（无机化学专业论文）copc性质的光谱研究.pdf

摘要元素铜是从人类到细菌所有生物体得以生存的必须微量元素。由于铜离子特有的化学性质( 氧化态c u 2 + 还原态c u + ) 使的铜离子可以在生物体生长发育中作为氧还蛋白辅因子。铜离子参与的反应也产生高活性氧( r o s ) 包括羟基游离基。它能够使细胞脂膜蛋白过氧化、切割核酸分子而损坏细胞。高度毒性的营养元素铜在细胞的吸收及细胞内的定位是一个准确协调的过程。铜的体内平衡是由多个蛋白协调作用以确保将其运输到特定的细胞器或靶蛋白，此过程中分子伴侣蛋白扮有重要角色。c o p c 是假单胞菌体内铜调控蛋白之一。n m r 和e x a f s 研究表明c o p c 在溶液中呈现由9 股b 折叠围成的桶状结构。两个相距约为3 0a的铜( i ) 、铜( 1 1 ) 结合部位位于桶状结构的两端。c o p c 是否具有分子伴侣的生物学功能? 是否只是专一性的结合铜离子? 与铜结合有多强? 以及疏水性通道是否具有生物功1 f l y , ? 有关这些问题均未见文献报道。为了研究解决上述问题，我们做了如下工作：1 利用分子生物学法、离子交换法表达纯化了大量的纯度较高的a p o c o p c ，并经过聚丙烯酰胺电泳、液相色谱，质谱，紫外光谱加以鉴定。2 应运荧光、紫外光谱测定了a p o c o p c 与铜( i i ) 、汞( i i ) 、银( i ) 等离子的相互作用。结果表明a p o c o p c 与铜( i i ) 高亲和性结合，荧光光谱显示a p o c o p c 不与锰( i i ) 、铁0 1 ) 、钴( i i ) 、镍( i i ) 结合，和h g ( i i ) 结合较弱，与a g ( 1 ) 也存在一定的结合。从热力学数据得知，c o p c 高亲和性、一定程度上专一性结合铜( i ) 、铜( i i ) ，生物体内可能具有铜调控功能。3 按照蛋白质变性的两态机理计算了c o p c 的结构稳定化能。发现铜f 1 1 ) 对c o p c 的结构具有稳定作用。按照f 6 s t e r 无辐射能量转移原理计算了c u l l _ c o p c 中c u 2 + 与色氨酸残基问的距离r = l1 6 a 。4 以芘丁酸( p y ) 、盐酸吡哆辛( v b 6 ) 为探针研究了a p o c o p c 的超分子性质。结果显示a p o c o p c 可以与一个或多个小分子结合。其条件结合常数大于1 0 4 m o l l 。关键词c o p c ；分子生物学；光谱研究；超分子：金属离子a b s t r a c ta b s t r a tc o p p e ri sa ne s s e n t i a lt r a c ee l e m e n tr e q u i r e df o rs u r v i v a lb ya l lo r g a n i s m sf r o mb a c t e r i a lc e l l st oh u m a n s c o p p e ri o n su n d e r g ou n i q u ec h e m i s t r yd u et ot h e i ra b i l i t yt oa d o p td i s t i n c tr e d o xs t a t e s ，e i t h e ro x i d i z e d【c u ( i i ) o ri nt h er e d u c e ds t a t e 【c u ( i ) 】，a n dt h e ys e r v ea si m p o r t a n tc a t a l y t i cc o f a c t o r si nr e d o xc h e m i s t r yf o rp r o t e i n st h a tc a r r yo u tf u n d a m e n t a lb i o l o g i c a lf u n c t i o n st h a ta r er e q u i r e df o rg r o w t ha n dd e v e l o p m 6 n t w h i l ec o p p e ri se s s e n t i a l ，i ti sa l s oap o t e n tc y t o t o x i nw h e na l l o w e dt oa c c u m u l a t ei ne x c e s so fc e l l u l a rn e e d s c ui sr e a d i l yp a r t i c i p a t e si nr e a c t i o n st h a tr e s u l ti nt h ep r o d u c t i o no fh i g h l yr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) i n c l u d i n gh y d r o x y lr a d i c a l h y d r o x y lr a d i c a l sa r eb e l i e v e dt ob er e s p o n s i b l ef o