（发育生物学专业论文）人类心脏发育候选基因znf649的克隆与功能研究.pdf

基因z n f 6 4 9 的克隆与 功能研究湖南师范大学硕士学位论文 摘要 一系列控制着细胞分化， 细胞基质形成的基因在不同的时空表达 构成了心肌的分化过程。研究证实许多包含有 k r a b 的锌指蛋白 ( k r a b - z f p s ) 与 心 脏发 育以 及心 血 管 疾 病都 有 密 切的 关 系。 本 文 作 者 筛选并鉴定出 一个新的人类锌指基因并命名为z n f 6 4 9 ，其c d n a全 长 3 1 7 6个碱基，编码一个长 5 0 5个氨基酸残基的蛋白 质。 z n f 6 4 9 在n端含有一个k r a b框， c端含有1 0 个c 2 h 2 型锌指。 使用生物 信 息 学的 方 法 分 析 表明z n f 6 4 9 定 位 在 染 色 体1 9 g 1 3 .4 1 上， 在 基因 组 上跨越了1 7 k b 并包含了5 个外显子。 r n a印迹试验表明z n f 6 4 9在人的成体和胚胎中都有表达，而 在心脏和骨骼肌中表达强烈。 z n f 6 4 9 融合g a l - 4 的d n a结合区并与 v p - 1 6 共转染的试验结果表明z n f 6 4 9 是一个抑制因子，在c o s 7 细 胞中过表达 z n f 6 4 9蛋白可以使 m a p k信号途径的两个下游转录因 子a p - 1 和s r e 的转录激活活性显著下降。 将z n f 6 4 9 基因中的结构 域拆片进行分析的试验表明 k r a b基元是个非常重要的结构域，抑 制了s r e和 a p - 1 的转录活性。 这些结果表明， z n f 6 4 9 蛋白 很可能 在 m a p k的信号途径中充当了转录抑制子的角色，进而在细胞分化 中起了重要的作用。 另外， 本文还以鸡胚早期发育各时期的心脏为材料， 建立了一套 快速鉴定鸡胚发育时期的形态学标准， 而且还将鸡胚心脏发育的关键 事件与鸡胚发育时期各关键形态学特征联系起来， 使得可以通过鸡胚 杨洲基因z n f 6 4 9 的克隆与功能研究湖南师范大学硕少学位论i 外部形态学 特征来快速确定心脏发育的时期。 关键词:m a p k信号途径， s r e , a p - 1 , 转录抑制子; k r a b 框; z n f基元结构 杨鸿墓因z n f 6 4 9 的克隆 与功能 研究湖南师范大学硕士学位论文 ab s t r a c t c a r d i a c d i ff e r e n t i a t i o n in v o l v e s a c a s c a d e o f c o o r d i n a t e d g e n e e x p r e s s i o n t h a t r e g u l a t e s c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d m a t r ix p r o t e i n f o r m a t i o n i n a d e f i n e d t e m p o r o - s p a t i a l m a n n e r . ma n y o f t h e k r a b - z f p s a r e i n v o l v e d i n c a r d i a c d e v e l o p m e n t o r c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e s . h e r e w e r e p o r t t h e i d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l h u m a n z i n c - f i n g e r g e n e n a m e d z n f 6 4 9 . t h e c d n a o f z n f 6 4 9 i s 3 1 7 6 b p , e n c o d i n g a p r o t e i n o f 5 0 5 a m i n o a c i d s i n t h e n u c l e i w i t h a n n - t e r m i n a l k r a b d o m a i n a n d 1 0 c l a s s i c a l z i n c f i n g e r c 2 h 2 m o t i f s i n t h e c - t e r m i n u s . s c a n n i n g w i t h b i o i n f o r m a t i c s m e t h o d s ， z n f 6 4 9 i s i d e n t i c a l o n c h r o m o s o m e 1 9 g 1 3 .4 1 , s p a n n i n g a p p r o x i m a t e l y 1 7 k b o n t h e g e n o m e a n d o r g a n i z e d i n t