（森林培育专业论文）七叶树种子脱水敏感性机理研究.pdf

七叶树种子脱水敏感性机理研究 摘要 本文对七叶树种子成熟过程中脱水敏感性形成机理及成熟种子脱水过程中 老化、劣变机理进行了较为系统的研究。结果如下： ( 1 ) 七叶树种子的耐脱水性是在成熟过程中逐渐形成的，在成熟脱落时表 现出最大程度的耐脱水性。种子成熟末期未经历明显的脱水过程，但此期间种子 内营养物质的迅速积累以及种子脱落时种皮中较高的a b a 含量、种皮和种胚中 较低的g a 3 a b a 值均对种子的耐脱水性和轻度休眠习性的形成起到重要的作 用。虽然可溶性糖组分中o d 值与七叶树种子耐脱水程度不完全呈正相关，但 成熟脱落时含量较高的二糖和低聚糖对七叶树种子的耐脱水性增强起到重要作 用。 ( 2 ) 成熟脱落的七叶树种子含水量高达1 4 2 9 g _ 1 d w ，且对脱水敏感。当 种子含水量高于1 0 9 g _ 1 d w 时，轻度脱水能够提高种子发芽率；但当种子含水 量低于这一水平时，继续脱水就会对种子发芽率产生严重影响。这可能与成熟的 七叶树种子缺乏胞内去分化、呼吸代谢旺盛有关。电镜观察表明，成熟的七叶树 种子胚根细胞分化完全，各种细胞器完整、清晰且保留着复杂的结构；尤其是线 粒体含量多、结构完整且保持清晰的内嵴和外膜。自然脱水5 d 后的种胚细胞内 出现同心圆膜状结构内质网。脱水7 d 后的种胚细胞内同心圆状膜体结构内质网 增多、面积增大且回水处理后恢复不到正常状态，同时细胞内出现了预示细胞死 亡的吞噬泡，说明种子己经受到了严重的脱水损伤。脱水过程中，种子中p o d 活性的异常升高可能也是加速种子衰老死亡的原因之一。 ( 3 ) 快速脱水虽然能在较短时间内将种胚含水量降低到较低水平，但种胚 含水量高达o 7 8 9 - g 叫d w 时种子活力已经开始下降。电导率及f t i r 的测定结 果表明此时种胚的膜结构和蛋白质均受到脱水伤害，且电镜观察发现此时的种胚 胚根细胞核固缩、大部分细胞器解体或模糊不清，同时细胞被大量的液泡和淀粉 粒所填充。 关键词：七叶树种子；脱水敏感性；可溶性糖；a b a ；超微结构 s t u d i e so nm e c l l a n j s m so fd e s i c c a t i o n s e n s i t i v i t yo f 名8 s o 挂z “5 ( 是f 理g 嚣s i ss e o d s a b s t r a c t m e c h a n i s m so fd e s i c c a i j o n - s e n s i t i v i t yo f 一8 5 c “，“s 曲加e n s 捃s e e d sd u r i n gt h ep r o c e s so f m a 伯r a t i o na n dm e c h a n i s m so fd e t e r i o r a t i o no fm a t u f e g s f i f f z f sc 矗f 拜p 燃 妇s e e d sd ur i n 婪t h e p f o e e s so fd e h y d r 舔i o nw e r es y s t e m 越i c a l l ys t u d i e d ，t h er e s u l 拓w e r es h o w na sf o l l 。w s ： ( 1 ) t h ed e s i c c a t i o nt o e r a n c eo f 一g s c “，“sc 向m e ”j 曲s e e d sw a sp f o d u c e dg r a d u a l l yd u r i n g t h ep r o c e s so fm a t u r a t i o n ，a n dt h ep e a ko fd e s i c c a t i o nt o i e r a n c eo c c u r r e da tt h et i m eo f s h e 幽i i n g r a p i dn u t r i e n ta c c u r n u l a t i o na sw e la sh i g h e ra b a c 。