构中间环区的6 个即位于1 、3 、5 ，7 、9 、1 2 位的氨基酸残基参与了和 c a 2 + 的成键【1 6 1 。最初认为c a 2 + 与这些氮基酸残基形成t j k 面体结构，c a 2 + 处于八面体 中心，然而事实上与c a 2 + 结合的只有7 个键，形成了一种扭曲的五边形为底的金字塔 g l u l 0 1 在八肋游仆虫中心蛋白构象及生物功能发挥中的作用 结构( 图1 3 ) f r 丌不管该结构以何种形态存在，和c a 2 + 直接配位的原子始终都是氧，只 是氧原子的来源不同。提供和c a ；馏位的氧原子来源有三：首先是由侧链的天氡氨酸 ( a s p ) 、天氡酰氨( a s n ) 、谷氨酸( g l u ) 、谷氨酰氨( g l l l ) ，丝氨酸( s 砷残基提供；其次 是由主链上羰基氧提供；最后水分子中的氧也可能参与c a 2 配位，从而使蛋白趋于 更加稳定。通过对比与c a 2 + 结合的1 0 0 p 区序列可以得出这样的结论，处于不同位置的 氨基酸有很高的同源性【i 蜘。也就是说位置l 的氨基酸总是a s p 残基；而处于位置3 的可 以是舡p 或者a s h ；占据1 2 号位置的侧链g l u 残基氧原予以具二齿结构与c a 2 匐位形成 c a 2 + 的第七个配位点。因为甘氨酸( g l y ) 没有侧链，可以使蛋白在发生构象变化时位 阻效应减低到最低程度，因此占据6 位置处的几乎都是g l y 。8 号位置处的氨基酸是形 成蛋白中b 折叠的关键性氨基酸，而这对p 折叠刚好处于一对e f - h a n d 的两个互补的结 合c a 2 + 的1 0 0 p 区之间，因此占据这个位置的氨基酸往往是异亮氨酸( i l c ) 或其它的疏水 性氨基酸( v a lo rk u ) 。 1 9 5 图1 3e f 手性结构与钙离子结合后的金字塔结构示意图”。 f i g u r e1 3s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h ep e n t a g o n a lb i p y r a m i d a lc a 2 + c o o r d i n a t i o ns p h e r ei na n e f - h a n d 中心蛋白还含有一个其他钙结合蛋白没有的氨基端区域，该区域一般由1 5 3 4 个 氨基酸组成。在不同种类蛋白中氨基酸序列是最不同的，而且进化距离越远，差别 越大。这段序列决定着蛋白功能的特异性。但从进化角度来看，氨基端也具有它的 同源性。如脊椎动物的氨基端由2 4 个保守的氨基酸组成，包括8 个疏水残基，6 个 正电荷残基，低等生物的氨基端也有类似的序列1 2 】。这就说明了中心蛋白在此亚区电 子密度和疏水残基排布的相似性。中心蛋白还有4 0 个保守氨基酸残基与钙调蛋白不 4 第一章中心蛋白简介 同，c 端有一个保守的芳香族氨基酸( t r p ，p h 0 。 1 3 中心蛋白的分类及功能研究概况 除原核生物外，对几乎各种生物的中心蛋白的研究都有报道，包括藻类、原生 生物、高等植物、酵母、哺乳动物【1 9 1 。它是一种磷酸蛋白，分子量约2 0 k d 。中心蛋 白最初是在一种绿藻c h l a m y d o m o n sr a i n h a n d t i i 中发现的【2 0 】，是与鞭毛的条纹根 ( s t r i a t c d r o o t ) 部相连的基体的主要成分。 1 3 1 中心蛋白的分类 根据不同的分类方法，中心蛋白有不同的分类： 根据基因同源性比较，可以将c 锄t r i n 分为两大支嘶1 ：一支是以芽殖酵母的c & 3 1 为代表，包括m m c e n 3 ( 鼠源c e n t r i n 3 ) 、i - i s c e n 3 ( 人类c e n t r i n 3 ) 等，其主要功能可能 与中心粒复制有关；另一支则以双鞭毛绿藻( c h l a m y d o m o n sr e i n h a r d t i i ) 为代表，包括 h s c e n i ( 人类c e n t r i n l ) 、h s c e n 2 ( 人类c e n t r i n 2 ) 、m m 2 c e n l ( 鼠源c e n 仃i n l ) 、 m m c e n 2 ( 鼠源c e n t r i n 2 ) 等。