o 5 e x o n s . n o r t h e rn b l o t a n a l y s i s i n d i c a t e s t h a t z n f 6 4 9 i s e x p r e s s e d i n m o s t o f t h e e x a m i n e d h u m a n a d u l t a n d e m b ry o n i c t i s s u e s , a t a h ig h e r l e v e l i n h e a rt a n d s k e l e t a l m u s c l e . z n f 6 4 9 i s a t r a n s c r i p t i o n s u p p r e s s o r w h e n f u s e d t o g a l - 4 d n a - b i n d i n g d o m a i n a n d c o t r a n s f e c t e d w i t h v p - 1 6 . o v e r e x p r e s s i o n o f z n f 6 4 9 i n c o s - 7 c e l l s i n h i b i t s t h e t r a n s c r ip t i o n a l a c t i v i t i e s o f s r e a n d ap - 1 wh i c h a r e d o w n s t r e a m e ff e c t o r s o f map k p a t h w a y . d e l e t i o n a n a l y s i s w i t h a s e r i e s o f t r u n c a t e d f u s i o n p r o t e i n s i n d i c a t e s t h a t t h e k r a b m o t if i s a b a s a l r e p r e s s i o n d o m a i n w h e n t h e t r u n c a t e d f u s i o n p r o t e i n s w e r e a s s a y e d f o r t h e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t i e s o f 杨鸿基因z n f 6 4 9 的克隆与 功能研究湖南师范大学硕士学位论文 s r e a n d a p - 1 . t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a tp r o t e i n m a y a c t a s a t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r i n m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e s i g n a l i n g p a t h w a y t o m e d i a t e c e l l u l a r f u n c t i o n s . f u rt h e r m o r e , w e a s e nest o e s t e mi t e d t h e s t a g e s o f c h i c k e m b ry o s， w h i c h c a n h e l p u s t o i d e n t i f y t h ea g e o f c h i c k e m b r y o n i c h e a rt t h r o u g h t h e o u t e r m o r p h o l o g i c c r i t e r i o n s i g n a l i n g p a t h w a y , s r e , a p - 1 ; s u p p r e s s o r ;m o t i f ; z n f m o t i f v改 基因z n f 6 4 9 的克隆与功能研究湖南师范大学硕士学位论文 bs a 英 文 缩 写 词 简 表 牛血清白蛋白 基因数据库 d u l b e c c o s mo d i f i e d e a g l e s s o d i u m d u l b e c c o改良 培养基 翔b弧器gp edebesfchc orf p cr s ds - p age hugo 二乙 基焦碳酸盐 ( d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ) 二甲 基亚w( d i m e t h y l s u l f o x i d e ) 增强 型 绿 色荧 光 蛋白 ( e n h a n c e d g r e e n fl u o r e s c e n t p r o te in ) 乙 二胺四乙 酸二 钠 ( e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d ) 澳化乙 锭 ( e t h i d i u m b r o m i d e ) 表达 序 列 标记( e x p r e s s e d s e q u e n c e t a g g e d ) 胎 牛 血 清( f e t a l c a lf s e r u m , ) 人类基因 组计划 ( h u m a n g e n o m e p r o j e c t ) 开 放阅 读 框 ( o p e n r e a d i n g f r a m e ) 聚 合酶 链 式反 应 ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t io n ) 快速扩增c d n a末端俘a p i d a m p l i f i c a t i o n o f c d n a e n d ) 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳 ( s d s - p o l y a c r y l a m i d e g e l e le c t r o p h o r e s i s ) 国 际 人类基因 组 委员 会( h u m a n g e n o m e o r g a n i z a t i o n ) k r iip p le 型 环指 结 构 域( k r d p p le r i n g a s s o ic a t e d b o x ) 多 组n o r t h e r n 膜( m u l t i p l e t i s s u e s n o rt h e rn m e m b r a n e ) 美国生物技术信息中心 ( n a t io n a l c e n t e r f o r b i o t e c h n o l o g y i n f o r m a t i o n ) 基因z n f 6 4 9的克隆与 功能研究湖南师范大学硕 _ 学位论文 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液( p h o s p h a t e -b u f f e r e d s a lin e ) 专 一序列 位点( s e q u e n c e - t a g g e d s i t e ) c d n a末端快速扩 增( r a p i d a m p l i f i c a t i o n o f c d n a e n d s ) 简单模块搜索工具( s i m p l e m o d u l a r a r c h i te c t u r e r e s e a r c h t o o l ) c v - 1 o r i g e n ,s v 4 。 细 胞 系 有丝分 裂活化蛋白 激酶( m i to g e n - a c ti v a t e d p r o t e i n k i n a s e ) g蛋白 祸 联的 受 体( g - p r o te i n c o u p l e d r e c e p t o rs ) c - f o s 血 清应答元 件 ( c - f o s s e r u m r e s p o n s e e l e m e n t ) 血 清 应 答 因 子( s e r u m r e s p o n s e f a c to r ) 激活因子1 ( a c t iv a ti o n p r o t e i n 1 ) 叮1二既 pbsstsracesmapcosnmapfgpcrc-foss泌ap-1 基因z n f 6 4 9 的克 隆与 功能 研究湖南师范大学硕十学位论文 第一章 引言和文献综述 1 心脏发育过程的研究 心脏发育是一个复杂的过程。 它包括细胞的迁移、 融合及各种特 异性的分化过程。 心血管系统是胚胎发生中功能活动最早的系统， 以人类为例， 胚 胎约在第3 周末开始血液循环， 使其很早即能有效地获得养料和排除 废物。 心血管系统是由中胚层分化而来， 首先形成的是原始心血管系 统， 在此基础上再经过生长、 合并、 新生和萎缩等改建过程而逐渐完 盖 心脏发生于生心区。在人胚第1 8 - 1 9 天，生心区的中胚层内出 现围心腔 ( p e r i c a r d i a c c o e l o m ) ，围 心腔腹侧的中 胚层细胞密集，称 之 为 生 心 板 ( c a r d io g e n i c p l a te ) ， 板的 中 央 变空， 逐 渐 形成 一 对 心管 ( c a r d i a c t u b e ) 。当胚体发生侧褶时，一对并列的心管逐渐向中线靠 拢， 并从头端向 尾端融合成为一条。 与此同时， 心管与周围的间充质 一起在心包腔 ( 即围心脏) 的背恻渐渐陷入， 于是在心管的背测出现 了 心 背 系 膜 ( d o r s a l m e s o c a r d i u m ) o 心管的头端与动脉连接， 尾端与静脉相连，两端连接固定在心包 上。 在心管期， 心脏的位置与形态结构是对称的， 但经过一个心管向右 成环的过程后出现了明显的位置、 结构及形态不对称。 