（微生物学专业论文）havp2重组杆状病毒的构建及其表达.pdf

一 黑龙江大学硕士学位论文 r b a c t z f w k h a v p 2 、r b a c t z f w k i h a v p 2 、r b a c t z f s d h a v p 2 、 r b a c t z f s d i - h a - v p 2 、r b a e t z f l m 。h a v p 2 、r b a c - t z f l m i h a v p 2 、 r b a e t z f w k c h a - v p 2 、r b a e - t z f s d c h a - v p 2 、r b a e - t z f l m c - h a - v p 2 ，转 染鼍汐昆虫细胞后，获得重组杆状病毒p 1 代储备，继续扩增病毒至p 3 代，空斑法 分析病毒的滴度均在1 2 1 0 8 p f u m l 左右。最后，将获得的9 个重组杆状病毒同 时侵染中国仓鼠卵巢细胞( c h o ) ，利用s d s p a g e 和w e s t e r n b l o t t i n g 成功检测 到h a - v p 2 蛋白的表达。 研究结果表明，优化后的杆状病毒表达载体系统能够较好地表达具有抗原性 的传染性法氏囊病病毒v p 2 抗原蛋白，为探究改进型重组杆状病毒作为基因传递 的载体研制禽类基因工程疫苗奠定了坚实的基础。 关键词：传染性法氏囊病病毒( m d v ) ；v p 2 ；杆状病毒表达载体系统 一 i a b s t r a c t a b s t r a c t i n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s ev i r u s ( i n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s ev i r u s ，i b d v ) i sa c u t ea n d h i g h l yc o n t a g i o u sd i s e a s ep a t h o g e n sw h i c hc a nc a u s ed i s e a s ei nc h i c k e na n dt u r k e y v p 2i st h em a j o rp r o t e c t i v ea n t i g e no fh o s t v p 2c o n c e m e s 丽也t h es t r e n g t ho fi b d v v i r u l e n c e ，a n t i g e n i cv a r i a t i o na n dv i r u sn e u t r a l i z i n ga n t i b o d yi n d u c t i o na n di d e n t i f y t h em a j o rd i r e c t i o no ft h ep r e v e n t i o na n dc o n t r o lo fi b dr e s e a r c hi se x p l o i t i n gt h e e x p r e s s i o nv e c t o rt oe x p r e s sv p 2u s e dt op r e p a r eg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e dv a c c i n e b a c u l o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o rs y s t e m ( b a e u l o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o rs y s t e m , b e v s ) w h o s ef o r e i g ng e n e se x p r e s s i o nv e c t o ri sab a c u l o v i r u s ，a n dw h o s er e c e p t o ri si n s e c t c e l l ，i sas a f e ，e f f i c i e n tv e c t o rs y s t e mw i t hl a r g ec a p a c i t y i ti se a s yt os c r e e n r e c o m b i n a n tv i r u s ，a n dt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nc o u l db ef o l d e da n dm o d i f i e dw i t h b i o l o g i c a la c t i v i t