其主要功能可能是与中心体的分离以及鞭毛的切除反应 有关。其中脊椎动物间c e n a i n 氨基酸序列的同源性达8 0 9 0 ，脊椎动物和低等生 物之间的同源性为5 0 7 0 。近年，o l i v i e r 嘲等发现了新的鼠c e n t r i n 基因( c e n t r i n 4 ) ， 该基因编码的蛋白与鼠c e n t r i n 2 蛋白同源，可能与纤毛细胞中的基体组装以及纤毛形 成有关。 根据系统发育学分析，中心蛋白按氨基酸序列可分为四个主要的分支叫。高等植 物的中心蛋白代表独立的一支，如烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 的中心蛋白1 和2 、滨藻 ( a t r i p l e xn u m m u l a r i a ) 的中心蛋白、拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 的中心蛋白。他们内 部约有7 7 - - 7 8 的同源性，与非植物中心蛋白相比，同源性下降至4 0 - 6 3 4 1 。第 二分支为动物类的中心蛋白，包括人( h o m os a p i e n s ) 的中心蛋白1 和2 、非洲爪蟮 ( x e n o p u sl v i s ) 的中心蛋白、g ( m u sm u s c u l u s ) 的中心蛋白l 。第三分支为酵母类的 中心蛋白及其与之同源性较高的中心蛋白，包括酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的中 心蛋白c d c 3 1 p 、贾第虫( g i a r d i ai n t e s t i n a l i s ) q a 心蛋白、人的中心蛋白3 和鼠的中心 蛋白3 。第四分支为藻类中心蛋白，藻类中心蛋白与酵母中心蛋白c d c 3 l p 的同源性 只有5 0 - 一5 1 2 3 】。原生动物草履虫( p a r a m e c i u m t e t r a u r e l i a ) 的中心蛋白l 和2 与上述 四个类型同源性都比较低，被认为是独立的一个分支【4 】。最近在网柄菌属 d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m 中又发现了一种中心蛋白( r m c r p ) ，它只有两个e f - h a n d 结 构，缺少了其它中心蛋白四个e f - h a n d 结构中的前两个f 2 4 1 。 g l u l 0 1 在八肋游仆虫中心蛋白构象及生物功能发挥中的作用 1 3 2 中心蛋白功能的研究概况 1 3 2 1 双鞭毛绿藻中心蛋白功能的研究 中心蛋白最初就是在双鞭毛绿藻c h l a m y d o m o n a sr a i n h a n d t i i 中发现的【5 】，被认为 参与核一基体连接器纤维的收缩。如图1 5 ，c e n a i n 定位在三种不同区域，它们分别 是核一基体连接子纤维( n u c l e a rb a s a lb o d yc o n n e c t o r s ) 、基体末端连接纤毛( t h ed i s t a l c o n n e c t i n g f i b e r s ) 与鞭毛穿越区( t h ef l a g e l l a rt r a n s i t i o n a l r c g i o m ) 脚7 】。2 0 0 2 年 r u i z - b i n d e rn e 等人【2 8 】用c 翎订i n 研p 蛋白在凸b 母曲埘d 船r e i n h a r d t i i 畸a 进行了活体 定位，并研究了融合蛋白在细胞分裂时的分布，证实了中心蛋白在绿藻中以上三处 的定位。 图1 4cr e i n h a r d t i i 的核机体连接器及鞭毛示意图1 2 1 。 