心管各段因生 长速度不同，首先出现三个膨大，由头端向尾端依次称心球 ( b u l b u c 基因z n f 6 4 9 的克隆与功能研究湖南师范大学硕士学位论文 c o r d i s ) 、心室和心房。此时心脏外形基本建立起来。 心脏各部的分隔是同时进行的。可分为房室管的分隔，原始心房 的分隔， 的第五周 原始心室的分隔， 动脉干与心动脉球的分隔等。 在胚胎发育 ， 心 脏 基 本 形 成 。 i -3 1 2 人心脏发育调控基因 心脏是脊椎动物发育过程中首先形成的器官之一。 先天性心脏病 是最常见的先天缺陷， 也是婴儿死亡的主要原因之一。 所以 对心脏早 期发育机制的研究有利于我们了 解心脏发育的内 在机制， 并为先天性 心脏病的诊断和治疗提供借鉴。 人的心脏发育是一个相当复杂的过程， 在这个过程中， 需要特定 基因的精确表达。这些基因包括: ( 1 ) n k x - 2家族基因。该基因是 最早表达的 基因 ， 其表达的nk x - 2 .5分子被认为是心肌细胞开始形成的标志。 若该 基因不能 表达， 心管可以 形成但却不能正常发生弯曲 ， 心肌细胞的 增殖也受到干扰4 ( 2 ) b hl h 家族基因。 虽然成熟心肌细胞中 没有b hl h 的 表达 但在早期心肌细胞发生时却有 2个b hlh 家族成员即d hand 和e hand的 表达。 两者在心管弯曲时的表达表明 它们与心管的分 化有密切关系; 在稍后的左侧心肌细胞形成中e hand 的单独表达 和d hand 表达的消失现象表明它们可能与心脏的不对称形成有 直 接 关 系 5 l ( 3 ) m e f - 2基因。 该基因是骨骼肌、心肌和平滑肌三类肌细胞 #) z n f 6 4 9 的克 隆与功能研究湖南师范大学硕十学位论文 发生与形成时共同的中枢性调控基因，在脊椎动物共有 4个即mef - 2 a , b , c , d o m e f - 2 在 心 管 期 开 始 表 达，若失 活 则 引 起 心 脏发 育 停 止 在 心 管 弯曲 状态 ， 并 且 右 心 室 不 形 成 6 ( 4 ) g at a 家 族 基因。 该基因 能 表达 含 锌结 构的 因 子，主要 调 节 形成后的心肌细胞的增殖与向心管的聚集。 若迁移形成肌小梁。 心肌 细胞内的n- my c , rxr, wt - 1 , tef - 1等基因的表达则与 心肌的增厚和室间隔的生长有密切关系。 若它们发生突变则使心室不 能 正常发 育成熟3 - 6 1 。 缺乏该因 子则心管 不形成 ， 说明 它的 表达应是 在 心管初期就已开始。 目前在这些基因的研究基础上， 人们已经鉴定了很多与心脏发生 相关的分子途径和信号通路。 如d p p 信号途径19 1 ( 诱导心 脏和内 脏中 胚层的建成) 、w n 七信号途径 101 ( 参与心脏、内 脏以 及体肌细胞的分 化过程) 、 成纤维生长因子( f g f ) 信号途径 ill ( 在心脏起源的特化过程 中 起直接的作用) 、 n o t c h信号途径 121 ( 参与心脏环化和左右发育不 对称性发育过程)等等。 3 ma p k信号途径与心脏发育 细胞外界的信息是如何进入细胞， 细胞又如何作出应答， 这是一 个生物学领域的基本命题，正受到了与日 俱增的重视。 虽然， 人们己经鉴定出一些心脏发育相关的分子途径， 人们对于 心脏发育有关的信号途径的了解还远远不够， 这也推动了我们研究现 有的和新的信号途径来找到参与调节心脏发育的一些因子， 从而更好 姜因z n f 6 4 9 的克隆与功能研究湖南师范大学硕士学位论文 的理解和把握心脏发育的过程。 在近2 0 年的时间内， 有丝分裂原活化蛋白 激酶 ( m a p k )信号 途径成员相继被发现，相互作用相继被阐明。它们构成了一个庞大、 复杂而又精细的网络， 成为目 前发现成员最多、 关系最复杂， 也是研 究最详尽的途径之一。 它们参与细胞生长、分裂、 分化、 死亡各个阶 段的生理活动， 调节着一系列复杂的生物功能。9 - 1 2 1 3 . 1 m a p k途径简介 蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传 导调节方式， 几乎涉及所有的生理及病理过程， 如糖代谢、 细胞的生 长发育、 基因表达、 神经递质的合成和释放， 甚至癌变等， 在信号传 导过程中占 有极其重要的地位。ma p k级联途径 ( m a p k c a s c a d e ) 存在于所有真核生物中， 在信号传递的过程中占 据着相当重要的地位 2 2 1 m a p k途径最显著的特点就是三醉级联反应。m a p k级联途径 的三级成员为促分裂原活化蛋白 激酶 ( m i t o g e n - a c tiv a te d p r o t e in k i n a s e , m a p k ) ， 促分裂原活化蛋白 激酶激醉 ( m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e k i n a s e , m k k ) 和促分裂原活化蛋白 激酶激酶激酶 ( m i to g e n - a c t iv a t e d p r o t e in k in a s e k i n a s e k in a s e m k k k ) 。 