ya n ds oo n e p i t o p et a g g i n g ( e p i t o p et a di st h ea t t a c h e de p i t o p ef u s e t od e t e c tp r o t e i ns ot h a tc a nb eu s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fp r o t e i n , a n da l s oc a nb e u s e dt op u r i f yt h et a r g e tp r o t e i nb ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yo rt ol o c a t es u b c e l l u l a r p r o t e i n sb yi m m u n o f l u o r e s c e n c e h a - t a gi st h em o r ew i d e l yu s e de p i t o p et a g g i n g t h i s i s s u ef u s e dh a - t a ga n di b d v - v p 2 ，a n du s e db a e - t o - b a eb a c u l o v i r u se x p r e s s i o n v e c t o rs y s t e mt oe x p r e s st h ef u s i o np r o t e i ni nc h oc e ul i n e s c o m p a r e da n da n a l y z e d t h ei n f l u e n c eo ft h el e v e lo fp r o t e i ne x p r e s s i o ni nd i f f e r e n tr e c o m b i n a n tv e c t o r ，t h e n c h o s et h ep r e f e r r e de x p r e s s i o ns y s t e m t h i si s s u ep r o v i d e sn e wi d e a sf o rp r e p a r i n gt h e g e n e t i ce n g i n e e r i n go f p o u l t r yv a c c i n e u s i n gd n a s t a rs o f t w a r et od e s i g nap a i ro fs p e c i f i cp r i m e r so ft h ev p 2t h a tr e f e r t op u b l i s h e di b d v v p 2s e q u e n c eo ng e n b a n k ，a n df u s e dt h eh a t a gg e n et ot h e i b d v - v p 2g e n es e q u e n c eo ft h e5 e n d h a - v p 2g e n ew a sa m p l i f i e db yp a 艮a n d c l o n e di n t op m d18 tv e c t o r r e c o m b i n a n tp l a s m i dn a m e dp t z f - h a - v p 2c o n t a i n i n g t h ev p 2g e n ew a sg a i n e db yt h ew a yo fr e s t r i c t i o ne n z y m ea n a l y s i s ，b a c t e r i ap c ra n d n u c l e o t i d es e q u e n c i n gi d e n t i f i e d t h e nh a v p 2g e n ew a ss u b c l o n e di n t ot h ep r e v i o u s t r a n s f e rv e c t o rp w k , p w k i ，p l m ，p l m - i ，p s d ，p s d - i ，p w k c ，p l m c ，p s d c ，w h i c h h a db e e nc o n s t r u c t e d b yd i f f e r e n tc o m b i n a t i o ne n z y m ed i g e s t i o ni tw a sp r o v e dt h a tt h e - i 黑龙江大学硕士学位论文 i i i i _ i ii ii r e c o m b m a n tt r a n s f e