（植物学专业论文）包埋脱水法冰冻保存三种饵料金藻的研究.pdf

学位论文独立创作声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的j i j i _ 究成果。论文r l t 除了特5 j , j j j h 以标 11 1 1 致谢的地方外不包含j e 他人或其它 机键已经发表或撰写过f l j 1 i j f 究成果。j 他同志列本研究的启示和所做的员献均 己a 论文巾做 l i 了1 9 】确的声f j ，f ：表示谢意。 学位论义作者签名： 。专蟹 签宁日期： 护；多、。 学位论文版权使用授权书 木学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文 被查阅和借阀。本人授权辽宁师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库迸行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。保密的学位沦文在解密后适用本授权书。 学位论文作者签名：。j 卷、 签宇日期：p ?g 导师签名：乏包峰 签字日期：加。多、j 6 ，己 包埋脱水法冰冻保存三种饵料金藻的研究 摘要 本文以绿色巴夫藻( p a v l o v av i r i d i s ) 、湛江等鞭金藻( i s o c h r y s i sz h a n j i a n g e n s i s ) 雨l 球等鞭 金藻( i s o c h r y s i sg a l b a n a3 0 11 ) 三种饵料金藻为试验材料，_ i _ f i 包埋脱水法进行冰冻保存。选 择静止初期的藻细胞包埋在含有3 0 氯化钠的3 的褐藻酸钙胶球中，细胞负载约2 0 0 万 个细胞胶球，经过硅胶吸湿法脱水后。探讨了胶球含水量、脱水速率、脱水程序、预培养 以及化冻后恢复方法对冰冻保存存活率的影响。结果表明： 1 含水量对藻细胞存活率的影响 以o 9 含水量h 的脱水速率脱水，胶球含水量对脱水过程的存活率影响不人，但对冰 冻保存的存活率影响很大。各种金藻的最佳含水量不同，绿色巴夫藻为3 5 ，冰冻后存活 率可达6 9 ；湛江叉鞭藻和球等鞭金藻都为3 0 ，冰冻后存活率分别可达1 0 、1 3 。 2 脱水速率的影响 包埋后分别以不同脱水速率( 0 3 、0 7 、o 9 、i 1 、2 、1 3 含水量h ) 脱水， 结果三种金藻都在o 9 含水量，| l 的脱水速率f 获得最高存活率。 3 脱水程序的影响 以绿色巴夫藻为研究对象，选择0 9 含水量i l ( 慢) 和1 0 含水量h ( 快) 两种脱水 速度分两步脱水，先脱水至7 0 含水量再脱水至最佳含水量。结果慢一慢程序脱水，存活 率最高；快一慢程序其次；快一快程序最低。 4 预培养的影响 将胶球在分别含有2 聚乙二醇( p e g ) 和5 聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 的培养基中预 培养9 0 m i n 后脱水。绿色巴夫藻冰冻前后的存活率都有提高，最人可提高6 。预培养对另 外两种金藻的存活率没有提高。 5 化冻后恢复方法的影响 化冻后，绿色巴夫藻的胶球在培养基中室温卜暗放置4 8 h 后存活率最高：另两种金藻 在含有过饱和的n a c i 溶液( 7 5 r 1 - i ) 的密闭气相中室温一r 暗放置1 2 h 存活率最高。 关键词：绿色巴夫藻湛江等鞭金藻球等鞭金藻包埋脱水法 冰冻保存 含水量脱水速率脱水程序预培养 恢复方法 包埋脱水法冰冻保存三种饵料金藻的研究 a b s t r a c t p a v l o v a v i r i d i s , i s o e h r y s i sz h a n f i a n g e n s i s a n d i s o c h r y s i sg a l b a n a 3 0 11w e r e c r y o p r e s e r v e di nl i q u i dn i t r o g e nu s i n ge n c a p s u l a t i o n - d e h y d r a t i o n a l g a lc e l l si ne a r l ys t a t i o n a r y p h a s ew e r ee n c a p s u l a t e d i n 3 c a - a l g i n a t eb e a d s w i t h3 0 n a c l ，2m i l l i o nc e l l si no n e b e a d ，b e a d sw e r ed e s i c c a t e dw i t hs i l i c ag e lt h e nd i r e c t l yi m m e r s e di nl i q u i dn i t r o g e n t h ec e l l v i a b i l i t ya f t e rw a r m i n gw a se v a l u a t e db yc h l o r o