f i g u r e1 4s c h e m a t i cd i a g r a m so f t h em u c l e u s b a s a l b o d ya p p a r a - t u sa n df l a g e l l ao f c h l a m y d o - m o n a $ t h ea l t o wh e a d si n d i c a t et h el o c a t i o no f c e n t r i n c c n t r i n 与钙离子结合可导致纤维发生不依赖a t p 的收缩功能，这与肌肉纤维收 缩的滑动机制不同，c e n t r i n 结合纤维收缩时发生扭曲变形而形成一个电子密度体。 在功能上可使鞭毛重定向或移动基体，对穿越区纤维而言，可导致鞭毛切除反应 2 7 1 。 1 3 2 2 芽殖酵母中心蛋白功能的研究 目前研究最多的是酵母爱c e r e v i s i a e 的中心蛋i 刍c d e 3 1 p ，它与分裂过程中的纺锤体 形成有关 2 9 - 3 1 1 。芽殖酵母假c e r e v i s i a e ) c d e 3 1 是c r c e n 的同源基因。c d e 3 1 定位在纺 锤体极体的半桥胞质位置( t h e b r i d g eo f t h es p b ) 1 2 , 3 2 1 ，c d e 3 1 突变体在纺锤体极体复制 的第一步中发生异常，导致细胞纺锤体极体增大，并且没有初始的星体出现，由单个 s p b 形成单极体，细胞周期阻断在g 2 m 期。说明c d c 3 1 在细胞周期依赖的纺锤体极体 6 第一章中心蛋白简介 复制中起重要作用。研究发现c d c 3 突变体在结束分裂时可以进行一次或多次的分 裂。由此可以推断，c d e 3 1 蛋白或s p b 在调节开始分裂和退出分裂期中是不可缺少的 【3 3 l 。 k a r l p 是一种核膜蛋白，包含一个疏水尾基帮助其定位，也参与s p b 复制，k a r l p 基因的突变也可以引起细胞在g 2 m 期终止。c d c 3 l p 结合于k a r l pc 端的一个1 9 个 氨基酸的小区( 类似于钙调蛋白结合的多肽，但还有3 个负电荷氨基酸，决定c d e 3 1 p 结合的特殊性口q ，帮助其正确定位于半桥p5 1 。这种结合依赖于c a 2 + 的存在，同时 c d e 3 1 p 内的e f - 手性结构域的突变也抑制二者的结合 3 6 1 ，因此钙依赖性的c d e 3 l p 构象变化是c d e 3 1 p 与k a r l p 结合所必需的。k a r i p 在2 9 4 - 2 9 7 氨基酸位置在p 3 4 c 晓 的磷酸化位点口7 】c d e 3 1 p 结合位点在2 3 7 2 5 5 氨基酸位置，因此2 9 4 - 2 9 7 位置磷酸 化可能会影响到2 3 7 2 5 5 位置的c d c 3 1 p 的结合。在突变体k a r l p - a 1 7 中，与c d e 3 1 p 结合的区域被部分的删除掉了，所以c d c 3 1 p 虽然表达，但错误定位。有控制的突变 c d e 3 1 基因，使c d e 3 1 p 在s p b 中重新定位就可抑制突变体k a r l p - a 1 7 。过量表达野 生型c d c 3 1 p ，c d e 3 1 p 抑制了k a r l 突变体，使s p b 正常复制和分离，可阻止细胞周 期终止【3 】。c d e 3 1 p 和k a r lp 是在g l 期早期起始s p b 复制第一步的细胞周期信号的 敏感器1 2 。根据c d c 3 1 p 及k a r l p 在细胞内的定位关系、突变表型以及在体外可相互 结合的特点，推测二者在体内可能发生细胞周期依赖性的相互作用，由此影响纺锤 体极体的复制。 除了k a r l p 以外，c d c 3 1 p 还与纺锤体极体的其它蛋白相互作用而发挥其功能。 用e d t a 鳌合c 0 冲，c d e 3 1 p 还可与c a m 的靶蛋自n u f l p s p e l1 0 相结合1 3 珂，而c a m 与k a d p 之间不能发生相互作用，在无c d 2 + 时，c a m 也不能与任何蛋白发生相互作 用，说明这两种蛋白具有各自的底物特异性。c d c 3 1 p 通过钙的结合而获得这种特异 性。 2 0 0 4 年，f i s c h e r 等【3 9 】又发现了c d c 3 1 p 的一个新的功能。s a c 3 一t h p l s u s l 复合物定 位在核孔，参与转录过程中m r n a 的输出。c d e 3 l p 结合其q 6 s a e 3 的c 端结构域c i d ， 当c i d 过量复制。