rv e c t o r s 、 ，i t hd i f f e r e n te x p r e s s i o nc a s s e t t e sw h i c hn a m e d p t z f - w k h a - v p 2 ，p t z f - w k i h a - v p 2 ，p t z f - l m h a - p 2 ，p t z f - l m - i - h a - v p 2 ， p t z f s d h a - v p 2 ，p t z f - s d - i - h a - v p 2 ，p t z f - w k c - h a - v p 2 ，p t z f - l m c h a v p 2 ， p t z f - s d c - h a 删w a sg a i n e d t h e s e t r a n s f e rv e c t o r sw e r et r a n s f o r m e di n t o c o m p e t e n t c e l l so fec o l id h10 b a e ，a n df o r m e dr e c o m b i n a n ts h u t t l e p l a s m i d s r b a c - t z f w k - h “、腰2 ，r b a c - t z f - w k - i - h “v p 2 ，r b a c - t z f - s d h a - v p 2 ， r b a c - t z f s d - i h a - v p 2 ，r b a c - t z f l m - h a - v p 2 ，r b a c - t z f - l m i h a - v p 2 ， r b a e t z f w k c - h a v p 2 ，r b a c - t z f s d c h a - v p 2 ，r b a c - t z f - l m c h a - v p 2b y b a c - t o - b a eb a e u l o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o rs y s t e m t h e s ep l a s m i d st r a n s f e c t e d 驴i n s e c t c e l l sa n dg a i n e dt h er e c o m b i n a n tb a e u l o v i r u sn a m e dp 1 ，c o n t i n u i n gt op r o l i f e r a t et h e v i r u st op 3g e n e r a t i o n t i t e r so ft h ev i r u sw g t e1 - 2x10 5p i l l m l ，a n a l y z e db yl a c u n a f i n a l l y ，t h er e c e i v e dn i n ev i r u s e si n f e c t e dc h oc e l l s i nt h e 鞠t n l et i m e ，t h e nu s e d s d s p a g ea n dw e s t e r n - b l o t t i n gt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fv p 2 p r o t e i n ，n kr e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m i z e db a c u l o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o rs y s t e m e x p r e s s e d 、能w i t ha n t i g e n i c i t yo fi n f e c t i o u sb u r s a l d i s e a s ev i r u s i tl a i das o l i d f o u n d a t i o nf o re x p l o r i n gt h em o d i f i e db a c u l o v i r u sa sag e n ed e l i v e r yv e c t o ri nt h e d e v e l o p m e n to fg e n e t i ce n g i n e e r i n go f p o u l t r yv a c c i n e k e yw o r d ：i n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s ev i r u s0 b d v ) ；v p 2 ；b a c u l o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o r s y s t e m ， 1 l i 符号与缩略语 符号与缩略语 i 黑龙江大学硕士学位论文 ii i 目录 中文摘要i a b s t r a c t i i i 符号与缩略语。