它 们都 是 具有1 1 个保守的亚结构区域的蛋白 激酶，在信号传递的过程中，通 过 氨 基 酸 残 基的 磷 酸 化作 用 被逐 级 激 活 【2 0- 2 5 1 m a p k信号传导通路采用高度保守的三级激酶级联传递信息: 细 基因z n f 6 4 9 的克隆与 功能研究 湖南师范人学硕 卜 学位论文 胞外刺激通过某些环节使m k k k 激活， 转而激活m k k ， 然后通过双 位点磷酸化激活 ma p k 。激活的可通过磷酸化转录因子、细 胞 骨架相关 蛋白 、 酶等多 种底物来调 节多 种细胞生理 过程 2 2 1 0 mk k k是一个s e r / t h : 蛋白 激酶，它直接的激活因素也有多种: m k k k k 、小g蛋白 家族成员r a s , r h o 、寡聚化、胞内 位置的 变化 等等。m a p k k激活后可使下游激酶m k k的s e r / t h r 磷酸化2 3 m k k的s e r / t h r 被磷酸 化后 激活， 作为 一个极具 特 色的t y r , t h r 双 功 能激酶 发挥 作用。 它识别 下 游m a p k分子中 “ t h r - x - t y r 模 序， 将两种不同的氨基酸分别磷酸化后激活m a p k 2 3 e m a p k是一个双磷酸化被激活的s e r 门 c h r 蛋白 激酶， 是m a p k途 径的核心。 ma p k底物包括一些胞质蛋白激酶、磷脂酶、骨架蛋白， 但绝大部分是核内转录因子。 一些 特异性磷酸酶 对 t h r - x - tyr 模序去 磷酸化后 将导致 m a p k 的 失 活。 t h r - x - tyr 存在于m a p k 分子的 激活 环状结 构 之中， m k k 对这种特定的空间结构具有很高的特异性，这就使得上游信号对 m a p k的调节受到限制。因此，上游mk k k的存在成为必然，它可 以 被多种因素激活，允许尽量多的上游信号输入。所以mk k k的种 类最多，目 前在哺乳动物细胞中已 发现 1 4种，m a p k 1 2种，m k k 种类最少， 只有7 种2 0 的双磷酸化激活:这也是 ma p k途径的标识性特点。 m a p k t h r - x - t y r 模序的 双磷 酸化可 使其活 性提高 数 千倍， 两 个氨 基酸残基磷酸化后使它们所在的激活环状结构重新折叠， 再与分子表 基因z n f 6 4 9 的克隆与功能研究湖南师范大学硕士学位论文 面的精氮酸结合位点相互作用， 形成激活状态分子构象x22 。 这条古老 的途径对于细胞增殖的调节是相对安全的。 3 .2 m a p k的四种途径 3 . 2 . 1 e r k途径 人们首先确立的是e r k信号途径，这也是暨今为之研究得最为 透彻的一条经典途径. 它主要通过在细胞中激活转录来对生长因子和 有丝分裂原信号做出响应。 该途径的激活多由 细胞表面受体 ( 包括生 长因 子酪氨酸激酶受体、 细胞因 子受体、 t c r、 c d 2 8 , b c r , g蛋 白 偶联受体等等) 激活引发， 整联蛋白的聚集也可引发这条经典途径。 e r k途径最主要的激活信号来自 酪氨酸激酶受体。以e g f 受体 为例，自 身酪氨酸磷酸化激活之后，接头分子s h c 通过其p t b结构 域结合于受体特定的 麟酸化酪氮酸上， 被受体 激醉麟酸化11 ) . s h e 磷 酸化激活后， 又通过其s h 2 结构域结合另一接头分子g r b 2 。 而g r b 2 已 通过其 s h 3结构域与 s o s( 鸟昔酸交换因子)稳定结合。这样， 受体自身磷酸化撤活就召集了 s o s分子。s o s与受体的结合使质膜 r a s - g d p转换为 r a s -g t p , r a s 分子与 mk k k r a f l 相作用，激活了 e r k级联反应途径。 该途径的三酶模体构成如下: mkkk: ra ft, a- r a f , b- ra f , mo s , mw k1 , mom, me kk3 , t p l - 2 ; mkk: me ki , me k 2 ; 49 z n f 6 4 9 的克隆与功能研究 湖南师范大学硕士学位论文 map k: e r k1 , e r k2 o e r k激活之后转位入核， e r k 1 / 2 的底物也分别定位于胞质中、 核 中 。 在 胞 质 中 e r k l / 2 苏 氨 酸 碟 酸 化 激 活 p 9 0 r s k 激 酶 。 p 9 0 r s k 随 后 转 位 入 核， 磷 酸 化c - f o s ( s e r 3 6 2 ) 。 同 时 磷 酸 化 抑 制g s k 3 活 性， 减弱 了g s k 3 对c - j u n 的 负 调作 用， 放 大了e r k 的 信 号， e r k l / 2 还 可以 磷酸化抑制途径上游分子。 它们包括: e g f受体、 r a s 交换因子s o s , r a f - 1 , m e k 。