n t e n ti ns e e dc o a la n dl o w e r g a 3 ，a b af 矗t ；eb o 氇l ns e dc o 采鑫n de m b r y o 魏鑫ds 逗n i 螽c 鑫n 重o f f e e to n 巷e s i e e a t o 硅 o l e r a n e e a n d 蚰a i o wd o r r n a n c yo fm a t u r e “o s c “? “sc 捌 p 竹s 妇s e e d sd u r i n g1 a s ts t a g eo fs e e dm a t u r 韪t i o n a 1 t h o u g ho ，dr a t j 0o fs 0 1 u b i es u g a ri n0 口s c “f “sc a 抽p n s 抽s e e d sn o t ，t os o m ee x t e n t ，p o s i t i v e l y c o r r e l a t e dw i t hd e s i c c a t l o nt o l e r a n c eo ft h es e e d s ，t h eh i g h e rc o n t e n to fo l i g o s a c c h a r i d ea n d d l s 拄c c h a f i d ep l a y e da n m p o r t 嚣扎tr o l ei n 睡ep r 。d u c t i o no fd 霉s i c e a t 。硅协l e r a n c eo fz # s # h 扭s e 是伽8 拜s 缸s e e d sd u “n g 伯et i m oo fs e e dm a t u r a l o n ( 2 ) t h ew a t e rc o n t e n io fm a l u r e 爿p 5 c “h s 幽m 朗s 站s e e d sw a sh i g h ，u pt oi 4 2 9 + g 叫d w t h es e e d sw e r ed c s i c c a t i o n - s e n s i t i v i t ya f t e rs h e d d j n g w h e nw a t e rc o n t e n tw a sh i g h e rt h a n 1 0 9 g 叫d w ，s l i g h td e s ；c c a t i o n w o u l di n c r e a s o 抽es e e dg e r m 柏t o ”p e r c e n t a g e ，b u tf u 烈h e r d e s e e a t 。nw o 强l d 1 a v es f i o sd e f i m n t a lo f 兔c to ns e e dv i g o f h p o s s 氆l 母r e 矗s 。nw 鑫s 氆a t h ema t u r e p n o 甜，“5c 抽e 拧s 站s e e d sh a dn od e d i f f e r e n t ia t e dp r o c e s sa n dh a dah i g hl e v e lo f r e s p i r a t o r ym e t a b o i i s m t h er e s u l t so b s e r v e db yu s i n ge i e c f r o n i cm i c r o s c o p es h o w e dt h a tt h e r a d c i ec e l lo fm a t u r e0 p s e “，“sc 抽p s 括s e e d sw a sf u i l yd i f 协r e n l a t e d ，a l | c e i lo 曜a n e l l e sw e r e 姥o w 纛u pe o m p l e e l ya n de l e 鑫r 孔疆ee o m p l i c 鑫t e ds t f n e 纯f eo fc e l l 。毽a n o l e sw a s n o tc h 毪n g e d a n ym o r e ，a n dt h e r ew e f e1 1 j g hc o n t e n to fm i t o c h o n d r i o nw i t hw e i ld e v e i o p e ds t f u c u r ea n d c l e a rc r j s t aa n do u t e rm e m b r a n e e n d o d l a s m cr e t i c u l u mj nt h ef o r mo fa n n u l a t ei a m e | l a r s t r u c t u r ew a so b s o r v e di nc e 王l sd e s i c c a t e df o r5d a y sa n di tb e c a m em o r ea n d a r g e ra f t 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l e c t r o n i cm i c r o s c o p ea l s o s h o w e dt h a tc e i ln u c l e u s e sw o r es h r u n ka n dm o s to r g a n e l l e sw e r ed i 3 r up t e do rd i m m e di n a 纛i e l ee e l l st h a tw e f e 鑫l l o d 、v 氆n “m e r o u so fv a e 驻o h sa n ds 论f c h 叠f 8 i n s 。 