rd e v a s t a t i n gc e l l u l a rd a m a g et h a ti n c l u d e sl i p i dp e r o x i d a t i o ni nm e m b r a n e s ，d i r e c to x i d a t i o no fp r o t e i n s ，m a dc l e a v a g eo fd n aa n dr n am o l e c u l e s i ti sh i g h l yo r c h e s t r a t e dt h a th i g h l yt o x i na n dn u t r i t i o ne l e m e n tc o p p e rw a su p t a k ea n dd i s t r i b u t i o ni nc e l l s c o p p e rc h a p e r o n e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o c e s so fc o p p e rt r a n s p o r t a t i o na n dd i s t r i b u t i o ni nc e l l s c o p ci so n eo ff o u rc o p p e rr e g u l a rp r o t e i n si np s e u d o m o n a ss y r i n g a ep a t h o v a rt a m a t o i ns o l u t i o nc o p ca d o p t saf o l de s s e n t i a l l yc o n s t i t u t e db yn i n e1 3 - s h e e tf o r m i n gab a r r e lm o t i fw h i c hb o t hn - - t e r m i n a la n dc - t e r m i n a lc a nb i n dt oc u ( i i ) a n dc u o ) ，r e s p e c t i v e t h et w oc o p p e rb i n d i n gs i t e sa r ea b o u t3 0aa p a r t a 1 lo f t h e s eh a v eb e e nc o n f o r m e db yt h em e t h o do f n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c ea n de x t e n d e dx r a ya b s o r p t i o nf i n es t r u c t u r es p e c t r o s c o p y w h e t h e ro rn o tc o p cc o u l da c to nm e t a l l o c h 印e r o n ei sn o tk n o w nn o w i no r d e rt or e s o l v et h i sp r o b l e m ，t h ef o l l o w i n gw o r kw a sd o n ei nt h i sp a p e r ：1 p l e n t yo fh i g h l yp u r ec o p cw a so b t a i n e db ym e a n so fm o l e c u l a rb i o l o g ya n dc a t i o n 、a n i o nc h r o m a t o g r a p h y i tw a sc h e c k e db ys d s - p a g e 、g e lf i l t r a t i o n 、m a s ss p e c t r aa n du v a b s o r p t i o ns p e c t r u m 2 t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nc o p ca n dc u ( n ) 、h g ( i i ) 、a g ( i ) a n ds oo nw e r et ia b s t r a c ti n v e s t i g a t e d ，u s i n gf l u o r e s c e n c ea n du v - v i ss p e c t r a t h er e s u l t ss h o wt h a tc o p cc o u l dh i g h l ya f f i n i t yb i n dt oc u ( i i ) t h ef l u o r e s c e n c eo fc o p cc o u l dn o tb eq u e n c h e db ym n ( 1 i ) 、c o ( n ) 、f e ( i i ) a n dn i ( i i ) w h i c hm a yb ei m p l yt h a tc o p cc a n tb i n dt