v 第1 章绪论1 1 1 传染性法氏囊病病毒的抗原蛋白研究概况1 1 1 1i b d v 的基因组结构1 1 1 2i b d v 的v p 2 蛋白研究概况1 1 2 杆状病毒表达载体系统2 1 2 1 杆状病毒简介2 1 2 2 杆状病毒表达载体系统- 3 1 2 3b a c - t o b a c 杆状病毒表达系统4 1 2 4 杆状病毒表达载体系统的应用：。6 1 3 杆状病毒介导外源基因的体外细胞表达7 1 3 1 杆状病毒介导外源基因表达的影响因素。7 1 3 2 杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的优化策略8 1 4 表位附加标记1 l 1 5 本研究的目的与意义1 2 1 6 本研究技术路线一：1 3 1 7 课题资助名称1 4 第2 章材料与方法1 5 2 1 试验材料15 2 1 1 供试细胞、菌株及质粒载体1 5 2 1 - 2 培养基：。18 2 1 3p c r 扩增引物19 2 1 4 主要生物化学及分子生物学试剂1 9 一 一 - - 目录 i 2 1 5 主要生化试剂及缓冲液配制方法2 0 2 1 6 主要仪器设备2 4 2 2 实验方法2 5 2 2 1h a 表位标记的h a - v p 2 基因的克隆与鉴定2 5 2 2 2 重组转移质粒的构建。3 0 2 2 - 3 重组对照转移载体的构建3 5 2 2 4 重组杆状病毒穿梭载体r b a c - t z f - x 的获得3 6 2 2 5 重组杆状病毒r b v t z f - x 的制备与滴度测定。3 8 2 2 6 重组杆状病毒r b v t z f - x 介导的h a - v p 2 基因在c h o 细胞中的表达4 0 2 2 7 重组蛋白的s d s p a g e 及其w e s t e r n b l o t t i n g 鉴定4 2 第3 章结果与分析4 5 3 1h a 表位标记的h a - v p 2 基因的克隆与鉴定4 5 3 1 1 目的基因h a - v p 2 的p c r 扩增4 5 3 1 2p c r 产物胶回收纯化结果4 5 3 1 3 重组阳性质粒的鉴定4 6 3 2 重组转移质粒的构建结果4 7 3 2 1 重组转移质粒p t z f - w k - h a - v p 2 ，p t z f w k i - h a - v p 2 的构建结果4 7 3 2 2 重组转移质粒p t z f l m h a - v p 2 ，p t z f - l m - i h a - v p 2 的构建结果5 l 3 2 3 重组转移质粒p t z f s d h a v p 2 ，p t z f s d - i h a - v p 2 的构建结果5 5 3 3 重组对照转移载体的构建结果5 9 3 3 1 对照转移载体p w k c ( e c o ri s a li ) ，p s d c ( e c o r i s a li ) ，p l m c ( e c o r i s a li ) 和片段h a v p 2 的获得5 9 3 3 2 重组对照转移质粒p t z f w k c - h a v p 2 ，p t z f - s d c - h a - v p 2 ， p t z f l m c h a - v p 2 的鉴定6 0 3 4 重组杆状病毒穿梭载体r b a c t z f - x 的鉴定结果6 2 3 5 重组杆状病毒r b v t z f x 的制备与滴度测定6 5 3 5 1 互侈昆虫细胞生长曲线的绘制6 5 一 i 黑龙江大学硕士学位论文 3 5 2 正常与病变的矽昆虫细胞的数目与形态变化6 5 3 5 3 重组杆状病毒的扩增与滴度测定6 6 3 6 重组蛋白的s d s - p a g e 及其w e s t e r n - b l o t t i n g 鉴定6 8 3 7 重组蛋白的定量分析7 0 3 8 总结7 1 第4 章讨论7 3 4 1 课题背景7 3 4 2w p r e 对外源基因表达效率的影响7 3 4 3i t r s 对外源基因表达的影响7 4 4 4 含有不同启动子的重组杆状病毒在c h o 细胞中的活性7 4 结论7 5 参考文献。j 7 6 l i f | 录8 4 致谢8 5 独创性声明8 6 一 第1 章绪论 i mii 第1 章绪论 1 1 传染性法氏囊病病毒的抗原蛋白研究概况 传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒( i n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s ev i r u s ， m d v ) 引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病，是危害世界养禽业的主 要传染病之一【l 】。