k e yw o r d s ：爿p s c “，“sc 加e ”s 抽s e e d s ；d e s i c c a t i o n - s e n s i t i v ；t y ；s o l u b l es u g a r ；a b s c ；s i ca c i d ； u 1 t r a s t r u c t u r e c h e ns h 疆如n ( s i l v i e h l t 弘r o ) s u p e r v i s e db ya s s o c i a t ep r o f e s s o ry uf a n g y u a n 致谢 y 9 器睡纂嚣 本文是在喻方圆副教授的悉心指下完成的。从论文的选题、试验 方案的裁定、试验枋料钓准备到论文的撰写、修改和定稿镶注了导师 大量的心血。导师渊博的知识、严谨的治学态度、耐心细致的工作作 风时刻感染着我，是我终生学习的榜样。在论文完成之隧谨向恩师致 以最衷心的感谢争诚挚的敬意，感谢导师三年来对我学习和生活上的 照顾，我将在今后的工作岗位上努力工作，以嘲报导师的栽培。 在完成论文蟋整个过程中，南京师范大学分析溺试中心酝冯莹副 教授和顾小天老师以及南京林业大学电镜室的甘习华老师给予了热心 的帮助和细心的指导，在试验材料的准备阶段还得到了邓勇、黄绍承、 葫晓德、秘良谱、宝l 建兵等餐学的热心帮璎，在此一并表示感蘧。 同时非常感谢高捍东教授、沈永宝教授、 c j c 香香老师和龚玉春实 验员在学习及论文除段给予的热心帮助。并对所有关心、支持争帮助 我的老师、同学扣朋友一并表示衷心的感谢f 此外，还特别感谢父母对我学习和生活上的支持。 最后谨向参与本次论文评阂争答辩工馋的各位专家学者致敬i 作者：陈淑芬 二o0 六年六月 1 前言 七叶树( 爿e s c “肠sc 伽e ”5 括) 为七叶树科( 咖p d c 口5 ，盯”c e 盯e ) 、七叶树属的 一种落叶乔木，花期4 5 月，果期9 1 1 月；性较喜光，深根性，适宜温和湿 润环境，也能耐寒，为城镇道路绿化和庭园观赏的优良树种。七叶树具有重要的 药用价值，果实或种子入药，称为“婆罗子”，是畅销国内外的名贵中药“1 。七 叶树木材白色微黄，质地细密、轻软，可供建筑、细木家具、工艺品和造纸等用。 近年来，随着城市绿化对生态功能和景观效果要求的提高，绿化市场越来越 要求树木品种的多样化，有园林珍品之称的七叶树在绿化苗木市场中扮演着重要 的角色。 由于七叶树苗木无性繁殖的技术还不是十分成熟，目前主要采用播种繁殖。 但在生产和试验过程中发现七叶树种子存在以下几方面的问题。 首先，七叶树种子成熟脱落时含水量高，达6 0 以上，且不耐贮藏。因处 理不当而失水会导致种子活力急速下降而丧失种用价值。 其次，由于七叶树种子对贮藏温度和湿度的要求比较严格，国内很少能够将 大批量种子有效地贮藏1 a 以上。对于七叶树种子而言，当贮藏温度低于一5 时 种子会发生冻害。贮藏温度在0 5 时种子又会在贮藏期间萌发。虽然c o n n o r 和s o w a ( 2 0 0 2 ) 对红花七叶树( 爿p s c “f “sp 订v 胁l ) 种子的贮藏温度进行研究后 指出，红花七叶树种子在一2 条件下贮藏两年后，种子仍然保持较高的活力。 但是在现有条件下，一2 这一条件很难严格控制。此外，成熟脱落的七叶树种 子不耐脱水且呼吸代谢旺盛，因此贮藏环境的湿度条件必须严格控制。湿度太大 会导致种子霉烂，湿度太小又会使种子因脱水而劣变。 筇三，七叶树种子种粒大，且个体之间差异很大。成熟的七叶树种子千粒重 可达7 1 0 k g 。种子大小不均匀，成熟脱落时单粒种径最大为4 c m 左右，而最小 的只有1 c m 左右。种子发芽非常不整齐，未经层积处理的种子在适宜的发芽条 件下整个发芽期可持续6 0 1 5 0 d 。 最后，七叶树结实率相对较低，存在明显的大小年现象。 为了减少上述因素对七叶树种子播种育苗的不利影响，探索一条有效控制种 子在贮藏期间劣变的途径，从而延长七叶树种子的贮藏寿命，达到以丰补歉的目 的，本文从七叶树种子脱水敏感性形成机理及种子脱水劣变机理两方面入手，对 七叶树种子不耐脱水的原因进行了系统研究，以期为七叶树种子的科学采收、加 工、贮藏、检验和播种育苗提供理论依据，同时也为其它温带顽拗性种子的研究 提供一定理论参考。 