ot h e m t h ec o m p l e xo fc u - c o p ci sm o r es t a b l et h a no n e so fb e t w e e nc o p ca n dh g ( i i ) o ra g ( i ) a l lt h e s es u g g e s tt h a tc o p cc o u l ds p e c i a l l yb i n d i n gt oc u ( i i ) 3 t h es t a b l ee n e r g yo fc o p ca n dc u i i - c o p cw e r ec a l c u l a t e da c c o r d i n gt ot w os t a t e sm e c h a n i s m t h ef o r mo fc u n - c o p ci sm o r es t a b l e t h ed i s t a n c eb e t w e e nc u ( i i ) a n dt r y p t o p h a nw a sa l s oc a l c u l a t e di nt h el i g h to ff o s t e rn o n r a d i a t i o ne n e r g yt r a n s f e rt h e o r ya n di ti sa b o u t11 6 a 4 u s i n g4 - ( 1 - p y r e n y l ) b u t y r o y la c i da n dp y r i d o x i n ea sp r o b e s ，t h es u p p e rm o l e c u l a rp r o p e r t yo fc o p cw a ss t u d i e d o n eo rs e v e r a ls m a l lo r g a n i cm o l e c u l a rc o u l d b eb o u n db yc o p c ，a n dt h ec o n d i t i o n a lc o n s t a n t sa r em o r et h a n10 4 m o l i ，k e yw o r d sc o p c ；m o l e c u l a rb i o l o g y ；s p e c t r a ls t u d y ；s u p e rm o l e c u l a r ；m e t a l i o n s第一章综述第一章综述许多年来，铜被认为是从人类到细菌所有生物体得以生存的必需微量元素。由于铜离子特有的化学性质( 氧化态c u ”还原态c u + ) 使的其可以在生物体生长发育中作为氧还蛋白辅因子。如表1 1 ，含铜蛋白涉及到许多生化过程。这些酶的缺陷或失活会引起生物体生理上的异常。据估计，人每天从富含铜的食物f 如豆科作物、牛肉、鱼贝类) 中摄取0 6 到1 6 m g c u 。铜被吸收并介导到靶蛋白，多余的铜被排出体外。表1 1铜结合蛋白名称生物功能缺陷表现c u z ns o d降解自由基氧化损坏细胞器细胞色素c 氧化线粒体中电子传递缺乏a t pm y o p a t h ya t a x l a酶s e i z u r e赖胺酰氧化酶弹性蛋白和骨胶原的胶联组织连接症状，血管破裂，扭曲多巴胺b 羟化酶产生儿茶酚胺皮肤关节松弛，气肿，下丘脑失衡酪胺酸酶产生黑色素白化肽基甘氨酸单加荷尔蒙生物激活几种肽荷尔蒙失活氧酶血浆铜蓝蛋白亚铁氧化酶，铜的输运贫血凝雪因子v 、血液凝固易于出血血管生成素诱导生成血管血管不发育金属硫蛋白铜螯合作用铜中毒朊病毒目前不知其功能，结合铜，可改变睡眠方式，昼夜节律，能与铜的吸收有关库鲁病，克雅氏病，格史氏症，失眠b 淀粉状前体蛋白目前不清楚家簇a l z h e i m e r 病h a p h a e s t i n小肠铁排出连锁性贫血很清楚，铜足必需的。铜在细胞内过量积累对细胞是有毒的。由于与铁具有相近的化学性质，铜离子参与的反应也会产生高活性氧( r o s ) 包括羟基游离基”。它能l! ! 匹笪堕堕堂堕竺基够氧化脂膜蛋白、切割核酸分子而损坏细胞。实际上，r o s 的产生和反应是关于癌症神经系统疾病以及衰老的主要因素。除了产生r o s ，铜也可以取代蛋白中的辅基而表现毒性。例如，c u ( i i ) 替代人类雌激素接受底物d n a 锌指结构域中的z n ( i i ) ，蛋白不能与靶d n a 结合。这将影响荷尔蒙依赖性信号在体内的转导 2 1 。铜离子能替代细胞内多种蛋白中的催化活性部位或结构模体中的金属离子。生物体能够从营养物质中吸收铜，运输其跨膜，并转到靶蛋白。因此生物体必定有阻止铜积累到毒性水平的调控机制，这其中涉及到多种铜分子伴侣蛋白( 表1 2 ) ，分子伴侣就是一类保护c u ( i ) 免于损伤细胞并且将其转运到目标酶的一类蛋白0 6 】。维持这个重要的平衡在于不发生两种与铜转运有关的基因病( m e n k e s 和w i l l s o n 病) 3 _ 8 l 。保持体内铜平衡的关键是铜吸收、细胞内的定位、解毒和排出。基于这一观点，我们聚焦于铜的摄取、细胞内的定位以及在整个生物体不同组织间的分配。