p h y l lc o n t e n t t h em a i nf a c t o r si n f l u e n c i n gt h e c e l l v i a b i l i t y , s u c h a sw a t e rc o n t e n to fb e a d s ，d e h y d r a t i o n r a t e ，d e h y d r a t i o np r o c e d u r e ， p r e c u l t u r ea n dr e c o v e r ym e t h o d sa f t e rt h a w i n g w e r es t u d i e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： i ，e 骶c to f w a t e rc o n t e n to nc e l lv i a b i l l t y a ta l la v e r a g ed e h y d r a t i o nr a t eo f0 ，9 w a t e rc o n t e n t h w a t e rc o n t e n i si nb e a d sh a dm o r e e f f e c t so nc e l l v i a b i l i t y a f t e r d e h y d r a t i o nt h a n a f t e rt h a w i n g d i f f e r e n ta l g a eh a v ev a r i o u s o p t i m u mw a t e rc o n t e n i s t h eh i g h e s tv i a b i l i t yo fp 洲l o f av i r i d i sr e a c h e d6 9 w h e ni tw a s d e h y d r a t e dt o3 5 w a t e rc o n t e n t a st oo t h e rt w oa l g a e 3 0 w a t e rc o n t e n ti so p t i m u mt h e i r h i g h e s tv i a b i l i t i e sa r e1 0 a n d13 r e s p e c t i v e l y 2 e f f b e to f d e h y d r a t i o nr a t e a td i f f e r e n td e h y d r a t i o nr a t e s ( a w a t e rr e d u c t i o np e rh o u r0 3 ，0 7 ，0 9 ，i 1 ，2 ， 1 3 ) ，t h r e ea l g a ea l lo b t a i n e dh i g h e s tv i a b i l i t i e sa tt h ed e h y d r a t i o nr a t eo f o 9 w a t e rc o n t e n i ，h 3 ，e f f b c to f d e h y d r a t i o np r o c e d l i f e b e a d so fp a y i o v av i r i d i sw e r ed e s i c c a t e dw i t hf o u rd i f i e r e n tp r o c e d u r e s t w od e h y d r a t i o n r a t e s w e r e u s e d ，w h i c h a r e0 9 w a t e r c o n t e n t h ( s l o w ) a n d1 0 w a t e rc o n t e n t h ( r a p i d ) r e s u l - i ss h o w e dt h a ts l o wd e h y d r a t i o ni st h eb e s t ad e h y d r a t i o nc o m b i n a t i o no f r a p i dd e h y d r a t i o nt o 7 0 w a t e rc o n t e n t ，f o l l o w e db ys l o wd e h y d r a t i o nt ot h eo p t i m u mw a t e rc o n t e n ti sab e t t e r p r o c e d o r e r a p i dd e h y d r a t i o ni st h ew o r s t 4 e f i e c to f p r e e u l t u r e b e a d sw e r ee n c a p s u l a t e da n di n c u b a t e di nc u l t u r em e d i u mc o n t a i n i n g2 p e ga n d5 p v p r e s p e c t i v e l yf o r9 0m i n b e f o r ed e h y d r a t i o n c e l lv i a b i l i t yo f p a v l o v av i r i d i sw a si n c r e a s e d b y6 a f t e rf r e e z i n g p r e c u l t u r eh a dl e s se f f e c to nc e l lv i a b i l i t i e so f o t h e rt w oa l g a e 。 