2 文献综述 r o b e f t s ”( 1 9 7 3 ) 裰嚣稀子的贮藏特性及种子对脱水和低濑的敏感程度，将 种子划分为磁常性种予( o r t h o d o xs e e d s ) 和顽拗性种子( r e c a l c i t r a n ts e e d s ) 两大 类。正常性种予在成熟脱落前一般要经历成熟脱水的过程，成熟脱落后台水量低 燕缝装安全戆簿诋裂5 ，甚至5 戳下。藐褰繇瀑，在一1 8 条 孛下缝够爨存 几十年时间n 。贮藏期间，种子寿命与贮藏环境中的温度和湿度闯关系般符合 e l l i s 和r o b e r t 8 “1 ( 1 9 8 0 ) 所建立的种子活力方程。而顽拗性种子在成熟脱落前 不经历或只经历轻微脱水_ j 遘程，成熟脱落时含水激高达4 0 6 0 ，对脱水及低 懑敏感显不瓣跫藏。一鏊矮攒瞧耱子不露要爱过戏熬耱隶郅霹菸发，其中蠢鹫还 疑有胎萌( v i v i p a r i t y ) 现象，如荔枝( 五f f 拍fc 抽p 竹s 妇) 、芒果( 肼口 g 谚m 所们c 口) 和木波罗( 爿，加c 盯伊s 卉8 把，o p y f ，“s ) 种子”。此质发现有些种子虽然能耐一定 糕度脱水，但耐脱水性达不到正常性军申予的水平，并且对低瀑比较敏感，e 珏i s 等口3 ( 1 9 9 g ) 褥这鎏跫藏褥瞧奔子正露镶静予窥顽攒注耱子之鹂豹耱予稼为中满 性种子。 种子的耐贮藏性是由种子成熟过程中脱水耐性的获得( 即内因) 和贮减过程 中g l 起静子老化、劣变的外在因素( 即终因) 嬲者的综合 乍壤敲表现。针对顽攒 橼耱子在贮藏缝痰方面存在的润题，下掰筑静子在成熟过程中戮髓承能力获褥和 成熟后自然脱水造成种子衮老、劣变遮两方面对以往的研究成果进行综述。 2 1 种子在成熟过程中耐脱水性获得机理 脱隶耐瞧( 也称耐聪承往、脱承瓣力或耐干性) 是种子发商过程中获褥豹一 种综合特性哺。它是指种子对低含水爆或脱水的忍耐程度，即植物种子猩脱水 聪的活力或发游率的变化情况，其反谣称为顽拗性或脱水敏感性。 耱予发蠢楚裹等接物生活史中的鬃要除段，可分荛细憝分裂与组织分豫蘩、 觳藏物质积装期和成熟麓。其中，成熟期是指贮藏物质积累中止及脱水开鳓以五 的种予发育过程。在这阶段，种子( 胚胎) 经历成熟脱水过程雨获得耐脱水性， 这个转折过私为大多数高等植物所特有”。 秘予在残熬遘翟孛不叛获褥萎莞承瓣蠖，这零缝蹩稳子发鸯过程孛逐澎鬏玺戆 生理和形态结构变化的结采，其中包括种子发育蔚期一些专性保护物质的合 成。这些与脱水耐性有关的保护性物质主要有糖、强白质和自由基清除系统等， 它们保护亚细胞结构和授予细胞最大的脱水耐性，又称为保护系统，主要脊以下 足方瑟熬蠹鸯： 在成熟的正常性种子中，蔗糖的含量为可溶性碳求纯台物的1 5 9 0 ，单 耱豹含量投徽，离浓疫静嚣还覆毪褡与秘子嚣裁窳瓣往舂关“。凌在一毅试为孬| 脱水蛋白和蔗糖、寡糖及半乳糖环多醇等非还原性糖是种子获得耐脱水性的重要 物质。在玉米、禾谷类种子以及大豆、花生等正常性种子的成熟末期，耐脱水性 的获得与种子中可溶性糖的积累有关。尤其与非还原性糖( 如蔗糖、棉子糖、水 苏糖) 或脱水保护组分( 如半乳糖环多醇系列物质) 有密切的关系，它们在脱水 中起稳定大分子和膜的作用”1 。杨晓泉等1 ( 1 9 9 8 ) 对花生发育过程中耐脱水性 的研究指出，非还原性糖( 二糖及寡糖) 的积累增加了花生蛋白质的热稳定性，稳 定了蛋白质在干燥状态下的结构与功能，促使胚轴或子叶在较高温度进人玻璃化 状态，从而使种子能够抵御脱水的伤害。 在已经研究过的大多数顽拗性种子组织中明显缺乏蔗糖和棉籽糖或者水苏 糖“1 。这些糖类的缺乏可能是顽拗性种子成熟末期不耐脱水的原因之一。但也有 相反的报道，一些顽拗性种子如黄皮( c 胁“s p h ak ”s f “脚) ”“、板栗( c 盯5 r 口n p 口 肌o f ，f s 曲”口) “们种子，在成熟过程中也有可溶性糖的积累，且板栗种子成熟过程 中棉子糖和水苏糖含量的上升和脱落后含量的下降与种子脱水敏感性的变化极 其一致。因此，可溶性糖( 尤其是二糖和低聚糖) 在种子耐脱水性方面所起的作 用值得进一步研究。 2 1 2 蛋白质 研究表明，花生种子的大小和成熟度是引起种子活力差异的主要原因。其中 种子大小造成活力差异的实质是种子中贮藏物质如贮藏蛋白等含量上的差异 “，但与种子耐脱水性关系更为密切的是另外一组蛋白一一l e a 蛋白( 胚胎晚 期富集蛋白) 。 在种子发育后期，贮藏物质积累达到高峰后，种子开始脱水，这时有一类基 因特异性地表达，产生一类低分子量蛋白，称为胚胎晚期富集蛋白。由于l e a 蛋白出现在正常性种子发育晚期的脱水过程中，而且常伴随着种子耐脱水力的形 成，故认为它们与种子耐脱水力形成有关”。目前已经在发育的棉花、豌豆、大 豆、油菜、胡萝h 、蓖麻籽、拟南芥和一些禾谷类的种胚中检测出l e a 蛋白。 l e a 蛋白具有很高的亲水性和热稳定性，在成熟种子中的比例很高，一般认为 它们的功能是在脱水过程中保护细胞组织免受因脱水而产生的机械损伤，并与种 子耐脱水性形成有关。