这些分子都参与了对e r k的调节，e r k对它们的影 响体现了一种负反馈机制。 在核中e r k l / 2 核中的底物多为转录因子。 它 转 位入 核磷酸 化激活的 转录因 子 包括: e lk l , e t s l , s a p , c - m y c , t a l , s t a t 。 而对m y b ， 则发 挥抑制 作用2 3 在介导细胞分裂、迁移和生存等方面，e r k信号传导途径起非 常重要的作用。 3 . 2 . 2 s a p k / j n k 途径 1 9 9 1 年，发现了这条途径核心m a p k -j n k ，它与e r k有两大 区别:可被多种应激刺激激活、 磷酸化转录因子c - j u n n端激活位点 ( e r k磷酸化其 c 端抑制位点)。当时，此激酶在人和大鼠中同时 被发现，分别被命名为j n k ( c - j u n n端激酶) 和s a m ( 应激激活 蛋白 激 酶) ( 3 0 ) ( 3 1 ) 。 随 后 又 发 现了j n k 家 族的 其 它 成 员。 12 2 -2 s 这条途径的 特点之一就是可 被多 种应激因 素激活: 热击、 丫 射线导致 的d n a损伤、过氧化物体的 产生、高渗等等。 同时，和e r k途径一样， 它也可被多种类型的细胞表面受体激 基因z n f 6 4 9 的克隆与功能 研究湖南师范大学硕士学位论文 活: t n f 受体家族、g p c r ,酪氨酸激酶受体、细胞因子受体都可激 活j n k途径。更多的激活因子仍在探索中。 该途径的三酶模体构成如下: mk k k: me k k 1 , me k k 2 , me k k 3 , me k k 4 , t a k 1 , mu k , t p l - 2 , s p rk, as k1 , ms t mock: mkk4, mkk7 map k: j nk1 , j nk2, j nk3 s a p k / j n k途径的主要功能是与细胞凋亡有关。 3 . 2 . 3 p 3 8 途径 p 3 8 途 径的 激活因 素和j n k途 径大 致相同， 被一 些应激因 素: 辐射、 渗透压变化、 热击、 脂多糖、 蛋白合成抑制剂等激活; 也可以 被g p c r 和i l - 1 , t n f - a 等细胞因 子受体激活。 其三酶模体构成如下: me k k: t aki , a s ki , s p r k, p a k; me k; mkk 3 , mkk 4 , mk k 6 ; m a p k : p 3 8 a , p 3 8 8 , p 3 8 d , p 3 8 g o p 3 8 激酶的 底 物 大 部 分 是 转 录因 子， 也 有 胞 质 底 物。 p 3 8 途 径 对 造血细胞因子的产生非常重要:也与细胞因子诱导的增殖反应相关; p 3 8 途 径 还与 凋 亡 相 关; p 3 8 途 径 在己 分 化 细 胞中 的 功能 还 不 清楚， 但目 前己 有证据表明它于血小板激活相关。2 8 基因z n f 6 4 9 的 克隆 与功能研究湖南师范大学硕士学位论文 3 . 2 . 4 m k k 5 / m a p k 途径: 关于这条途径知之甚少， 迄今还未发现此途径的m e k k a e r k s 可被过氧化、 高渗透压等应激条件激活， 也可被一些非应激刺激如血 清激活。 有实验证实e r k 5 可以 被m k k 5 激活， 激活后转位入核2 2 3 .3 m a 尸 k 途径之间相互作用 m a p k途径之间的协同， 最好的例子是以m l 草毒作用受体为代 表的一大类g蛋白 偶联受体，可以同时介导几乎所有已 知m a p k途 径: e r k 途径、 j n k 途径、 p 3 8 途 径、 e r k 5 途径。 这 些 途 径互 相协 同，通过分别作用于转录因子c - j u n 启动子区不同的反应元件，调节 了 基因的转录3 0 ，同时，一些配体在激活一条m a p k途径的同时， 抑制了另一条的活性，使 m a p k途径协同实现其特异性调节。例如 胶质成熟因子被受c - a m p 调节的p k a磷酸化后， 特异性增强了p 3 8 激酶的活性，但同时，它也变成了一个e r k激酶的强抑制因子，抑 制了e r k通路激活。 上游信号的交叉: 途径上游分子的交叉激活是最好的例证。 下游 信号的整合: 体现在不同的m a p k途径可以同时作用于相同的底物。 胞 质底物: e r k , p 3 8均可 激活 m n k 1 ( m a p k信号 整合激酶) 、 m s k 1 。 三者均可激活m a p k a p k 3 ( m a p k途径激活的蛋白 激酶 3 2 1 0 核内 底物: 许多 转录因子都可以被一条以上的ma p k途径调节。 如 前文 提到的e l k - 1 可以 被e r k , j n k , p 3 8 三条 途径 激 活。 a t f - 2 可以 被p 3 8 途 径和j n k 途 径 激 活 3 6 3 9 o c - j u n 可被j n k 和e r k 途径 基因 z n f 6 4 9的克隆与功能研究湖南师范大学硕士学位论文 激活等等3 5 总而言之， 单独一条m a p k如果不放在细胞的整体环境中考虑 是很难阐述其功能的。 