5 e 伍b c to f f e c o v e r ym e t h o d sa f t e rt h a w i n g a f t e rt h a w i n g ，t h eh i g h e s tv i a b i l i t yw a so b t a i n e dw h e nb e a d so fp a v l o v av i r i d i sw e r e i n c u b a t e di nc u l t u r em e d i u mf o r4 8 hi nd a r k n e s sa tr o o mt e m p e r a t u r e a st oo t h e rt w o a l g a e t h e s u i t a b l er e c o v e r ym e t h o dw a st oi n c u b a t eb e a d so v e rs a t u r a t e dn a c ls o l u t i o ni nac l o s e di a rf o r 1 2 hi nd a r k n e s sa tr o o mt e r n r a t u r e k e y w o r d s ：p a v l o v av i r i d i s i s o c h r y s 括z h a n j i a n g e n s i si s o c h r y s i sg a l b a n a 3 0 11 e n c a p s u l a t i o n - d e h y d r a t i o nc r y o p r e s e r v a t i o n w a t e rc o n t e n t d e h y d r a t i o nr a t ed e h y d r a t i o np r o c e d u r ep r e c u l t u r er e c o v e r ym e t h o d 2 包埋脱水法冰冻保存三种饵料余藻的研究 前言 在动、植物组织平细胞培养过程中，常常发生染色体、基冈组和基冈水平上的变异， 导致培养细胞的遗传性状不稳定，形态建成能力逐渐丧失。多年来，人们探索了许多降低 动、植物培养细胞代谢水平的保存方法。1 9 4 9 年p o l g e 等首先发现，甘油可减轻鸟类精子 的冷冻伤害“。此后，人们将低温与冷冻防护剂结合使用，冷冻保存方法才r 泛应用于医 学和畜牧业。7 0 年代，n a g a n ds t r e e t 将胡萝h 悬浮培养细胞保存在液氮后，观察到细胞 的生长，证明了植物细胞的冷冻保存的可行性“1 。 在超低温( 指液氮低温，一1 9 6 c ) 条件f ，几乎所有的细胞代谢活动、生氏过程等都 停止了，因而既排除了遗传变异的可能性，叉保存了细胞的活力和形态发生的潜能”1 。 超低温保存具有许多优点，如长期保存无病原的茎尖分生组织或者罕有的珍贵的植物组 织，便丁国际间交换；如冷冻保存花粉，可延长花粉寿命，便于远缘杂交等，对植物种质 库的建立具有深远的意义。到8 0 年代末，进行超低温保存成功的植物材料已达百余种”1 。 在藻类方面成功保存培养物的资料也很多。其中h w a n gs 等从1 9 6 9 年保存2 2 种单细 胞藻类达6 8 年之久”1 。陈国宜、阙求登在液氮中成功保存坛紫菜果孢子和海萝的四分孢 子，并提山超低温保存法建立海藻孢子库的设想”。 近些年的研究发现，要实现生物材料的低温保存和获得较高的细胞存活率，一般需要 根据所冻材料的特性，选择一种合适的冷冻方法，根据实验目的设计特定的降温程序和复 温程序等，以保持冻存后生物材料的活性。 长期以来，藻类的超低温保存的方法一般为两步法，8 0 年代末9 0 年代初新发展了玻 璃化法和包埋脱水法。 两步法：将预处理后的细胞在程序降温仪的监控下缓慢的冷却至一定的预冻温度，然 后快速冷冻。目前使用该法已成功保存多种藻类但对一些结构复杂的、较人的顽拗型藻 类的保存成功率很低”。而且这种方法容易使细胞或组织在缓慢的降温过程中遭受冷冻损 伤，其主要原因在于：( 1 ) 缓慢降温时，细胞内外冰晶的形成和生长造成细胞质膜等生物 膜的挤压和撕裂，从而产生机械损伤；( 2 ) 冻存液的渗透性与p h 值的变化较大，容易引 起细胞的渗透性损伤；( 3 ) 细胞脱水的溶质浓度升高造成蛋白质和酶活性降低”1 。 