国际兽疫局( o i e ) 已将鸡传染性法氏囊病列为“影响社会经济 的重要疾病 。目前，对于传染性法氏囊病的防治仍是以传统疫苗为主，一般为减 毒或灭活的疫苗，但是由于病毒抗原的不断变异，特别是超强毒株的出现，使得 此病的防控形势更加严峻，因此各国都积极研制新型、高效的基因工程疫苗来解 决传统疫苗防治的弊端。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，众多的科学 工作者采用丰富的研究方法和手段，对i b d v 的基因结构、主要结构蛋白及功能 方面进行了较为深入的研究，为基因工程疫苗的研制提供了理论依据【2 j 。 l 1 1 1i b d v 的基因组结构 i b d v 属于双节核酸病毒科( b i m a v i r i a d e ) 禽双r n a 病毒属( a v i b i r n a v i r u s ) ，其 基因组由双节段的双股r n a 组成，分别为节段a 和节段b 【3 】。其中a 节段长约 3 2 k b 3 4 k b ，含有两个开放阅读框：o r f l ( 约3 0 9 6 b p ) 和o r f 2 ( 约4 3 6 b p ) ，o r f l 编码病毒前体聚合蛋白n h 2 v p 2 v p 4 v p 3 c o o h ，此聚合蛋白在蛋白加工过 程中被蛋白水解酶v p 4 剪切成3 个蛋白胛、v p 3 、v p 4 ，p v p 2 进一步被加 工成v p 2 蛋白【4 5 】；而o r f 2 编码v p 5 蛋白。b 节段长约2 8 0 0 b p 2 9 0 0 b p ，含有一 个约2 6 3 4 b p 的o r f ，编码病毒的v p l 蛋白。此外，a 、b 节段存在末端非编码区。 1 1 2i b d v 的v p 2 蛋白研究概况 v p 2 蛋白由a 节段部分基因编码翻译，分子质量约4 0 4 5 k d a ，占病毒蛋白总 黑龙江大学硕士学位论文 量的5 1 t 6 。v p 2 与另一主要结构蛋白v p 3 一起构成i b d v 核衣壳的骨架。目前， 研究认为v p 2 蛋白既是i b d v 的主要结构蛋白，也是宿主的保护性抗原，与病毒 毒力变异、病毒中和抗体的诱导与识别、病毒的抗原漂移、细胞嗜性、细胞凋亡 的诱导等密切相关1 7 , s , 9 1 ，是近年来研究i b d v 的一大热点。 v p 2 上至少包含有中和性抗原表位、非中和性抗原表位和毒力相关性抗原表 位。在v p 2 可变区的亲水区分布着至少3 个与诱导中和抗体有关的抗原决定簇 【1 0 ，1 1 】，这些抗原位点可以诱导产生中和性抗体，并且具有血清型特异性。试验证明， 中和性单克隆抗体可以通过免疫沉淀而不是w e s t e r n b l o t t i n g 与v p 2 蛋白发生反应， 说明此蛋白具有高度的构象依赖性【1 2 , 1 3 1 。非中和性抗原表位所诱导的抗体不具有， 中和病毒的能力，在临床上用于区分i 和型毒株。毒力相关性抗原表位具有毒 力特异性，可以识别强毒和弱毒，在临床上被用与筛选理想的疫苗株【1 4 j 。 经氨基酸序列比对分析发现，不同毒株v p 2 氨基酸序列差异主要存在于第 2 0 6 3 5 0 残基，即v p 2 高变区【1 5 j 。此区含有两个亲水区和一个富含丝氨酸的七肽 区。亲水区i ( 2 1 2 2 2 4 a a ) 与构象依赖性抗原表位的构象稳定有关，起稳定构象 的作用；亲水区i i ( 3 1 4 3 2 4 a a ) 为中和抗体结合位点；第二个亲水区之后的七肽 区( 3 3 6 3 3 2 a a ) 被认为是i b d v 毒力强弱的标志【1 6 ，1 7 1 。v p 2 是i b d v 重要的毒力 基因，v p 2 的2 5 3 、2 7 9 、2 8 4 位氨基酸是公认的毒力位点，但这三个位点对v p 2 结构和功能影响机制还不清楚 9 , 1 8 , 1 9 , 2 0 。 另外，v p 2 是细胞感染i b d v 后引起细胞凋亡的主要因素之一。 f e m a n d e z - a r i a s 等对表达成熟的i b d v 结构蛋白v p 2 和v p 3 的痘苗病毒重组子 研究发现，v p 2 表达能介导各种哺乳动物细胞系的细胞凋亡【2 l 】。 1 2 杆状病毒表达载体系统 1 2 1 杆状病毒简介 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的d n a 病毒，因其病毒粒子 呈杆状而得名，杆状病毒的基因组为环状双链d n a 分子结构，以超螺旋方式包装 第1 罩绪论 i i i i i i i i i i i 一i i i i i i i 宣i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 在杆状核衣壳内，其大小为8 0 1 8 0 k b 2 2 1 。