会将本来在s p b 定位的c d c 3 l p 拉到核内，弓i 起s p b 复制终止和显性 致死现象，高拷贝的c d c 3 1 p 表达会抑制这一现象的发生。c i d 结合s u s l 和c d e 3 l p ， 再结合s a c 3 - t h p l 复合物，在m r n a 输出中发挥作用。 1 3 ，2 3 原生生物中心蛋白功能的研究 原生生物有着明显的原始性，它们在某种意义上代表着生物进化历程的一个重 要环节，联系着原核生物和三界多细胞后生生物：植物、动物和真菌，它们特指单 7 g l u l 0 1 在八肋游仆虫中心蛋白构象及生物功能发挥中的作用 细胞真核生物，通常尚包括群体的原生生物。原生生物是完整的生物体，其单细胞 个体是独立的营养、活动和增殖单位。营养获取方式可为摄食型或吸收型，在某些 具有光合质体的类群则为光合自养型。细胞增殖类型为有丝分裂或其原始型，在具 有较典型有丝分裂的一些类群中可存在减数分裂和结合( 受精) 等有性生殖现象。其 细胞核均有核膜，在某些种类可为多核，并有所分化。存在鞭毛的种类，其鞭毛( 或 纤毛) 均为具9 + 2 模式的微管组构造【加】。 原生动物寄生虫贾滴虫g i a r d i a 砌6 妇被认为是真核生物族中最原始的有机体 分支之一，因此是研究这一分支的最好模型。它拥有复杂的细胞骨架结构包括一个 腹部的吸盘，四对鞭毛，中间体和拟气管棍。1 9 9 6 年f r a n c e sd g i l l i n b 4 q 等克隆出中 心蛋白g 1 c 如基因并研究了蛋白的定位，预测了其生物功能。 胞咽器( 啪p h a r y n g e a l ) 是纤毛虫中一种高度分化，被特异性用来进行有机体摄取 的纤毛细胞器。活性细胞试验表明，这个被称为“饲养篮”的细胞器在摄取的最初 步骤中引导和操纵纤维细菌伸长扩大。一般认为扩大是微管成分所固有的本质，而 收缩是由可收缩性的纤维结构介导的。通过w e s t e r n 杂交，免疫组化等实验发现纤毛 虫n a s s u l a 和f u r g a s o n i a 的中心蛋白定位在胞咽器的上部，免疫电镜表明中心蛋白在 纤维状物质中发挥作用，形成类括约肌结构，很可能参与其中的收缩运动。有趣的 是，c e n t r i n 的纤维状特征与胞咽器的物质的联系也为人所关注 4 2 1 。 毛滴虫t r i c h o m o n a sv a g i n a l i s 的c e n t r i n 基因f f v c e n ) ，与绿藻c r c e n 的同源性最 高( 7 0 的，而与酵母c d e 3 1 p 的同源性则较低( 5 0 呦。t v c e n 与柱状基体相连，是鞭毛 基部的终板和质膜间九条锚定臂的组成之一，也与基体的钩状纤维、x - 纤维相连， 并沿着屈伸微管结合处s 型纤维排列，该处是负责微管屈伸的微管组织中心部位m 】。 人们研究利氏曼原虫l e i s h m a n i ad o n o v a n i c e n t r i n 突变体时分离出了编码c e n t r i n 的基因。免疫荧光分析可知该蛋白定位于基体。在利氏曼原虫寄生过程的指数生长 期，c e n t t i nm r n a 和蛋白的表达水平都很高，而到了稳定期则下降到一低水平 4 4 1 。 s e l v a p a n d i y a na 等1 4 5 l 对c e n t r i n 进行基因去除后，与哺乳动物一致，细胞循环在g 2 m 期终止，基体不能复制，多核细胞形成。 g u e r r a 4 6 l 等报道了四膜虫t e t r a h y m e n at h e r m o p h i l a 的中心蛋白基因，它与其它 e e n ( r i n 有超过8 0 0 的同源基因，并与t e t r a h y m e n a 的e f - 手蛋白：钙调蛋白，t c b p 2 3 ， a n dt c b p 2 5 等都有高度的同源性。t t c e n 定位在基体、口器的皮层纤维和纤毛根、 顶端纤维环和沿纤毛轴的动力内臂( i n n e ra r md y n e i n ，i a d ) ，进一步研究表明t t c e n 8 第一章中心蛋白简介 是调节t e t r a h y m e