玻璃化法：所谓“玻璃化”就是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性与非渗透性保 护剂组成的玻璃化溶液中，使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷到玻璃化转 变温度，而被固化成玻璃态( 或非晶态) 并以这种玻璃态在低温下保存”。运用这种方 法可以使细胞内外避免结晶生成，从而降低对细胞的的各种损伤，但是玻璃化溶液对细胞 具有一定的毒性，复温后其残余会造成再培养过程中一部分细胞的死亡。 包埋( 胶囊化) 脱水法：将细胞悬液与褐藻酸钠混合，在氯化钙溶液中【刮定成胶球， 用无菌空气流或硅胶等干燥脱水到一定程度，放入液氮中。该方法于9 0 年代初建立，操 作简单不需要复杂设备，而且不使用抗冻保护剂无疑是对超低温保存技术的一个重大 改进。 包埋脱水法晟早出现在法国学者保存马铃薯茎尖的研究中。他们把马铃薯攀尖包坶在 褐藻酸钙中用高浓度的蔗糖预培养一天然后用两步法或直接冷冻法投入液氮贮存。结 果表明，保存后茎尖不通过愈伤组织直接形成植株，从而解决了两步法保存后样品有相当 包埋脱水法冰拣保存三种饵料金藻的研究 比例要经过愈伤组织形成才能再生植株的不足，从此包埋脱水法被广泛应用于植物种质的 保存l 。 藻类的超低温保存早先应刚的主要是两步法例如，m o r r i s 曾报道了用两步法成功保 存了2 5 0 种小球藻株系1 ：b e n a m o t z 用该法成功保存了1 2 个株系的海水绿藻“。但是 实验需要严格控制降温速率，在再培养之前需要对冰冻保护剂进行洗脱以减少其对细胞的 毒害。因此，一些学者尝试用包埋脱水法保存藻类。h i r a t a “”等第一次用该法对2 1 种微藻 进行冰冻保存，结果有1 1 种获得成功，其中包括6 种海藻，1 种淡水绿藻和4 种淡水蓝藻。 他还以一种杜氏藻( d u n a l i e l l a t e r t i o l e c t a ) 为例，研究了适宜的基本脱水条件：( 1 ) 预处理蔗 糖浓度为0 5 m ；( 2 ) 平均脱水速率为0 9 含水量h ；( 3 ) 胶球最佳含水量为4 0 ，从而 为包埋脱水法冰冻保存微藻提供了一定的依据。v i g n e r o n 1 等用包埋脱水法对掌状海带配 子体进行保存，也获得了较高的存活率。他进一步验证了胶球在4 0 含水量时存活率较高。 王起华1 “1 等用该法保存坛紫菜( p o r p h y r ah a i t a n e n s i s ) 自由丝状体，发现不经过蔗糖预培 养也可保持较高的存活率。证明包埋脱水法是一种较为理想的保存该材料的方法。 从藻类超低温保存研究的现状来看，对金藻超低温保存的研究还是很少的。金藻是没 有细胞壁的单细胞植物，其中许多种类是海产养殖的优良饵料。因此，无论从理论上讲， 还是从生产实践上，金藻的超低温保存都具有重要的意义。 近年来，c a n a v a t e 等曾对一种球等鞭金藻的超低温保存做过探讨，其内容包括d m s o 、 甲醇等渗透性保护剂对材科的毒性伤害1 和两步法冷冻过程中不同降温方法对存活率的影 响1 。在毒性实验中，c a n a v a t e 等发现球等鞭金藻与2 5 的d m s o 混台超过15 分钟就 不能存活；而与1 5 甲醇混合1 2 0 分钟，存活率没有明显下降。他还以1 5 d m s o 和5 甲醇为保护剂做超低温保存实验，分别得到1 7 1 0 和o 0 0 存活率。不同降温方法实验的 结果表明；接种晶核避免过冷的做法和采用不同的降温速率都没有影响存活率；第一步冷 冻到- 2 0 ( 2 、- 5 0 、- 8 0 ( 2 时的存活率分别为9 3 、2 5 8 和0 7 ；与其它门类的五种单细 胞藻类相比，球等鞭金藻是唯一一种第一步冷冻( 5 0 ( 2 ) 的存活率( 2 5 8 ) 与第二步冷冻 存活率( 4 4 ) 有着明显差异的例子。d a y “和h i r a t a “”等也曾对金藻的冰冻保存作过一些 研究，前者用两步法保存了 印后者用包埋脱水法保存了c r i c o s p h a e r ar o s c o f f e n s i s 。 马志珍和张继红”对球等鞭金藻和巴夫藻( p a v l o v a 舒一m n f ) 的超低温保存作过研究， 两种金藻均能在一定的时间内活化复苏，进行正常生长饿殖。 王起华、石若夫“等对三种金藻的超低温保存也做了研究。发现不同年龄，不同保护 剂，预冻温度及时间等对存活率都有一定的影响。 但是除h i r a m ”“等报道用包埋脱水法冰冻保存了c r i c o s p h a e r ar o s c o f f e n s i s 外，该法对 其他金藻超低温保存的研究还未见报道。 本论文的研究是以三种不同的饵料金藻( 绿色巴夫藻、湛江等鞭金藻、球等鞭金藻) 为 试材，采用包埋脱水法冰冻保存对胶球含水量、脱水速率、脱水程序、预培养及化冻后 恢复方法对存活率的影响做了比较系统的探讨以期找到最优的保存程序，提高金藻在超 低温保存过程中的存活率。 