l e a 蛋白有助于细胞维持最小的需水量，因为其中一些 蛋白质能够和水分子结合，他们可以起到捕获和隔离脱水过程中聚集离子的作 用。在细胞缺水时，l e a 蛋白可能协助糖扮演维持细胞质结构这一功能。这些 蛋白质被认为是比蔗糖更好的保护剂，因为它们不会结晶。但r o b e r t s o n 等“” 认为豌豆种子发育中脱水素合成与耐脱水性之间没有关系。 顽拗性种子是一类对脱水敏感的种子，脱水会造成顽拗性种子活力和寿命急 剧下降。顽拗性种子在发育后期不经历或只经历轻度成熟脱水过程，成熟脱落时 不耐脱水。其种内是否含有l e a 蛋白有不同的报道，f a r r a n t 等”6 1 ( 1 9 9 3 ) 报道， 海榄雌和享氏罗汉松种子中不存在l e a 蛋白。刘箭等”( 1 9 9 8 ) 对黄皮种子的 耐脱水性进行研究后也得出了类似的结果。而f i n c h - s a v a g e 等用棉花 l e a d l lc d n a 探针检测了5 种顽拗性种子中含有l 卧蛋白，结合体外翻译证明 英国白栎和欧洲栗种子中存在脱水素( l e a 蛋白的一种) ，而且英国自栎特异 m r a n 还能为有限度的脱水和a b a 所诱导“，f a r r a n t 等”( 1 9 9 6 ) 也检测到澳 大利亚栗籽豆的胚轴和子叶中存在l e a 蛋白，且脱水能够促进窄叶孤种子中积 累脱水素“。因此，顽拗性种子成熟末期不耐脱水是否与l e a 蛋白缺乏有关还 有待进一步研究。 2 1 3a b a 在种子和其他植物体中，a b a 的主要作用是调控基因表达。a b a 会诱导几利， 不同蛋白质的合成，这些蛋白质在种子发育过程中起着重要的生理作用。a b a 作为调控基因最典型的例予是l e a 基因的表达，它在种胚成熟后期表达，也在植 物体对各利，环境胁迫做出应答时表达。有证据显示，脱水时应答l e a 蛋白的表达 是由于其化学特性的专一性( 起到隔离离子、保护其他蛋白质和膜结构片：状蛋白 的恢复的功能) ，而a b a 可能正是l e a 基因表达的内源调节者“。但是，s t i l l 等报道，在a b a 含量还很低时，水稻和野生稻胚轴中已经有脱水素合成。脱水素 或其m r n a 的起始合成和后续量的增加并不需要高浓度的a b a ，在发育过程中脱 水素和其m r n a 表达与a b a 之间并无相关性“。 有关a b a 在顽拗性利一子巾所起的作用，许多学者进行了相关方面的研究。 n e d e v a “73 等( 1 9 9 7 ) 认为，顽拗性种子不耐脱水，不能产：生l e a 蛋白，是由于 其缺乏a b a ，或对a b a 不敏感。彭业芳等”“( i 9 9 5 ) 在已经成熟但尚未采收的 荔枝和龙眼( e “p o r 砌，o ”z d 月) 种子中也检测到a b a ，但是a b a 含量不到高峰 时的1 6 ；而目随着种子发育，种子及其胚轴对外源a b a 的敏感性亦持续下降， 与其成熟时不耐脱水相一致。姜孝成等。”( 19 9 7 ) 对发育中的黄皮种予研究后指 出，a b a 也能促进发育后期黄皮种子巾蛋白质特别是胚轴中2 0 k d 热不稳定蛋白 的合成，但对2 0 k d 的热稳定蛋白和其它蛋白的调控作用则几乎没有或看不到， 因此成熟的黄皮种子对脱水较敏感。但究竟顽拗性种子不耐脱水是否与其种内缺 乏a b a 或种子本身对a b a 不敏感问有必然的联系，还有待于更深入的研究。 总之，种子的脱水耐性受细胞自身的保护系统所调控，以避免细胞膜、蛋白 质和细胞质等成份受到脱水伤害。种子表现为细胞、亚细胞结构和物质代谢水平 发生变化以适应脱水。这一保护系统包括受a b a 调控的i 。e a 蛋白、非还原性糖 的积累和脱水过程中防止、忍耐或修复自由基攻击的抗氧化剂和酶等。这些保护 机制都不能单独解释耐脱水性的原因，它们在脱水过程中可能有同等重要的作用 ”，缺少一种或几种机制都可能使不同种子具有不同程度的耐脱水性”。 2 2 成熟种子在脱水老化过程中的劣变机理 种子在脱水过程中会发生一系列的老化、劣变反应。其中细胞膜被认为是脱 水引起细胞损伤、死亡的原初位点。脂质过氧化中间产物( 如d j 、h ：d 2 、- 衄 等) 一方面能连锁地引发脂质过氧化作用；另一方面又能使蛋白质分子脱去h + 和发生加成反应，生成鬣白质分子的聚合物。脂质过氧化终产物m d a ( 丙= 醛) 可与蛋白质绐合，使蛋白质( 酶) 的结构发生变化和催化功能设失；降低膜脂的不 滚秘瘦帮黩蕊滚动墼至，馁蒺爨透蠖邀大、渗潺秘臻多，缨萤绞染趣映：最终导致 种子劣交、毵亡。而糖类，尤其是二糖和低聚糖可以有效阻止脱东；| 超膜结构的 破坏。 2 。2 。l 膜缝搦 一般认为细胞膜是脱水引起细胞损伤、死亡的原初位点。电镜观察表明，脱 水引起细胞膜结构的变化，包括细_ | ) 色! 