途径中任何一个反应的发生， 都依赖于特定的 细胞环境。这也是将来的研究重点。 3 .4 m a p k信号途径与心脏发育 心脏发育是个非常复杂的过程， 受到了 相当一部分基因在特定时 空的精确调控。 在这一过程中胞外信号及其传导和特异性转录因子的 表达起到了关键性作用。 在m a p k 途 径 的 作 用 下 ， e ts 蛋 郭 s r 和s r f 结 合 而 成 的 复 合物诱导早荃因， 如c - f o s 的表达。 在此过程中e t s 蛋白e l k 1 与s r e 的 结合必须有s r f 的参与6 7 。 大量的 研究表明 参与激活c - f o s 的s r f 的表达具有组织特异性。 它能与n k x 2 .5 和g a t a 4 等心脏特异性转录 因子相结合. 在成纤维细胞中，s r f 和g a t a 4 的共同作用可以 激活 肌源性或非肌源性的s r f 依赖性的启动子; s r f 与g a t a 4 及n k x 2 .5 的相互作用可橄活心脏a - a c t i n 的启动子从而诱导这一蛋白 在成纤维 细胞中的 表达6 8 -7 1 ; s r f 与g a t a 6 及n k x 3 . 2 在 动 脉平滑肌细 胞中 和 顺式元件共同徽活a 1 i n t e g r i n、 s m 2 2 a 和 c a l d e s m o n 等平滑肌基因 的表达。 此外在内 皮素通过g p c r ( e t a / e t , ) 调控心脏发育过程中， 也需要s r f 与g a t a的相互作用来激活心房利尿钠肤的表达7 2 。 这 些研究说明了s r f和在心血管特异性基因的表达调控中起到了重要 的作用。 考虑到e l k 1 . s r f 和s r e形成的复合物在启动早基因表达 基因z n f 6 4 9 的克隆与 功能研究湖南师范大学硕 1: 学位论文 过程中的密切关系， 我们有理由 相信 m a p k也极有可能通过 e l k 1 和s r f 的相互作用参与调节心血管的发育过程。 目 前研究证明 m a p k 1 ( b m k 1 胆r k 5 ) 在出生前心血管系统的 发育和出生后的心脏的异常肥大中起着关键的作用。在己知存在的 m a p k激酶5 ( me k 5 )的两种亚型中，只有较长的m e k 5 a 亚型能 有效地激活 b mk 1 。在心肌特异的 me k 5 a的构成性活性形式 ( c a - m e k 5 - a 转基因( t g ) 小鼠) ， 并且 观察 到与 野生型小鼠 相比 转 基因( t g ) 小鼠 心室内内 源性的b m k 1 的 激活 和c o n n e x i n 4 3 的 磷酸 化增加了3 到 4成。c a - me k 5 a 一 转基因小鼠显示了缺血再灌注后左 室高压恢复的显著加快。因此，可以 表明b m k 1在防止心脏在缺血 再灌注诱导的损伤中有新的作用。 此外， 目 前对心脏病理反应过程中m a p k 的研究也说明在各种导 致的心肌细胞凋亡的病理过程中， m a p k 的激活或抑制至关重要。 在 相关刺激，如兴奋剂、细胞伸展和压力等的作用下， m a p k 在心肌细 胞或小鼠 心脏中都 会被激活3 3 。 这说明 这一信号途径很可能与心 肌肥 大相关。 j n k 信号途径在心肌细胞中的特异性激活可以诱导一系列心 肌肥大典型症状的产生， 包括心房利尿钠肤的表达上升， 肌原纤维节 结 构 变 化 等 3 4 基因z n f 6 4 9 的克隆与功能研究湖南师范大学硕士学位论文 4 锌指家族与心脏发育 4 . 1锌指蛋白概述 在 转 录 调 控因 子中， 很多 含 有 锌 指 模体 ( z i n c fi n g e r m o t i f ) 作为 其 d n a结合结构域。锌指模体是通过疏水作用并结合z n 2 + 从而稳定地 折叠 形成 “ 手指” 状的 结构， 含有该 结 构的 蛋白 质称为 锌指蛋白 ( z in c f i n g e r p r o t e i n , z n p ) 。 锌指蛋白 基因是基因组中一类非常重要 的转录因子墓因，它们编码的是一类在形态结构和功能上相 似的 d n a结合蛋白。自 从1 9 8 5 年，在爪蟾卵母细胞中发现了第 一个具有基因转录调控作用的锌指蛋白 转录因子t f i i i a以来， 如今己在酵母、 植物、 两栖动物、 哺乳动物中陆续发现各类具有控制 复制和转录功能的锌指蛋白。如酵母，果蝇，爪蟾，鼠和人。线 虫中有 1 9 , 0 0 0 种蛋白质， 其中约有 5 3 5 种不同的锌指蛋白。 据估计，1 % 哺乳动物基因编码锌指蛋白 1 3 。人类基因组估计 有6 0 0 - 1 0 0 ( 】 个锌指蛋白( z f p s ) 。 人类基因组上有如此之多的 锌指蛋 白， 其原因可能有几点， 第一， 锌指蛋白独特的作用分子结构， 包括 锌指和锌指之间， 锌指和与它相连的框之间; 第二， 锌指中的氨基酸 残基赋予了 其结构识别 序列的 特异性 7 -8 1 ; 第 三， 它们翻译的 蛋白 质 对转录抑制的方式也决定了其数目的巨大。 