1 1 生物体对铜的吸收1 1l 细菌及酵母对铜的吸收通过对格蓝氏阳性菌、e - h i r a e 铜摄取的研究，已经对这一过程提供了极好描述。e h i r a e 操纵子含有四个基因：c o p y 、z 、a 和b ，对铜的平衡有重要作用0 1 。c o p a 、c o p b 蛋白是整合于膜上的p 型a t p 酶。二者对于调控低浓度时铜运入，高浓度时铜运出是重要的 l “。c o p b 是目前唯一被证实的运输多余与积累的c u ( i i ) 和化学性质相近的a g ( i ) 进入重组膜泡囊的运铜蛋白i l ”。与这一生物功能一致，c o p b 基因损坏的e - h i r a e 对铜高敏感。c o p b 蛋白的n 一端有三个重复的可能结合金属的序列m x h x x m s g m s h s 。这样的序列在假单胞菌s y r i n g 细胞铜结合蛋白中也存在。c o p a 只有一个铜结合序列g m x c x x c ，这在多种铜结合蛋白中也存在。这一序列被认为在铜转运和定位过程中的金属结合位点。c o p a 基因损坏的大肠杆菌b h i r a e )对铜的抵制没有明显影响，然而与铜的摄取功能一致的是c o p a 基因损坏的细胞在铜离子螫合剂存在的介质中，三天后停止生长。可能是由于铜稀少的情况下不能被运输进细胞内 6 1oc o p 操纵子的表达受铜浓度和阻止子c o p y 和c o p z 的调控。c o p z可能具有分子伴侣的功能，属于极为保守的分子伴侣家簇，在人体或酵母( h a i l l ，a t x l ) f l5 , 1 6 1 他可能转运铜到铜转运a t p 酶。 - 5 细胞周质中的铜浓度较高时，结合2 个c u ( i ) 的c o p z 专一的将铜转运到c o p y 以替代其内的z n ( 1 1 1 ，继而c o p y 由d n a 上脱落，c o p 操纵予进行表达( 图11 ) 1 1 7 - 1 9 1 。这些对原核生物的研究对于理解铜转运分子学机制很有价值，并且对于理解真核生物的这类体系奠定了基础。第一章综述表1 2 几种铜分子伴侣蛋白n os i z ec e l l u l a rp r o t e i nc u ( i )( r e s i d u e s )l o c a t i o nt a r g e tp r o t e i nm e n k e s s ，w i l s o n h a h l16 8c y t o p l a s msp r o t e i ns u p e r o x i d ec c s l22 7 4c y t o p l a s md i s m u t a s ec y t o c h r o m ecc o x l 7c h a p e r o n e26 9c y t o p l a s mo x i d a s ea t x l17 3c y t o p l a s mc c c 2s u p e r o x i d el y s 712 9 4c y t o p l a s md i s m u t a s ec o p z16 9c y t o p l a s mc o p yi n t e m a lc o p am e m o r a n ep - t y p e - a t p a s ei n t e r n a lc o p bc o p p e ri o nm e m b r a n ep u m pp - t y p e - - a t p a s e4 r c t e r mp l a s m aa t r li n a l ) 11 3 】4 0 6m e m b r a n em _ n k r 4l7 2t g nm n k r 217 2t g n对于真核生物，铜转运及细胞内定位方面研究较深的是面包酵母菌、酿酒酵母。除了铜调节转录因子a c e l 和m a c l 2 0 , 2 1 】，人类与酵母同源的维持体内铜平衡基因已经了解。酵母模型对于理解生物体内铜代谢是成功的。所有的真核生物体内铜平衡机制十分保守。对于啤酒酵母高亲和性铜的摄入，在生理方面以温度、过程的依赖性为特征【2 2 1 。铜电极研究酵母表明铜的摄入伴随钾的流出。这一过程可能是c u + 2 k +3! ! 匹堡重堕堂堂! 堕塑的逆向输运机制口”。尽管酵母的铜摄入机制还没有建立，但近年酵母遗传学的研究已经开始词明此过程中的蛋白了。c u ”的高亲和性摄入可能是优先的，也可能仅是其中的一种方式。c u ( 1 1 ) 可能是被f r e l - - f r e 7 基因编码的处于细胞表面的f e ( m ) c u ( i i ) 还原酶还原为c u 0 ) 口4 2 ”。铁响应转录因子a f i l 调控系列基因中的五个f r e 2 f r e 6 ，而铜转录因子m a c l 调控f e r l 和f e r 7 两个基因1 2 “。还原酶的作用是还原c u ( i i ) 和f e ( i i i ) ，这对于高亲和性摄入这些金属是必要的( 图1 2 ) 。c u ( i ) 认为是先与质膜结合，高亲和性的铜转运蛋白是由c t r l 和c t r 3 基因编码【2 72 8 1 。