膜结构蛋白被排出膜脂医域、膜磷脂的双层 摊列状态转变为六角形排列状态以及膜磷脂由流动相交为凝胶糖。膜结构的这些 交讫酸坏了缩寇簇戆半逶往，壹接影旗其渗透溺节功链豹弧雩亍“”。 磷脂是细胞膜的主要成分，有凝胶状态和液晶状态两种存在方式。在一定条 件下，这两种状态会发生相互转变。这些条件包括膜自身的缎戍、温度、水合状 态及细胞膜周围溶液的成分和状态等”。 在裰瘦脱求情况下，麓承对骥绪构损 1 9 i 的稳震主要与袋翡缀成有关。翔采双 屡膜间有小分子溶质存在则可有效防止膜结构由流动相转变为凝胶相。而可溶性 糖正好是这样一类理想的小分子溶璇，但有关可溶性糖的作用方式尚存争议。 o l i v e r 等”( 1 8 ) 认为在聪水过程中，糖溶液的玻璃化熊隰止t m ( 朕楣变滠 攫) 静男高，推颧藉翡t g ( 玻璃纯澄度) 与箕疆囊t m 舟高弱麓力有必然瓣联系； 而c r o w e 等”7 1 ( 1 9 9 8 ) 却认为，是糖蹙物质的渗遗效应和体积效应限制了t m 的 升高，与糖类的玻璃化无关。 可溶性鞭能阻止骥孵囊渡魂娟转变为凝腔巷鞋。“，但不两类型浆糖所越的终鼹 如何，不同的学者也持餐不同的观点。c f o w e 等“”( 1 9 9 8 ) 认为在脱承过程中二 糖酰胺( 如海藻糖酰胺和蔗糖酰胺) 能够使二棕榈酰磷脂酰胆碱( d p p c ) 的t m 降至t o ( 纯磷腊的相交温度) 以下，这不是由于糖溶液玻璃化的结果，而是这 塑糖分子援入裂磁邻戆爨分子阕戆络暴；毽还豢囊援入裂嚣樊分子阉黪分子必须 有一定大小的体积，像葡萄糖这样的单糖酰胺，由于其分子体积比二糖酝黢的小， 即使捅入到脂类分子间也达不到像二糖酰胺那样插入脂类双层结构而使膜面积 延展的程度，也就不能降低脱水状态下d p p c 的t m 。但k 0 8 t e r 等”( 1 9 9 4 ) 认 为单塘( 黧繇莓糖) 与二耱( 热海藻骧) 黎可懿遴过在鼹双鼷之润形残毅璃态嚣 使得脂类的相交温度降低至t o 以下，只不过是着组成脂双层的t o 是否低于葡萄 糖溶液的玻璃化转变温殿( t g ) 。 除了糖类物质外，些两性物质如黄酮醇、苯酚、类黄粥和生物碱也被认为 在隧壹麓承孳| 起t m 舅麓方覆超鬟耋要稳季# 蠲”。 2 2 2 脂类和抗氧化系绕 脂质过畿化被认为楚正常性释予加速衰老、劣变鲍主要爨因之一。一些研究 滚鞠，精震j 筵氧纯对顽搬经穗子氇鸯类经豹影桶。s m i 氇帮8 e f j a l c “蟠1 9 9 5 ) 试为， 顽拗性种子活力丧失与自由基伤害有关，其中脂质过氧化是种子老化的主要原因 之一。而在细胞膜氧化代谢和脂质过氧化过程中，与除去有毒中问产物有关的酶， 可能在耐脱水方面起着重要作用。“，如细胞色素氧化酶( c c o ) 、超氧化物歧化 酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 等。脂质氢过氧化物和m d a 分别是膜脂过氧化的中间产物和终产物。脂质氢过氧化物不稳定，能自发地或在 过渡金属离子催化下发生均裂形成脂性自由基。这些自由基非常活泼，一方面能 连锁地引发脂质过氧化作用；另一方面又能使蛋白质分子脱去h + 和发生加成反 应，生成蛋白质分子的聚合物。m d a 除了可作为衡量种子发生脂质过氧化程度 的指标外，其自身对植物细胞也有毒害作用，它能降低s o d 、c a t 和p o d 的活 性、加剧细胞膜脂过氧化，与蛋白质结合、使蛋白质( 酶) 的结构发生变化、催化 功能丧失，降低细胞膜脂的不饱和度和膜的流动性、使膜的透性增大等。顽拗性 的欧洲白栎( q “e r c “sr 0 6 “，) 种胚在脱水过程中，种胚生活力丧失与其细胞中自 由基增多、细胞质浓度增大、水介质流动性降低及细胞膜渗透功能丧失相伴发生 ”“。种子耐藏性增强的重要原因是抗脂质过氧化系统的完好保存，并有效地保护 膜脂免受活性氧的袭击”“。宋松泉”( 1 9 9 7 ) 对脂质过氧化与黄皮种子生活力关 系的研究中发现，d 0 c ( 二乙基二硫代氨基甲酸钠) 、m d a 和f e “能够促进脂质 过氧化、降低种子生活力，而抗坏血酸和甘露醇则可以抑制脂质过氧化，提高种 子活力。 2 2 3 糖 可溶性糖，尤其是二糖和低聚糖是一类化学性质稳定的小分子物质，它们可 以通过自身的渗透效应、体积效应及玻璃化作用等方式保护细胞组织免受脱水的 伤害。有关可溶性糖在保护细胞组织方面的作用已经得到了广泛的研究，但归纳 起来主要有以下几种： ( 1 ) 水分替代水分不仅是一种溶剂，而且是细胞的稳定因子。膜及大分子 的稳定性完全依赖于亲水基团与疏水基团之间的相互作用，特别是膜的液晶态依 赖于水分的存在”1 。脱水可使细胞膜的磷脂双分子层相互叠加或堆积，致使膜系 统化学反应紊乱与膜渗调功能丧失。当脱水的细胞失水时，二糖( 海藻糖或蔗糖) 可以取代水分子与膜脂的极性头端结合，充当了膜脂极性头端之间的衬片，避免 了膜脂的叠加与堆积，从而稳定了膜结构。”