墓因z n f 6 4 9 的克隆与功能研究湖南师范大学硕士学位论文 制机理虽然还需要更深入的研究， 但其应用价值目 前己经得到了充分 的体现如反义核昔酸、 r n a i 技术一样， 构建融合了k r a b的锌指蛋 白 也将成为有潜力而被广泛应用的、 能特异地抑制某基因表达或抗体 内 某 病 毒的 一 种 新 技 术 方法 4 5 ) 根据现有的结论，推测k r a b的抑制机理可能为:k r a b z f p s 通过其一系列的锌指结构与靶基因的 d n a 序列特异结合。结合到 d n a上的k r a b结构域通过与r b c c结构域相互作用而结合t i f 1 b 共抑制子。t i f 1 b上的h p l b d . p h d指状结构和同源调节域，通过 与其他下游作用因子， 如与b p i 、 组蛋白去乙酞化酶结合， 而使其定 位于着丝粒异染色质或在局部形成异染色质，并且使组蛋白去乙酞 化，从而介导靶基因沉默. 4 . 3锌指蛋白与心脏发育 心脏发育是一个非常复杂的过程， 它需要精确调控基因的表达， 在模型动物中 心脏发育的 调控途径已 取得很大的 进展8 2 -8 4 近年来， 许多基因已鉴定出来， 它们在几种动物中都表现出参与 心脏的发育， 像n io t 2 .5 , m e f 2 c , g a t a 4 , d h a n d ， 以 及 i r x 4 8 5 . “ 8 刀 ， 塞因的正确表达和细胞的正确生长对所有器官的生存都起着至 关重要的 作用， 基因 表达和细胞生长调控缺失将导致一系列疾病的发 生，如最常见的先天性心脏病和癌症， 近年来，对心脏发育和心脏疾病的生理和临床方面的研究已取得 较大的进展， 然而这些过程当中的分子机制仍然知晓不多， 大多数心 基因z n f 6 4 9 的克隆与功能研究湖南师范大学硕士学位论文 血管疾病的识别和治疗都是从表型上入手， 将来阻止和治疗心血管疾 病将依赖于遗传和分子物质的阐明， 尤其需要研究参与正常心脏发育 过程中的转录因子，因为转录因子可能改变基因的表达而参与病理， 因此， 要想阐明心血管疾病在分子水平上的病理， 第一步就是鉴定在 心血管系统的调节基因。 许多锌指蛋白参与心脏门形成和疾病的发生，如 c 2 c 2型的锌指 蛋白g a t a 4 和f o g 2 6 2 , k e n - s h w o d a i 和c h o o n g - c h i n l i e w 报 道， 在心血管系统表达的l l lf r 个锌指蛋白( c v b z f p s ) ， 有8 0 % 是这两 种锌指蛋白 类型一 c 2 h 2 型万c 2 c 2 型， 至少有上百个c 2 h 2 锌指蛋白 在 心 血管 系 统 表 达 63 1 , g a 1 x - 4 ( c 2 c 2 型 ) 对 心 脏的 早 期 发 育 和成 人 钙 依赖性心肌肥大起重要的作月， h f h z ( c 2 h 2 型) 可能对心脏肥大 的 病理 起 重 要 作 用， 另 外l s a l l , w t l ,以 及t r - a l p h a - 1 等c 2 h 2 型 锌指蛋白 也与心脏功能和心脏疾病有关s o -8 4 。 在模型动物果蝇中， a m 参与调节e v e 基因的衷达，控制心脏前体细胞 ( e p c )的形成， 对果蝇心脏的特异分化是少需的。 而打断 z f p基因会导致许多心脏疾病的发生:( 1 )视磺酸受体 ( c 2 c 2型)的无义突变导致心脏输出口和动脉弓畸形;( 2 ) c s n r ( c 2 h 2型 ) 的 反 义链的 打断导 致心 脏环 化畸 形; ( 3 ) 小鼠 缺失 m l p c 2 h c 4 c ( h d ) 型 ， 出 生 后出 现 心 脏肥 大 和 心 力 衰 竭， ( 4 ) 打断 g a t a - 4基因 ( c 2 c 2型)导致心管畸形，心血管疾病与锌指蛋白 有 关的发现， 将更加关注z f p s 对心脏正常功能的发挥和心脏疾病病理 的重要性。7 2 -7 6 1 基因z n f 6 4 9 的克隆与功能研究湖南师范大学硕十学位论文 本文的研究意义 心脏是脊椎动物发育过程中首先形成的器官之一川 。先天性心脏 病是最常见的先天缺陷， 也是婴儿死亡的主要原因之一。 而心血管疾 病是人类致病和死亡的 主要原因， 占总死亡率的三分之一。 相当一部 分死于心血管病， 尤其心脏性碎死病人有先天性的心脏结构异常。 所 以对心脏早期发育机制的研究有利于我们了 解心脏发育的内在机制， 并为先天性心脏病的诊断和治疗提供借鉴。 我们实验室主要是从事心脏早期发育机制的研究。 研究人类心脏 早期发育的分子调控机制将有助于我们更好地理解遗传性心脏病的 发病机制， 并有希望发现遗传性心脏病以 及心血管疾病的新疗法。 克 隆心脏发育和心脏病发生发展相关特异墓因， 阐明它们的功能， 对于 理解心脏发育和心脏病发生的分子机制及发展新的有效的治疗手段 奠定了理论基础。 心脏发育过程中并非所有的基因都表达， 而只是按 严格的时空顺序有选择地表达。 相当一部分基因的表达都参与调控了 一些信号途径从而实现其细胞和组织上