通过f r e 编码的金属还原酶与c t r l 3 在质膜上发生耦合，而后将c u ( i ) 运入细胞。c t r l 和c t r 3 高亲和性摄入铜是专一的，这与整个酵母细胞摄入c u 研究是一致的i ”】。尽管最初通过对铁转运突变体研究发现c t r l 高亲和性的转运铜，但对这两种营养元素吸收的联系知之甚少。实际上，啤酒酵母c t r l 基因损伤表现为高亲和性铜吸收的缺陷2 7 , 2 9 。症状表现为低铜介质中生长缓慢，呼吸缺陷( 由于细胞色素氧化酶得不到铜) ，对氧化应激敏感( c u 、z n 超氧化歧化酶中缺铜) ，金属硫蛋白失活( 缺乏铜激活铜金属调节转录因子a c e l ) ，不能高亲和性转运铁、f e t 3 得不到c u 。c t r l 含有4 0 6 个氨基酸、由3 个跨膜域组成。n 一端域基于拓扑学分析位于壁膜间隙，含有几个重复的可能结合金属的m x m 或m x x m 模体( x 为任意氨基酸) ，另外c 端域含有半胱氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸残基，所有这些都可能与金属配位。在铜转运过程中，这些残基的重要性还不清楚。c t r l 高度糖基化，并在质膜上形成低聚物1 2 9 。有趣的是铜的浓度高于c t r lk 。浓度时，将触发c t r i 在质膜上快速降解口o i 。这代表着一种新的质膜蛋白降解机制。对具有胞吞饮囊泡降解缺陷的突变酵母菌体研究表明，这一过程不需要c t r l 的内化或运进囊泡( 囊泡通常是蛋白降解的场所1 。然而当铜达到1 0 1 x m l 时，c t r l 受铜的刺激被胞吞饮，这可能与铜的摄入有关或者在铜达到毒性浓度时具有在质膜上减少c t r l 的作用。第二个有关铜转运的是c t r 3 ，是与c t r l 有关的高亲和性铜转运蛋白。尽管深信两个铜转运蛋白可以抑制啤酒酵母铜缺乏症，但酵母菌株表达沉默的更可能的解释是培养的酵母菌株来源于转位c t r 3 随机沉默的共同祖先【3 “。c t r l 和c t r 3 能够独自高亲和性转运铜进入细胞，含有这两个转运蛋白的细胞能在低浓度铜的条件下生长，这一结果支持上述结论。c t r 3 含有2 4 1 个氨基酸，含有三个跨膜域和三对c c 或c x x c 序列的1 1 个半胱氨酸。尽管c t r l 和c t r 3 蛋白高亲和性转运铜的功能相同，但这两个蛋白不具有同源性。目前研究表明啤酒酵母能够通过由f e t 4 3 2 , 3 3 s m f l 2f 3 l ”j 以及c t r 2 基因编码的至少3 个将铜摄入体内的低亲和体系。第一章综述有趣的是没有一个真核生物高亲和性铜摄取蛋白被认为在酶区域标记的质膜上发挥作用。尽管不明白什么提供能量驱使铜离子跨膜，高亲和性的铜转运协调亚基是与a t p 酶藕合高度有序的复合物。逆向运输中的k + ( 或其他离子) 或许是动力，然而这与高亲和性铜转运对a t p 酶的依赖相矛盾。11 2 哺乳动物对铜的吸收哺乳动物摄取食物中的有机铜以及铜在组织中的分布相当复杂。图1 2 描述整个过程。对铜的摄取、定位，目前只是在器官和细胞的层次上理解。哺乳动物对铜的吸收方面要回答的问题是：首先，铜是怎样从食物中得到又是怎样到达肠道粘膜壁细胞的? 第二，吸收的铜又是怎样由肠粘膜细胞穿过基底外侧膜进入血液中的? 第三，血液中铜的配位情况如何? 铜是怎样到达全身各处的? 进而铜又是怎样被运进构成器官的细胞内的?哺乳动物通过胃和小肠的粘膜细胞吸收食物中的铜( 图1 - 3 ) p 、”j 。这个过程如何进行，目前还不清楚。估计铜可能是通过小肠道黏膜层扩散进入的【3 ”。假设铜进入酵母菌细胞内，若是自由扩散。则不能很好的解释这个过程。很明显，这是一个需要我们继续探索的领域。然而有一个蛋白已经明确：人类的模板d n a ( c d n a ) 编码着一个高亲和性转运铜蛋白h c t r l 具有弥补因c t r l 和c t r 3 基因失活使酵母细胞铜转运缺陷而导致的呼吸缺陷功能口。h c t r l 是一个与酵母c t r l 和c t r 3 同源的含有1 9 0氨基酸残基的蛋白。这意味着哺乳动物的运铜蛋白由酵母c t r l 和c t r 3 进化而来。h c t r ln 一端域富含甲硫氨酸和组氨酸，这与富含甲硫氨酸残基的酵母c t r ln 一端域相似。因此拓扑分析预测，就象啤酒酵母c t r l 和c t r 3 蛋白，这一蛋白也含有三个跨膜域。r n a印迹分析表明h c t r l 基因在测定的所有组织中都表达，在肝脏及胰腺中有较高的产物，肠道中含量中等，而脑、肌肉组织中的最低。两个主要的m r n a2 k b 和2 5 k b的转录产物在所有的组织中具有近似相同的比例。大约8 5 k b 的转录产物也被检测到。这些不同的转录产物意味着h c t r l 可能存在的形式源于选择性剪切。也许具有不同的转铜功能。h c t r l 是否在小肠黏膜细胞铜转运中扮有重要角色，低亲和性铜转运蛋白h ，c t r 2 与h c t r l 以及酵母的c t r 2 和c t r l 同测2 7 强3 9 1 。就象h c t r l 一样，h c t r 2的m r n a 在所检测的组织中都含有，然而不同的是胎盘的含量最高，肝脏、卵巢、小肠以及结肠中含量较低。