o “。单糖属于还原性糖，它的存在 是代谢旺盛的标志。在极度干燥的条件下，单糖参与了一种称为m a i l l a r d 反应的 非酶化反应。”，这种反应需要氨基基团的参加，从而导致蛋白质变性，因此在极 度脱水环境中单糖可能起不到保护细胞结构的作用。 ( 2 ) 稳定蛋白质细胞脱水不仅影响膜系统，也会影响细胞质。细胞质的极 度干燥可以导致蛋白质的变性与溶质的结晶，进而对整个细胞造成损伤。而可溶 性糖( 主要指蔗糖) 可促进细胞质玻璃化，其中寡糖亦可提高细胞质的t g ，使种 子或胚轴在较高温度进入玻璃化状态，从而避免脱水对细胞造成的伤害”1 。 ( 3 ) 清除自由基植物在遭受逆境时，正常的代谢过程被打乱，植物体内会 发生系列的歧化反应而产嫩大量的自由基。蔗糖、半乳糖环多醇系列物质的存 在可以协助s o d 、p o d 、c 斛一起及时清除细胞体内迅速积聚的多余自由基， 镬绥熬兔受蠡囊蔟弱攻击。 此外，糖还能与高亲永憾的l e a 蛋囱形成复合物协同控制脱水速度，作为 水的缓冲剂起到保护种子的作用”1 。 综上所述，派常性种子在成熟过程中耐脱水性的获得与成熟束期非还原性糖 兹获豢、a b a 夔台藏、l e a 鬣鑫戆影或戳及撬氧化系绫兹完好绦存密韬耱美。 此外，正常性种予成熟末期臌内去分化程艘也是影响种子耐脱水健的重要原因之 一【2 ”。顽拗性种予成熟脱落时对脱水和低温敏感，可能是由于缺乏其中一种或几 种枫制。因此，对颁攒性珊予磺究豹过程中必须充分考虑各静可能影响矛 子脱水 蠹| 毽戆琢困，焉不能用菜一耱鬻素蕊鸯燹泉黠静子静“瓣慰东程度筵乏行译嫠。 种子在遭受逆境时能否存活关键取决于其耐性和抗性两方面因素。耐性悬种 子在发育过程中逐步形成的内在的、固有的特性；抗憔则是种子程遭受逆境时种 子内潜在豹菜些搬剁能否及对寤动的特健，如糖、抗戴纯系统、绷腿器结构的变 纯等。医藏，对耱子髂聪承辩镶静形成瓠壤迸幸亍硪究瑶蔽了簿秘予不纛章袋采豹麟 因。而对种子脱水过程中细胞内含物的变化、抗氧化系统的作用及细胞器结构的 变化镣方面的研究则可以进步了解细胞在遭遇逆境时的应激能力。综合两方筒 静砺究结果将为铡定正确的贮藏策略靼逶巍的贮藏方法提供一定鹣理论参考，铁 丽秀指导生产服务。 3 材料与方法 3 1 试验材料 3 1 1 研究七叶树种子成熟过程中脱水敏感性形成机理所用材料 为方便表述，本文用盛花期后天数( d p a ) 表示七叶树种子生长时间。根据 2 0 0 4 年和2 0 0 5 年对南京林业大学校园及树木园内七叶树开花时间的观察结果来 确定d p a 。以绝大部分花谢落时的一天规定为d p a1 ，依次顺推。 七叶树种子形态特征如右图所示。整个种子 由胚和种皮两部分组成，其中胚包括子叶、胚 轴、胚根等部分，但本文中的“胚”或“种胚” 是指去子叶后剩余的种胚部分，即包括胚根、 胚轴等在内的种胚部分。 2 0 0 4 年度七叶树种子采自南京林业大学校 园内。自d p a ( 盛花期后天数) 9 5 ，即2 0 0 4 年 8 月1 1 日开始，每5 d 采一次样，每次采3 0 5 ( ) 个果实，采回后立即对果径、种径、果重、 种重及种予含水量进行测定。 2 0 0 5 年度七叶树种子采自南京林业大学树木园，树龄约为3 0 a 。自d p a6 0 即2 0 0 5 年7 月5 日起，每10 d 采次样，每次采3 0 5 0 个果实，其中取3 l o 个果实用于测定果重、果径、种重、种径及种子含水量( 材料同时可用于洲定种 子淀粉、可溶性糖含量) ，另取3 5 个果实贮于一3 0 低温冰箱中，用于种子激 素含量的测定。 3 1 2 研究成熟七叶树种子脱水劣变机理所用材料 2 0 0 4 年度七叶树种子购于河南省栾川县，为防止种子失水，种子在运输过 程中用湿木屑贮藏。种子运抵实验室后迅速将其从湿木屑中分离出来，然后用自 来水多次冲洗。冲沈干净的种子用o ，5 的次氯酸钠溶液消毒1 0 m i n ，流水冲洗 4 0 m i n 后平铺在干净的试验台面上，等种皮水分晾干后开始取样，取得的样品作 为脱水o d 的试样，其余种子于室温条件下( 2 0 2 5 ) 继续脱水，期间分别取 脱水1 、2 、4 、6 、8 、1 0 、1 2 、1 5 d 的种子，对其进行各种指标的测定。 2 0 0 5 年度七叶树种子购自湖北省鹤峰县，由于种子运输时问比较短，运输 期间没有对种子进行湿臧，种子运抵实验室后部分种子明显失水，因此给研究工 作造成了一些不利影响。对此我们对种予进行了回水处理。种子运抵实验室后立 即进行冲洗、消毒。消毒过的种子在室温( 2 0 2 8 ) 条件下，用自来水浸种 3 6 h ，使脱水的种子能够充分回水。将回水后的种子置干净的试验台上，待种皮 水分晾干后分为2 份。