4 包埋脱水法冰冻保存三种饵料金藻的研究 1 材料与方法 1 1 材料、试剂和设备 1 1 1 材料来源及培养 绿色巴夫藻( p a v l o v a v i r i d i s ) 湛江等鞭金藻( 1 s o c h r y s i sa h a n j i a n g e n s i s ) 和球等鞭金 藻( i s o c h r y s i s g a l b a n a3 0 1 1 ) 由中国科学院海洋研究所提供，井由辽宁师范大学植物生理 研究室纯化为单株系。 取2 5 m l 生长6 天的材料接种丁l o o m l f 2 培养基的2 5 0 m l 的三角瓶中。在温度2 3 2 ， 光强2 3 0 0 + 2 0 0 1 u x ，光周期为1 2 ：1 2 的条件下培养到静i l ：初期( 8 天) 。如果没有特殊说明 均以此年龄藻作为实验材料。接种为无菌操作。 o5 0 0 0 七4 0 0 0 r u3 0 0 0 越 龆2 0 0 0 留 聂1 0 0 0 0 8 0 0 迥6 0 0 r 蔷4 0 0 鲎2 0 0 异 0 1 2 0 0 营1 0 0 0 七8 0 0 r 一6 0 0 恻 懈4 0 0 磐 最2 0 0 0 02 468 1 01 2 时问 = 5 0 的存活率作为标准”。 5 3 3 藻类超低温保存的改进和研究进展 近年来采用超低温技术保存藻类种质的研究受到了国际上的广泛关注，1 9 9 8 年在美 国德克萨斯大学召开了首届藻类超低温保存国际学术研讨会，国际上儿个主要藻类保存中 心都对有关_ r = 作做了报道。近1 0 年来，藻类冰冻保存的研究主要集中在两个方面：一方 面是对有经济价值藻类的保存给予更多的关注；另一方面是除继续开展两步法保存的研究 外“，在保存技术上又有了新的进展“5 。7 “”。据最新统计，已对上千种株的藻类进行过冰 包埋脱水法冰冻保存三种饵科金藻的研究 冻保存的研究并有相当一部分获得成功。其中保存最长的己达2 2 年之久，不仅保持了 较高的存活率，而且束观察到遗传性状的改变m 。超低温保存技术的改进在藻种的收集和 保存中也起了重要的作用。 目前，国内外关于淡水，海水及河口藻类超低温保存已开展了一些t ：作，有的已取得 了可喜的成果存活率高达9 0 以上，尤其是m c l e l l a n 测得有些藻类在冰冻1 3 年后，其 存活率没有显著的下降“，这些为长期超低温保存藻类种质提供了有力的证据。 有关微小藻类的超低温保存国内外也有报道。英国的m o r r i s 等人从7 0 年代起先后 对几百种绿藻进行了液氮保存的研究；e t 本的酒井昭”( s a k a i ) 、羽多野1 ( h a t a n o ) 等在小球藻抗冻性和冷冻保存方面进行了较深入的研究。b e n - a m o t z 则探讨了存活率与细 胞大小、年龄、光合活性和叶绿素含量之间的关系“”；我国的阎立强对两种蓝藻”“，王起 华等对j l 种绿藻的超低温保存也做过研究”1 。马志珍等研究1 5 种海产饵料微藻在超低温 ( 1 9 6 c ) 下保存试验结果表明除了2 种藻未能活化复苏外，其余1 3 种微藻都能在一 定的时间内活化复苏，进行正常的生长繁殖，只是各种微藻的生长延缓期和生长率各有不 同“。多数微藻在超低温条件下都能氏期保持生命活力，超低温技术是微藻保种中的一种 较好的方法。 尽管现在超低温保存藻类取得了一些进展，但至今还没有一个较为普遍适用的程序 超低温保存的藻类的种类相对还较少，冰冻和贮存的设备还较为昂贵。实际应用超低温技 术保存藻类种质e l 前还仅限于国外少数几个藻类保存中心对部分藻类的保存。另外，迄今 对某些分类类型的藻类以及一些结构复杂的、较大的顽拗型藻类的保存成功率很低。但近 年来超低漏保存方法的发展已经达到一个新阶段，随着一些新的技术开始刖丁超低温保存 技术的研究中，如天然抗冻保护剂抗冻蛋白的使用，低温生物显微镜的应用以及玻璃化 包埋脱水法等新的冰冻保存方法的建立和发展”。2 ”“”1 ，这些问题有可能得到逐步解 决。然而与国外的研究相比。国内在藻类冰冻保存技术的研究方面仍显得十分薄弱，急待 加强。 5 4 包埋脱水技术超低温保存藻类 5 4 1 样品包埋 将包含有藻类样品的褐藻酸钠溶液滴向c a c l 2 溶液，围化成球状颗粒。褐藻酸钠的浓 度依样晶种类的不同而有一定的变化”i ，从1 - 3 不等，c a c l 2 ( i 胡定剂) f l q 浓度也不尽 相同( 5 0 m m o l l ，1 0 0 m m o l l ) ，保证吲化完成的维持时间至少是3 0 m i n 。 包埋的方法人部分采t l ：j 先将样品包埋再进行高浓度的蔗糖培养处理，这种方法中褐藻 酸钠溶液中可以含高浓度蔗糖，也可以不含高浓度蔗糖。但如果将样品先用高浓度的蔗糖 培养后再进彳亍包埋这时褐藻酸钠溶液中必须含有高浓度蔗糖，否则会使样品重新回到低 渗状态“，在用褐藻酸钠包埋样品时，也可以加入其他保护荆，对防止冻害会起到一定作 f ；i j 。 5 4 2 脱水方法 胶囊化可以较大限度地使待保护材料的结构不致因实验处理或操作中的温度急剧变 化而遭至破坏脱水就是将胶囊化材料经处理，禽水量降刭一定程度，再放入液氮中。 5 4 2 1 直接干燥脱水 将胶囊化材料直接在层流橱( 1 a m i n a rf l o wc a b i n e t ) 无菌空气流中干燥后，放入液氮 包埋脱水法冰冻保存三种饵料金藻的研究 中保存。