与h c t r l 不同，h c t r 2 不能弥补因酵母铜转运缺陷引起的呼吸缺陷。因此h c t r 2 在体内铜的平衡作用还不清楚。第二个称为低亲和性铜转运蛋白的n r a m p 2 是一个能够转运多种金属离子的质子藕合金属转运蛋白【柏】。有趣的是n r a m p 2 蛋白与酵母金属转运蛋白s m f l s m f 2 同源 3 1 , 3 4 。! ! 匹丝堕塑堂堂婴堑铜被转运到肠黏膜细胞时，是如何穿过基底外侧膜的? 经过临床医学家、分子生物学家和m e n k e s 病基因研究专家的共同努力，这一问题的重要方面已经明确。m e n k e s 病的特征是神经损坏并导致幼亡【4 ”。m e n k e s 患者体内铜滞留在肠细胞、肾脏以及脑血管内上皮细胞并造成许多铜蛋白中铜的缺乏【4 2 i 。由分离的m e n k e sa t p 7 a 基因和它编码着一个膜结合p 型a t p 酶 。j ，象大肠杆菌( e h i r a e ) c o p a 蛋白，m e n k e s ( m n k ) 在n 一端含有6 个重复的铜结合g m t c x x c 模体。a t p 7 a 、m r n a 在肌肉、l 肾、脑部大量表达，但在肝脏是微量的，与诊断数据一致，铜在m e n k e s 患者肠粘膜细胞积累。m n k 蛋白的可能作用是运输铜穿越基底外侧膜，a t p 7 a 基因在肠上皮细胞中表达【”1 。数据分析表明，m n k 蛋白具有提供锕给铜金属蛋白和允许铜从肠道上皮细胞外流两种功能。m n k 蛋白处于何处? 通过对扩增抗铜的仓鼠卵巢细胞分析表明，m n k蛋白的位置受铜浓度的影响【4 。铜浓度较低时，m n k 处于t g n ( t r a n s g o l g in e t w o r k )其作用是将铜运到未知通道。在高浓度铜的刺激下，m n k 蛋自由t n g 到达质膜，这可能与铜的外流保护细胞免于中毒有关。m n k 的迁移可能是耗能过程，也是可逆的，细胞无需合成新的蛋白。这一过程中m n k 与m r n a 的转录产物的浓度不变。与c u 0 ) 化学性质相近的a g ( 1 ) 也能刺激m n k 向质膜迁移。表明哺乳动物细胞激活这一过程就是减少c u 0 ) 。由铜浓度决定位置的m n k 蛋白至少需要n 端域6 个金属结合模体中的两个 4 5 】。最近报道m n k 蛋白的第三个跨膜区的t n g 靶信号【4 6 】和c 一端的双亮氨酸f 47 i 对于m n k 蛋白由质膜到t n g 间迁移是必须的。因此与其外分泌铜和铜内流进入循环的功能一致，m n k 蛋白在细胞内随铜浓度迁移的功能相应。铜进入体内循环，在血液循环入口处铜与白蛋白、组氨酸结合1 3 ”。白蛋白组氨酸怎样把铜转到器官组织中还不清楚。然而非游离铜直接或间接地与h c t r l 结合。血浆铜蓝蛋白是在哺乳动物中含量较高的铜蛋白。该蛋白是一个含有多于血清总铜量9 5 并且是在肝脏合成的多铜糖基化铁氧化酶【4 ”。铜蓝蛋白生物合成时与七个铜配位，并在未知通道完成1 4 。尽管现在还不知铜蓝蛋白是否涉及铜在血清中的转运，但已测知铜蓝蛋白基因缺陷不影响组织中铜的含量m ”j哺乳动物维持正常生理铜浓度是通过维持吸收、定位、胆汁和尿排出平衡来实现的。体内铜吸收代谢的中心是肝脏。肝脏维持体内铜平衡机制的重点是在于常染色体隐性无序的w i l l s o n 病( w n d ) 。事实上研究细菌或酵母突变体使我们了解了基本的生物机制。通过研究人与动物的病态模型，对体内铜平衡有了更多的了解。编码1 6 0 k dm n dp 型a t p 酶的a t p 7 b 基因| 4 9 52 】对于随胆汁排出的铜以及肝脏内铜蓝蛋第一章综述自的铜配位是必需的。铜在w i l l s o n 病患者肝脏积累导致肝硬化、神经衰弱以及脱辅基铜蓝蛋白的形成。近来，基因动力学研究表明a t p 7 b 的c d n a 通过腺病毒介导基因转入患有w i l l s o n 病的啮齿类动物樟鼠体内，恢复合成了血浆铜蓝蛋白【5 ”。与这些发现一致，w n d 蛋白处于铜蓝蛋白与铜结合的肝、脑的t g n 【5 ，也可能处于胆汁排出的肝细胞小管质膜【5 “。提高h e p g 2 的铜浓度，w n d 蛋白由t g n 迁往胞质泡囊、其他细胞器【5 “。尽管对这些细胞器还不太了解，或许w n d 蛋白进入胆小管膜。有趣的是在培养的肝组织细胞中代表着w n d 蛋白切割形式的1 4 0 k d 的多肽位于线粒体内而不是在t g n 口7 o 这种形式的蛋白可能是w n d 蛋白n 一端多重金属结合区水解切割的产物，并且进入线粒体内维持线粒体内铜平衡，可以在松果细胞、老鼠光受体以及视网膜发育期间的视网膜上皮细胞和腱状体上表达【5 “。这个新的w n d 剪接体( p r n a ) 完全没有多重金属结合域也没有被称为w n d 的前四个跨膜片段。虽然有这些缺陷，仍然能够在一定程度上弥补酵母菌株与c c c 2 a 相关的f e t 3 铜结合的缺陷并且可能在老鼠松果细胞内具有转运铜功能。有趣的是p i n a 在夜间的表达水平是白天的一百多倍。p i n a 的发现意味着在松果体或腱状体有昼夜铜代谢节律。在其他组织中也可能存在。