一份于室温下置干净的实验台上继续脱水，期间分别取脱 水o 、3 、5 、7 、9 、1 1 d 的种子，用于测定种子在自然脱水过程中发芽率及细胞 结构的变化；另外一份取种胚，于3 5 恒温鼓风干燥箱中脱水，期间取脱水0 、 3 、6 、9 、1 2 h 的种胚，用于测定种胚在快速脱水过程中生活力、电导率及细胞 结构的变化。 3 2 试验方法 3 2 1 七叶树种子成熟过程中形态特征及内含物含量测定 3 2 1 1 形态特征测定 景径、掸径嬲? 取3 个重复，每个重复1 0 1 5 粒种子，用游标卡尺分别从横、 纵两个方向测定果径、种径，精确到0 o l c m 。测得的结果取平均值，代表陔取 样时间果实及种子的大小。 果重、秽重雅j 取3 个重复，每个重复l o 15 粒种子，于精度为o 0 0 l g 的天 平上称量各重复中果实及去果皮后种子的总重量，通过下式计算出单粒果重、种 重。各重复计算结果取平均值，作为该取样时间新鲜果实及种子重量。 单粒果重：墅 h 其中：w f 为各重复内果实的总重量( g ) n 为各重复内果实或种子粒数。 3 2 1 - 2 种子含水量测定 单粒种重：坠 n w s 为各重复内种子的总重量( g ) 参照g b 2 7 7 2 一1 9 9 9 林木种子检验规程”中含水量的测定方法，并稍做 改动。取3 个重复，每个重复3 5 粒种子，将种子切成薄片后置于已经烘干且 称过重的铝盒内，于8 0 恒温条件下烘至恒重，通过下式计算种子含水量： 印警等 。 1 、 其中：c f 为以鲜重为基础计算的种子含水量( g - g 一f w ) ；c d 为以干重为基 础计算的种子含水量( g g d w ) ；w f 为种子鲜重( g ) ：w d 为种子干重( g ) 。 3 2 1 3 种子中可溶性糖含量测定 参照邹琪”( 1 9 9 5 ) 及姜孝成”( 1 9 9 8 ) 可溶性糖含量测定的方法。 律名据段：取0 2 9 干样品( 胚或子叶) 粉末，以3 0 m l g “的比例加入8 0 乙 醇，于8 0 恒温水浴中振荡提取3 0 m i n ，冷却离心后将上清液倒出，残渣用同样 体积8 0 乙醇重复提取2 次，合并上清液；上清液于8 0 水浴中将乙醇蒸干， 然后用蒸馏水定容至1 0 m l ，用于可溶性糖含量的测定，每个样品做3 个重复。 膨劳含量嬲，参照李合生“叫( 2 0 0 0 ) 的方法，采用蒽酮比色法测定总糖含量。 在试管中依次加入2 0 “l 糖粗提液、1 9 8 m l 双蒸水、0 5 m l 葸酮乙酸乙脂( 1 9 蒽酮溶于5 0 m l 乙酸乙脂) 、5 m l 浓硫酸，充分摇匀后立即放入沸水浴中准确保 温1 m i n 后取出，于凉水中冷却至室温，以不加糖粗提液的反应液做空白对照， 在6 3 0 n m 波长下测定其吸光值。采用同样的步骤，以1 0 0 “g m l “的葡萄糖标准 液代替酶液，制作标准曲线，并求出标准曲线方程。则： 可溶性栅含量( 。) = 诿器1 0 0 可溶性糖含量( f ) = 而五面篙1 0 0 其中：u 为从回归方程求得的糖的量( g ) ；v t 为提取液总量( m l ) ；v s 为反应液中加入的粗糖液体积( m l ) ；w 为样品干重( g ) ；c w 为相应时间胚( 子 叶) 鲜样含水量( g g d w ) 。 可磬拦帮留分岔鸯施，启? 采用高效液相色谱法。所用仪器为w a t e r s 液相色谱仪 ( h p l c ) ；检测器采用示差折光检测器：色谱柱为z o r b a x n h 2 ( 4 6 m m 2 5 0 m m ) 柱，柱温3 5 ；流动性为乙睛：水= 7 0 ：3 0 ( v v ) ，流速1 5 m l m i n ；上样量 为5 u l 。同样的测定条件下，通过标样确定不同糖的保留时间，并制作标准曲线， 求出标准曲线方程。则： 糖分含量( ，蜡。g d ) = 语淼1 0 0 0 其中：u 为从回归方程求得的糖的量( 肚g ) ；v t 为提取液总量( l ) ；v s 为 迸样量( 吐) ；w 为样品干重( g ) 。 3 2 1 4 种子中淀粉含量测定 参照许昌杰等【“1 ( 1 9 9 8 ) 的方法，并加以改进。采用1 2 一k i 染色法测定淀 粉含量。将提取可溶性糖后剩余残渣中的乙醇蒸发掉，加入8 0 c a ( n 0 3 ) 2 溶 液8 m l ，于沸水浴中振荡提取4 0 m i n ，冷却后离心，将上清液倒出。残渣用同样 体积8 0 c a ( n 0 3 ) 2 溶液重复提取2 次，合并上清液，并用8 0 c a ( n 0 3 ) 2 溶液定容至5 0 m l 待用。在试管中依次加入1 9 札8 0 c a ( n 0 3 ) 2 ，10 0 “l 淀粉 粗提液，l0 0 u l o 0 l m o l l - 11 2 一k i 溶液，并用同样体积的蒸馏水代替淀粉粗 提液做空白对照，于6 0 0 n m 条件下比色，测定吸光值。同样方法，