研究表明，这种方法对保存材料的再生能力有较火的削弱，需要进一步改进，因 而应用不多。 5 4 2 2 高浓度蔗糖预处理 蔗糖处理的e l 的是为了提高胞质的浓度，增加抗冻力平抗脱水力，促进降温过程中玻 璃化的形成。其培养时间与样品类型和蔗糖浓度有关，基本原则是：既要使样品获得高的 抗冻力和抗脱水力，又不至于引起样品太多的高渗损伤。蔗糖可能是通过水替代作用保护 质膜完整性和蛋白质构型。此方法的关键是在于保存不同种质培养基中的蔗糖浓度及处理 时间。一般蔗糖浓度为0 3 0 7 5 m o l l 。另外。在高浓度蔗糖预处理时加入其他保护荆也 能使样品包埋脱水法保存的存活率提高。 5 4 2 3 硅胶吸附脱水法 h a t a n a k a ”在超低温保存中曾采用此法，i ；f = 起华等“”在坛紫菜丝状体的胶囊化冰冻保 存中也曾采刚此法。该法比较容易控制脱水程度，可通过调节硅胶量，测定胶球含水量和 藻细胞存活率来确定最佳脱水速度和脱水龄。 5 4 2 4 与其他方法的结合 大量研究结果表明，在脱水过程中结合不同方法，可提高冰冻保存后的存活率。 d u m e t “”利用高浓度蔗糖预处理，再结合无菌空气流或硅胶等干燥脱水，使油棕桐的体细 胞胚在液氮中保存后的存活率超过了7 0 。样品的种类不同，其脱水时间与预处理时的蔗 糖浓度和其后的脱水方式都有所不同”。因此，必须寻找适合样品本身特性的最佳降温脱 水方法才能提高存活率。 5 4 3 包埋脱水技术的优点 包埋脱水法是以用于人一l 种子方面发展的技术为基础。该技术不仅保持了超低温保存 的优点，而且还具有”：使样品易f r 操作；避免了二甲基弧砜的使川；免去了程序 降温仪的使用，降温过程比较随意；被保存样品体积可以比较大。 样品胶囊化后，避免了其裸露时可能受到的损伤，使样品所处的环境更为恒定。另外， 胶囊化过程同时也是一个制作人一 种子的过程。包埋脱水法的最大优点是使样品获得了较 高的抗冻力，提高了保存效果，降低了遗传变异的可能性“。 5 4 4 包埋脱水法冰冻保存藻类的研究进展 自9 0 年代初包埋脱水法在梨茎尖的冰冻保存中获得成功后，对高等植物科t 质的包埋 脱水保存技术的研究已成为超低温保存研究中的一个新热点。相比之f ，藻类在形态和结 构上具有多样性特点，对其常规超低温保存方法的研究已经表明，在保存技术上不仅和高 等植物之间有很大差异，而且在不同藻类之间往往也有较人差异”+ “l 。因此，研究藻类的 包埋脱水冰冻保存技术不仅有可能为经济海藻的超低温保存提供一条更新更好的途径，而 且可能推动该技术的进一步发展。近年来应用该方法保存一些藻类己获得初步成功。 h i r a t a “”等用此法对2 1 种微藻进行冰冻保存，结果11 种获得成功，其中包括6 种海藻、1 种淡水绿藻和4 种淡水蓝藻；v i g n e r o n “3 1 等用该法保存掌状海带配子体获得成功。王起华 “等用该法保存坛紫菜( p o r p h y r a h a i t a n e n s i s ) 自由丝状体，发现不经过蔗糖预培养也可 保持较高的存活率，证明包埋脱水法是一种较为理想的保存该材料的方法。然而，要位该 技术达到实用化仍需做人量而深入的研究。 根据有关包埋脱水法的研究报道，将国内外关于藻类进行包埋脱水冰冻保存的实验材 3 2 垒丝墼查鲨鲨堡堡童三壁堡塾垒蔓堕型壅一 料列表如下”。”： 袁2 国内外近年来刺用包埋脱水法进行超低温保存的主要藻类丰才料 a n a b a e h oc “i n d r i c a h i m t ae ta 1 ，1 9 9 6 b r a d h i 。m o n a ss u b m a r i n a h i r a t ae la l ，1 9 9 6 c o t d t h r i x b r e v i s 5 m a h i r a t ae ta 1 ，1 9 9 6 c o r o t e h i af n v e r s a h i r a me la l ，1 9 9 6 c h o n z y d o m o r e i n h a r d i i h i r a t ae ta i ，1 9 9 6 c h l a m y d o m o n a ss p h i r a t ae ta l ，1 9 9 6 c h l o r e l l o p y r e n o i d o s a h i r a t a c ca l ，1 9 9 6 c f a s c i a t a h i r a t ae ta l ，1 9 9 6 c r i s c o s p h a e r ar o s c o f f e n s i s h i r a i ae ta i ，1 9 9 6 d u n a “i l at e r t i o l e c t a h i r a t ae ta l ，1 9 9 6 l a m i n a r i a d 捌t a r a g a m e t o p h y t e s t v i g n e r o n ，e t a t ，1 9 9 b f i c r o c y s t i sa e r ：u g i n o s a f l a e r u g i n o s a h i r a t ae ta l 。