早期的研究也暗示了昼夜节律。这意味着血清中铜浓度的昼夜变化。究竟是铜调控昼夜节律，还是昼夜节律调控铜的浓度尚不清楚。不含有与朊病毒有关的p r p c 蛋白的转基因老鼠在其脑提取的原生膜突触体以及核中，铜的含量仅为正常时的2 0 s 9 1 。这些老鼠昼夜节律睡眠方式具有选择性 6 0 l 。有趣的是朊病毒蛋白p r p c ( 后期翻译加工行成p r p c s ) 与克雅氏病( c l d ) 、库鲁病、格史氏综合症( g s s l以及致死性家簇失眠症( f f i ) 总称为朊病毒病【6 l 】有关。p r p c 蛋白可能在中枢神经系统中具有铜吸收功能，在脑部、脊髓外周组织中也发现有此功能。p r p c 是g p i a n c h o r e g细胞表面的糖蛋白。朊病毒蛋白的生理功能不清楚，但他能够结合c u 0 1 ) 【6 2 州l ，就象m n k 蛋白迁移。铜刺激p r p c 胞吞饮【4 】，该蛋白包含多重保守的c u ( n ) 结合部位。有证据表明铜离子促进胍变性的p r p c s 分子复性，形成抗水解感染的朊病毒粒【6 5 】。由于朊病毒粒不能在质膜上迁移，故可在核膜上积累。综合这些结果可得出生理功能正常的朊病毒蛋白与铜的摄入有关，铜可激活胞吞饮作用促使其形成致病粒。位置依赖于铜浓度的m n k 、w n d 和p r p c 蛋白表明铜的结合能够刺激那些被认为由胞吞饮方式致使其在不同细胞器问穿梭时改变构象。1 2 铜在细胞内的转运及定位由于高度活泼性，c u 0 ) 在细胞内以自由离子形式存在时能参与反应，其产物对细胞膜、蛋白以及核酸十分有害。据近几年的实验来看，铜进入细胞后通过与细胞! ! ! 丝堕塑堂堂旦塞质间分子伴侣的蛋白结合，高度专一的运到特定的蛋白或细胞器( 图1 2 ) 。1 2 1a t x l 转运到高尔基体a t x l 铜分子伴侣当初认为在缺乏s o d 时，具有抑制氧化损坏作用。a t x l将铜运到未知部位。a t x l 是一个含有7 3 个氨基酸的多肽。他的n 一端仅含有一个在其他金属结合蛋白也发现的m t c x x c 金属结合模体口4 l 。广延x 射线吸收精细结构表明每一个a t x i 结合一个c u 0 ) ，以两个保守的半胱氨酸巯基硫与铜配位，第三个配位原子不确定【l 。结合了铜后，a t x l c u 可能移向t g n c 并通过类似于c c c 2 蛋白所形成的一系列2 或3 配位的铜桥中间体( 图1 4 ) 。在a t x ln 一端域将铜转出【1 66 6 1 。酵母c c c 2 蛋白是一个类似哺乳动物的m n k 和运铜到某个部位的w n dp 型a t p 酶 6 7 o 许多实验结论支持a t x l 将铜转到t g n 内部的c c c 2 ，然后铜与f e t 3 结合。f e t 3是高亲和性的铁吸收多铜氧化酶引l 。a t x l 基因损坏的底物细胞不能在低铁介质中生长，这可能是由于高亲和性铁摄入减少，f e t 3 中缺少铜。当在生长介质中加入铜，细胞可恢复正常。这意味着突变损坏了将铜运往f e t 3 的功能。体内2 c u 标记进一步证明了突变体f e t 3 中缺乏铜。这与a t x l 将铜转到c c c 2 ，然后与f e t 3 结合的模型一致。低铁介质中a t x l a 突变体不能生长，加入c c c 2 可恢复正常。蛋白蛋白相互作用实验表明a t x l 与c c c 2n 一端金属结合域以特定的铜依赖方式相互作用”6 1 。与这类相互作用及a t x l 转运铜到c c c 2 一致，实验证明m k n 蛋白金属结合域以两个半胱氨酸与c u ( i ) 配位1 6 “。近来研究表明除了c c c 2 外，高效将铜运到f e t 3 时还需要g e f l ，g e f l 与哺乳动物t g n 中氯离子通道c l c 同源 6 8 , 6 9 。g e f l 是阴离子通道，保持电荷平衡，有利于铜的输运。1 2 2 转运到线粒体细胞色素氧化酶是呼吸链中关键的线粒体酶。他的两个亚基可以结合三个铜离子，一个是线粒体膜内的双核铜位点，另一个是夹藏于膜内的单核位点7 0 1 。还不清楚何时，如何铜离子与酶结合。然而，酶的活化必须有辅基。酶与辅基的结合过程中，已知有两个蛋白c o x l 7 、s c 0 1 起着重要作用。c o x l 7 ，最初是由t z a g o l o f f 等1 7 ”发现的，含有6 个半胱氨酸( 在酵母和哺乳动物体内较为保守) 8 k d 的分子。酵母的c o x l 7 位于胞质和线粒体膜内，这与转运铜到线粒体的功能相符1 7 “。c o x l 7 仅需要6 个半胱氨酸中的4 个与金属离子配位。铜与细胞色素氧化酶结合过程中涉及的另一蛋白s c o l 是一个线粒体膜内蛋白 7 3 】。s c 0 2 与s c o i 同源，也可能在这一过程中扮有角色【7 3 】。s c o l 与细胞色素氧化酶的亚基2 同源，同样含有两个由半胱氨酸残基构成的铜结合位点1 7 27 ”。可能由这一第一章综述位点将铜离子直接传递给细胞色素氧化酶，而c o x l 7 可能将铜离子转运给s c o l 2 。1 23 转运到超氧化物歧化酶铜锌超氧化物歧化酶s o d l 具有保护细胞免于游离基损伤的功能。