杆状病毒在分类学上属于杆状病毒科， 依据包涵体的有无以及包涵体的形状可被分为3 个属：颗粒体病毒属( g r a n u l o v i r u s , g v ) 、核型多角体病毒属( n u c l e a rp o l y h e d r o s i sh r u s , n p v ) 和非包涵体杆状病毒 属( m o r a t o r v i r u s ) 。在全世界已经发现的6 0 0 多种杆状病毒中，研究最为深入的 是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒似u t o g r a p h ac a l i f o r n i c an u c l e a rp o l y h e d r o s i sv i r u s ， a c n p v ) 2 3 】。 随着分子生物学技术和方法的发展及应用，杆状病毒在分子水平上的基础研 究突飞猛进，杆状病毒已被开发为高效的真核表达载体系统来用于表达外源基因。 长期以来，杆状病毒被认为是一类宿主专一的昆虫病毒，由于其宿主特异性，它 作为载体仅限于在昆虫细胞内表达，而在非受纳细胞中不能发挥作用；但研究发 现杆状病毒也可以进入哺乳动物细胞，其病毒本身并不能在哺乳动物细胞中复制， 但在哺乳动物细胞启动子的存在下可以介导外源基因在哺乳动物细胞内表达，而 且表达的外源蛋白与天然蛋白很接近，所以作为新型的疫苗与基因治疗载体而得 到人们高度的重视 2 4 2 5 , 2 6 , 2 7 1 。 1 2 2 杆状病毒表达载体系统 自1 9 8 3 年s m i t h 等首次报道利用a c m n p v 在草地贪夜蛾细胞成功地表达了人 p 干扰素以来【2 引，杆状病毒表达载体系统( b a c u l o v i r u se x p r e s s i o nv e c t o rs y s t e m ， b e v s ) 作为一个新的研究领域迅速发展，在2 0 多年的时间里已经成为了生产与研 究各种蛋白的有力而普及的工具，被公认为是当今基因工程四大表达系统之一1 2 9 。 杆状病毒表达载体系统是一个以杆状病毒为外源基因载体，昆虫和昆虫细胞 为受体的表达系统。与其他表达系统相比，它具有以下几个方面的特点： ( 1 ) 安全性高：与细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比较，昆虫杆状病 毒表达系统的生物安全性较高【3 0 】。杆状病毒的宿主范围窄，一种病毒只能感染一 种或数种昆虫，不感染脊柱动物，即使能进到其它哺乳动物细胞内，杆状病毒基 因组也不能复制，不能够利用自身启动子启动基因的表达，并且杆状病毒不会影 响哺乳动物细胞的生长【3 1 1 。 - 3 黑龙江大学硕士学位论文 ( 2 ) 能容纳大分子量的插入片段口2 】：杆状病毒的基因组比较大，可容纳大片 段外源基因。据报道，插入大约3 8 k b 的外源d n a 并不会影响病毒的复制与装配【3 3 】。 由于杆状病毒可以容纳大片段外源基因，可以共表达目的基因和报告基因等多个 基因，也可以表达融合蛋白【2 6 刀, 3 4 , 3 5 。 ( 3 ) 表达水平高：与其它真核表达系统相比较，杆状病毒表达系统可以高效 地表达外源基因，目的蛋白表达量最高可达到感染细胞总蛋白量的5 0 t 3 6 1 。 ( 4 ) 能进行翻译后的加工修饰【3 7 1 ：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻 译后加工能力，对表达的真核基因产物能更好地进行磷酸化、脂肪酶化、酰胺化、 切割信号肽以及形成三级或四级结构等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况 完全一致【3 8 】。 ( 5 ) 能同时表达多个基因【3 9 1 ：杆状病毒具有多个天然启动子，也可以方便地 构建新的人工启动子，可以实现多基因表达。既可采用同时将两个外源基因克隆 至同一转移载体的方式，也可采用不同的重组病毒同时感染同一细胞的形式，将 表达产物加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。 ( 6 ) 蛋白表达产物具有生物学功能：杆状病毒表达系统可以使外源蛋白在细 胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成，可使蛋白产物保持天然结构、 生物活性和免疫活性。 