1 9 9 6 nannochlor“sohirata e ta l ，1 9 9 6 n o s t o cc o m m “b e h i r a me la l ，1 9 9 6 i e s p o n g i a e f o r m e h i r a me ta l ，1 9 9 6 p a n d o r i a am m h i r a t ae ta l ，1 9 9 6 p h o r m i d i u 卅f o v e o l a r u m h i r a i ae ia l ，1 9 9 6 p o r p h y r ah a h a n e n s 括 手起华等，2 0 0 0 r h o d o m o n a so v a l i s h i r a t a e la l ，1 9 9 6 s p i r u h n as u b s a l s a h i r a t ae ta l ，1 9 9 6 volvox口“m“，hirata e la l ，】9 9 6 包埋脱水法冰冻保存三种饵料金藻的研究 参考文献 i p o l g e ca n ds m i t ha u ，p a r k e sas ，1 9 4 9r e v i v a lo fs p e r m a t o z o aa f t e rv i t r i f i c a t i o na n dd e h y d r a t i o na t l o wt e m p e r a t u r e sn a t u r e ，1 6 4 ：6 6 6 - 6 6 8 2 n a gk k hes t r e e t ，1 9 7 3c a r r o te m b r y o g a n e s i sf r o mf r o z e nc u l t u r e dc e l l s n a t u r e ，2 4 5 ：2 7 0 2 7 2 3 罗士韦，唐惕，1 9 8 3 植物组织和细胞的超低温保存及种质库建立的研究现状细胞生物学杂忐，5 ， ( 1 ) ：1 7 4 简令成，1 9 8 8 低温生物学与植物种质的睦期保存植物学通报，5 ( 2 ) ：6 5 - 6 8 5 h w a n g s w a n d l u d o e k g a 。1 9 7 1 s t a b i l i t yo f c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d i n l i q u i ds t o r a g e j p h y c o l ，7 ： 3 0 0 3 0 3 6 陈国宜，胡求登，1 9 8 8 几种红藻孢子的超低温保存热带海洋，8 ( 1 ) ：6 7 - 7 2 ， 7 d a y jg ，1 9 8 8c r y o c o n s e r v a t i o no f m i c r o a l g a ea n dc y a n o b a c t e r i a c r y o - l e t t 盯s ( s u p p i e m e n i ) ，17 - 1 4 8 华泽钊等，1 9 9 4 低温生物医学技术( 第一版) ，北京：科学“ 版祉 9 1 二起华张思栋，削春影，2 0 0 2 藻类种质超低温保存研究概况植物学通报，1 9 ( i ) ：2 1 - 2 9 1 0 下君哗边红武，黄纯农，1 9 9 9 植物样品包埋脱水法超低温 ! l 存的研究进艘植物学通报，1 6 ( 5 ) ： 5 8 2 5 8 6 1 1 m o r r i sgj ，1 9 7 8c r y o p r e s e r v a t i o no f 2 5 0s t r a i n so f c h l o r o c a c c a l e sb y t h c m e t h o do f t w o s t e pc o o l i n g b r p h y s i o lj ，1 3 ：1 5 - 2 4 1 2 b e n a m o t z ae ta 1 ，1 9 8 0 a ，c d , o p r e s e r v a t i o no f m a r i n eu n i c e l l u l a ra l g a e 1 as u r v e y o f a l g a e w i t hr e g a r d t o s i z e ，c u l t u r ea g e ，p h o t o s y n t h e t i ca c t i v i t ya n dc h l o r o p h y l l - t o c o l tr a t i o m a r i n ee c o l o g y - p r o g r e s ss e r i e s ，2 is 7 1 6 i 1 3 h i t a t akp h u n c h i n d a w a nm ，t a k a m o t oj ，g o d as ，m i y a m o t ok ，1 9 9 6 c r y o p r c