在体内，s o d l与铜离子结合需要有铜分子伴侣蛋白的参与。酵母体内编码这一蛋白的基因是l y s 7 1 ”1 。突变掉这一基因的酵母表达的s o d l 仅含有一个锌离子1 75 1 。酵母以及哺乳动物体内这一基因编码的蛋白记作c c s 。到目前为止，c c s 是最大的铜分子伴侣蛋白，可分为三个结构域m7 7 1 。n 一端结构域与a t x i 同源，包含有m x c x x c 铜结合位点模体。缺少这一结构域的c c s 仍然能够将铜离子转运到s o d l i7 6 】。因此，类a t x i 结构域的功能可能仅是在铜离子稀少的条件下起作用。中间结构域与s o d i 同源 7 8 - 8 0 】。这一部位可能与s o d l 直接作用并将铜离子传递到s o d i 76 1 。s o d l 一般以同型二聚体或与c c s 形成二聚或四聚物存在【7 。c 一端域非常小，仅含有近3 0 个氨基酸残基，但对于体内激活s o d l 非常关键。这一结构域对于不同物种间亦是较为保守的，并含有一个c x c 铜结合模体。晶体结构表明，这一结构域非常无序，这一结构域可能与n 端域相毗邻 7 9 - 8 1 。1 3 铜分子伴侣的结构以及金属结合性质许多铜分子伴侣以及类铜分子伴侣的特征是含有保守的m x c x x c 金属模体5 4 ，5 2 ，8 2 , 83 1 ，而且镉结合蛋( q ( c a d a 【8 4 1 ) 和汞结合蛋i 刍( m e r p i 8 5 和m e r a 8 6 】) 也含有这一模体。这意味着每一类蛋白可以结合多种金属离子。但研究表明m n k r 2 ，m e n k e s a t p 酶的n 端亚基第二个位点只能与c u 0 ) ，a g o ) 结合，不能与其他离子结合，如：c d ( i i ) 【8 “8 8 1 。这既明这类蛋白对金属离子的结合具有专一性，可能是由蛋白的三级结构和金属结合模体所处的环境调控。表1 3 列出了分子伴侣a t x l ，h a m ，c o p z ，t , y s 7 和类铜分子伴侣m n k r 2 和m n k r 4 的一级结构：c o x l 7 不含有m x c x x c 模体。c o p z 是第一个阐明的铜分子伴侣f 8 ，他是一个转录活化子，其功能是将铜转运到转录阻止子c o p y 。m n k r 2 和m n k r 4 是处于m e n k e s 蛋白【5 。7 j n - 端6 个铜结合域中的两个，与人的c c c 2 同源。m e r p 和m n k r 4 与铜分子伴侣同源，他们的结构已表征，与金属结合性质已进行了初步的探索。m e r p l 9 0 是一个结构较为清楚的蛋白，是s h i g e l l of l e x n e r i 9 1 1 体内处于细胞周质的汞伴侣蛋白，具有汞解毒的功能。m e r p 的三级结构含有两个嵌于1 3 折叠( 4 个反平行的d 股) 的旺螺旋，二级结构( p i _ q l p z 艮- a 2 1 3 4 ) 是类铁氧还蛋白的特征结构，称做“o p e n f a c e d b s a n d w i c h ”【9 “。a 螺旋和p 折叠具有两亲性，类铁蛋白的球状折叠可减小疏水性基团向溶液中暴露。在这一结构中，模体m x c x x c 位于第一个c 【螺旋和! ! e 曼壁堕塑堂堂堕塑表13 一些分子伴侣蛋白的一级结构b l洳1p4芦4俚- 2b - 4- 一一_ 罨璺差熏量誊墓蓦至差兰量。，。占。，去。，。：。，。，。，。；。：。，。，。”0 6 5 ”母”5 。”洲6 8 1 5 6 “”68 18 6 。“”。”8 9 。8 “。口c 1 “。4 7 0 “”t。，。，。，。岛! ! ! ! ! l 。，。e s 。v 。，。，。，第一个b 折叠之间俐。m e r p ，c o p z ，l y s 7 ，c c s ，a t x l ，h a h l 和m e n k e 蛋白序列的同源性表明他们也可能含有类铁氧还蛋白的二级结构 9 4 j 。一级结构和二级结构的同源性表明他们的三级结构也具有相似性。m n k r 4 证明了这一点【9 5 】。1 h 和1 5 n m r 给出了a p o 和a g o ) 一m n 心4 的溶液结构【9 。比较m n 鼬4 和m e r p 的结构可得知二者均含有“o p e n f a c e d - b - s a n d w i c h ”结构。分析m n k r 4 和m e r p 金属结合结构可知，金属的结合引起两个保守的半胱氨酸残基相互靠近，第一个d 螺旋稍微伸展并稳定了l o o p 区。a p o 和h g ( i i ) 一m e r p 结构的不同在于芳香性残基p h e 3 8 的变化，由金属结合l o o p 区下移n t 蛋白的表面【9 3 1 。蛋白表面产生了一个疏水区，这一变化对于蛋白蛋白相互作用以及金属离子的传递是重要的。但m n k r 4 不存在这样的变化。m n k r 4 的这一位置是亮氨酸残基，结合与否金属离子均处于金属离子结合位的l o o p 区下。m n k r 4 中l e u ”和其他疏水性残基l i e “，p h e ”均靠着金属离子结合为的l o o p 区堆积。这表明3 8 位的残基金属离