另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能，可以对重组蛋白进行定位， 如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位于膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外 箜 3 7 1 口o 1 2 3b a e t o b a e 杆状病毒表达系统 目前b e v s 中最为方便、快捷的系统是美国i n v i t r o g e n 公司开发的b a c - t o b a c 杆状病毒表达系统。该系统是利用转座原理在大肠埃希氏菌内构建重组杆状病毒， 并根据从细菌( b a c t e r i a ) 到杆状病毒( b a c u l o v i r u s ) 之意对其进行命名，该系统由一 系列可选择的转移载体( p f a s t b a c 1 等) 、穿梭质粒( b a c m i d ) 、辅助质粒p m o n 7 1 2 4 和大肠杆菌菌株d h l 0b a c 组成( 图1 1 ) 。该系统将重组病毒的筛选周期缩短至 - 4 - l i 第1 章绪论 7 1 0 天，而且可以在较短的时间内同时分离出多个重组病毒。 ， b a t - t o b a c 系统是以位点特异性转位至大肠杆菌中的增值的穿梭质粒为基础 的。穿梭质粒b a c m i d 是人工构建的以质粒形式存在于大肠杆菌中的杆状病毒基因 组，含有低拷贝量的小f 复制子、1 个卡那霉素抗性标记( k m r ) 和来自p u c 克 隆载体的l a c z a 多肽的一段d n a 序列，在l a c z a 基因的n 端插入了一个不会破 坏l a c z 仅多肽的阅读框的含有细菌转座子t n 7 ( m i n i a r tt n 7 ) 附着位点的短片段。 b a e m i d 在大肠杆菌d h l 0b a c 中提供卡那霉素抗性，可以互补染色体上l a c z 的缺 失，在色原底物x - g a l 与诱导物i p t g 存在的情况下形成蓝色菌落。供体质粒提供 庆大霉素抗性( 渤。) 和氨苄青霉素抗性( a m p r ) 标记，其上含有t n 7 的左右两 臂序列，两臂序列之间是多角体蛋白的启动子、多克隆位点与s v 4 0 的p o l y a 位点。 大肠杆菌菌株d h l 0b a c 中的辅助质粒含有一个四环素抗性标记( 1 计) ，可编码转 座酶，反式提供t n 7 转座功能，将供体质粒上的m i n i t n 7 元件转座至b a c m i d 的 m i n i a t tt n 7 附着位点上，从而构建出重组b a e m i d 。当m i n i t n 7 插入到b a e m i d 的 m i n i a t tt n 7 附着位点，会破坏l a c z a 多肽的表达。因此，在含卡那霉素、庆大霉 素、四环素及i p t g 和x - g a l 的l b 培养平板( - - 抗平板) 上筛选白斑即可得到重 组的b a e m i d 。用重组b a e m i dd n a 转染s j 9 昆虫细胞，从感染细胞中收获的病毒 储备可用来感染昆虫细胞或哺乳动物细胞进行蛋白表达、1 纯化和分析【4 0 】。 占 夕f 钿国鲰季蓖遴t 翥i 聊1 蕾 图1 1b a e - t o - b a c 杆状病毒表达系统 f i g 1 1t h eb a e - t o - b a cb a c u l o v i r u se x p r e s s i o ns y s t e m 5 o 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 4 杆状病毒表达载体系统的应用 。 ， 一：一 科学工作者利用杆状病毒表达系统进行了多方面的研究，将其广泛地应用于 基础研究、表达免疫活性分子、疫苗生产和现代医学中基因治疗等多个领域中。 ( 1 ) 基础研究 - 随着人类基因组计划的完成，后基因组时代已经来临。功能基因组学的主要 研究内容就是确定各种蛋白质的结构和功能。如何生产几万种蛋白质以供研究成 为了科研工作者面临的一道难题。由于杆状病毒表达载体系统具有蛋白表达量高 的特性，利用该系统生产各种活性蛋白质，并利用杆状病毒表面展示技术对相应 的蛋白进行展示，这为蛋白质的功能与结构研究以及蛋白质间的相互关系研究提 供了便利【4 1 1 。此外，杆状病毒表面展示的病毒蛋白还可用于体外病毒受体研究； 利用昆虫杆状病毒载体也可获得大量的具有生物活性的肽，对昆虫生理、生化和 内分泌进行研究， ： ( 2 ) 医用蛋白与疫苗开发 ， b e v s 自问世以来，由于具有诸多优点且不对哺乳动物存在潜在的致病性，已 被用于基因工程疫苗和医用蛋白的大量生产。2 0 世纪8 0 年代，科学家用b e v s 生 产的拟用于艾滋病预防的工程疫苗被美国f d a 批准进行人体实验，其中h i v 疫 苗和疟疾疫苗己进入临床试验阶段，这亦证明b e v s 来源的重组蛋白对人是安全 的 4 2 , 4 3 , 4 4 。