s e r v a t i o no fm i c r o a l g a e u s i n ge n c a p s u l a t i o n - d e h y d r a t i o nc r y o l e t t e r s ，1 7 ：3 2 1 - 3 2 8 1 4 v i g n e r o nt a r b a n l ts ，k a a sr ，1 9 9 7 c r y o p r e s e r v a t i o no fg a m e t o p h y l e so fl a m i n a r i ad 鲫t a r a ( l ) l a m o u r o u sb ye n c a p d u l a t i o nd e h y d r a t i o nc r y o l e t t e r s 。1 8 ：9 3 - 9 8 1 5 e 起华，刘明，程爱华，2 0 0 0 a 坛紫菜( p o r p h y r ah a i t a n e n s i s ) 自由丝状体的胶囊化冰冻保存辽宁师 范大学学报( 自然科学版) ，2 3 ( 4 ) ：3 8 7 - 3 9 0 1 6 c a n a v a t ejp l u b i a nlm ，1 9 9 4 t o l e r a n c eo fs i xm a r i n em i c r o a l g a et ot h ec r y o p r o t e c t a n t sd i m e t h y l s u l f o x i d ea n dm e t h a n 0 1 j p h y c o l 。3 0 ：5 5 9 5 6 5 1 7 c a n a v a t ejp ，l u b i a nlm ，1 9 9 5 s o m ea s p e c t so l lt h ec r y o p r c s e r v a t i o no fm i c r o a l g a nu s e da sf o o df o r m a r i n es p e c i e sa q u a c u l t u r e ，1 3 6 ：2 7 7 - 2 9 0 1 8 d a yjg ，1 9 9 8c r y o c o n s e r v a t i o no f m i c r o a l g a ea n dc y a n o b a c t a r i ac r y o - l e t t e r “s u p p l c m e n l ) ，1 ：7 一1 4 1 9 马志珍，张继红，1 9 9 7 海产饵料微藻超低温保存技术的研究巾闲水产科学，4 ( 4 ) ：1 3 1 7 。 2 0 王起华，石若犬，程爱华，1 9 9 9 a 3 种饵料金礤的超低温保存研究中国水产科学6 ( 2 ) ：8 9 - 9 2 2 1 h a n t a n a k at , y a s u d at , y a m a g u e h ile ta 1 ，1 9 9 4d i r e c tr e g r o w t ho fe n c a p s u l a t e ds o m a t i ce m b r y o so f c o f f e e ( c o f f e ac a n e p h o r a ) a f t e rc o o l i n g i n l i q u i dn i t r o g e nc r y o l e t t e r s ，1 5 ：4 7 5 2 2 2k a z u m a s ah i r a t a ，m o n t h m a ap h u n c h i a d a w a n ，m a y u m i nk a n e m o t o k a z u h i s a m i y a m o t o ，a n da k i r a s a k a i ，1 9 9 5c r y o p r e s e r v a t i o n o fs h o o t p r i m o r d i a i n d u c e df r o mh o r s e r a d i s h h a i r y r o o tc u l t u r e s b y e n c a p s u l a t i o na n dl w o s t e pd e h y d r a t i o nc r y o l e t t e r s ，1 6 ：1 2 2 1 2 7 2 3 c h a n g r u nl i ，c h i a n g - s h i o n g l o ha n dw e n d e l lq s u n ，1 9 9 9 a n i m p r o v e dd e h y d r a t i o np r o t o c o l f o r 包埋脱水法冰冻保存三种饵料金藻的研究 2 4 2 5 2 6 2 7 c 叫o p r e s e r v a t i o n o f b r a s s i c a t t a p t a ss o m a t i c e m b r y o s