利用重组杆状病毒表达的外源蛋白大部分都是可溶性蛋白，其生物活性 与天然来源的分离物非常接近，因此可利用b e v s 生产各种动物疾病的治疗药物 及免疫疫苗嗍。猪轮状病毒、牛乳头瘤病毒、伪狂犬病毒、鸡新城疫病病毒、马 传染性贫血病病毒等数十种动物病毒的抗原蛋白已在b e v s 中表达和纯化。此外， 利用b e v s 还成功的生产了人鼠嵌合抗体、鼠源单克隆抗体、单链抗体等多种抗 体分子以及将抗体分子与肿瘤相关蛋白进行融合表达。 ( 3 ) 基因治疗 、- ： 现有的研究表明，杆状病毒以昆虫为唯一宿主，它虽然能够进入哺乳动物细 胞，但并不在其中复制，并不对靶细胞产生任何影响，这对于在不杀死宿主细胞 第1 章绪论 的前提下治疗目标基因的缺陷来说至关重要。如果以n p v 作载体，置于哺乳动物 启动子之下的外源基因却可以有效的传递并正确表达。s o n g 等 4 6 1 首次报道了运 用杆状病毒介导的p 5 3 基因治疗骨肉瘤。b e c k 等【4 7 】也曾报道杆状病毒能在原代鼠 肝细胞中激活耵师a ，i l 1 a ，i l 1 1 3 等细胞因子的表达。此外g r o n o w s k i 等【4 明还 报道杆状病毒在哺乳动物细胞中能刺激i f n 的产生，并能保护小鼠抵抗脑心肌炎 病毒的感染，具有抗病毒效应。 1 3 杆状病毒介导外源基因的体外细胞表达 - 1 3 1 杆状病毒介导外源基因表达的影响因素 i - 1 3 1 1 转导细胞类型 4 杆状病毒对于不同的细胞系具有不同的转导效率。转导效率从大于9 5 的人肝 癌细胞( h e p g 2 ) 和仓鼠肾细胞( b h k ) 4 9 至1 j 转导效率小于5 的其它的细胞系均 有分布。对于树突状细胞( d c s ) t s o l 及一些造血来源细胞系如k 5 6 2 ，u 9 3 7 和 r a w 2 6 4 7 t 5 1 1 等，杆状病毒表现出极低的转导效率。这种呈现出的所谓的极低的转 导效率仅仅说明了在某些细胞系中，杆状病毒所传递的基因无法进行表达，但是 这并不代表这些携带转基因的病毒无法进入上述细胞中。已有一些研究证明，杆 状病毒可以进入诸如d c s 5 0 1 、y a c 1 f 5 2 1 和r a w 2 6 4 7 f 5 3 1 等细胞中，只是随后的细胞 核运输过程受到抑制【5 2 1 ，病毒的核衣壳也被迅速降解为一些亚细胞成分，这就导 致了转基因表达的失败【5 3 】。 1 3 1 2 细胞分化程度 杆状病毒转导哺乳动物细胞的转导效率、转基因表达的强度以及表达之后的 外源蛋白在细胞内存活的时间长度等因素均与靶细胞的分化状态密切相关。由人 骨髓间充质干细胞和脐带血间充质干细胞分化而来的成骨祖细胞、软骨形成祖细 胞和成脂祖细胞处于不同分化谱系和分化时期时，杆状病毒的转导效率( 约 2 1 9 0 ) 、转基因表达持续时间( 7 4 l ( 1 ) 和表达水平均表现出很大程度的差异剐。 病毒进入细胞的效率或核运输的效率不同可能导致病毒转导效率的差异；而转基 7 - 黑龙江大学硕士学位论文 因表达水平的差异可能是由不同分化进程中不断变化的细胞转录机制造成的【5 5 1 。 另外，在靶细胞的不同周期，杆状病毒转导的效率以及外源蛋白表达的程度均不 尽相同。 1 3 1 3 启动子的偏好性 不同的细胞类型对启动子存在偏好性，从而影响转基因表达的水平。s v 4 0 ( s i m i a nv i n l s4 0 ) 、c m v 、r s v ( r o tss a r c o m av i r u s ) 启动子和复合c a g 启动子( 由 c m v 的沱基因增强子、鸡p - 肌动蛋白启动子和兔p 珠蛋白p o l y a 信号组成) 等 已广泛应用于杆状病毒介导的哺乳动物细胞转基因表达，但其活性存在一定差异。 其他一些昆虫病毒启动子，如白斑综合症病毒( w h i t e s p o ts y n d r o m ev i r u s ，w s s v ) i e l 启动子【5 叼和杆状病毒早期至晚期( e 1 r 1 0 启动子f 5 刀等均可启动转基因表达。外源基 一 因也可以被一些细胞来源的启动子所启动，包括人类泛激素c 【5 1 1 、u 6 5 引、e f l a l s s , 5 9 启动子和含有c m v 即早期增强子区与鸡肌动蛋白启动子区的复合启动子c b a ，以 及一些应用于基因治疗的组织特异性启动子。因此选择合适的特异性启动子至关 重要。 1 3 2 杆状病毒介导外源基因在晡乳动物细胞高效表达的优化策略 杆状病毒作为哺乳动物细胞的基因转移载体被学者们广泛关注。但由于哺乳 动物细胞并不是杆状病毒的天然宿主，因此杆状病毒对哺乳动物细胞的嗜性不广 泛、转导哺乳动物细胞的效率和转基因表达水平偏低、表达持续时间短暂等方面 问题成为限制其进一步发展的瓶颈。就突破“瓶颈”而言，目前国内外学者们主要通 过添加化学助剂鳓、选择合适的启动子5 1 1 、添加基因调控元件 6 7 , 6 8 )