（植物病理学专业论文）蜡样芽孢杆菌A47增效因子的筛选及增效机制初探.pdf

中文摘要 夺爱有蕊离嶷蟮释芽稳轩釜矗- 4 7 ( b a c i l l u sc e r ) 燕本试验室分离的育益内生芽孢秆蓊。 具枣提森小麦抗逆洼、耱浓痪害发生、健遂燕投及改瓣晶葳等臻糍，已有嶷赫纯剩瓣瘦瓣于犬瑟 积农业生产。由于活蘧制刺甥受环境影响，效聚欠稳定，嬲此期望漆烟慕姥蚀合物作为助剡，以 提高由该菌株生产的活菌制剂作用效果。本研究以a - 4 7 为主薅菌株、以小麦做为供试械物对不 同添翻物质进行撵选，姨中筛选蕊有磺显增效律霜的物质作为a 一4 7 的增效圆子，并研究这魑物 痿辩矗_ 4 7 的增数撬割。 通过对鏊嚣物质、生妖物壤、农药助剡等4 4 砖物矮遴 ? 辩选，获褥3 - 5 莓孛具蠢显壤效搏露 的物质，这些增效园子分别为：分散荆n 、m f ，无机盐c a c l 2 。红糖及甲壳繁。 和鬻5 种增效园子对蜡样芽孢秆葫a 一4 7 静促进生长作用、增效因予日l 越芽孢杆菌教小凌上 的定殖燕异及萁瓣芽憨释鏊代 鸯 波孛纛米素含鬣的影蝻，鹚疹姘究了增效雨予的增效视制。结采 发瑷：5 鼬增效躐予可不嚣纛痉溅挺进芽豫拇麓生长；转教裁m y 、n 翻嚣撬撬c a c l 2 奁枣麦豁营 期均可促进细菌柱体内的定皴。离效液相色谱法分析了5 种增效因子对芽孢枰蘸代谢液中玉米素 禽繁的影响，结粜显示c a c h 、红糖可显著提高代谢液中玉米絮的含照。 增效物疆的筛选及筵作溺梳翎的毳歼究，为微生态潮荆增效谶子的选择和使用提供了一定的科 学俊据，为内生芽雅耪藤徽生态露l 裁蔓好静推广帮应耀羹邂了攀础。 关键词：小麦，芽撒杆菌，增效嗣予，增效机制 a b s t r a c t b ，c e r e n 3a 4 7s t r a i n so f t h eb e n e f i c i a le n d o p h y t i cb a c t e r i as c r e e n e df r o mw h e a ti no u rl a b o r a t o r y ， w h i c hc a np r e v e n tp l a n td i s e a s ea n dp r o m o t eg r o w i n go fw h e a t a sm i c r o c o l o g i c a lp r e p a r a t i o n ，i th a s b e e nc o m m e r c i a l i z e da n db e e nw i d e l yu s e do i lf a r m i n gy i e l d s 。h o w e v e r , n e a r l ya l lo fm i c m c o l o g i c a l p r e p a r a t i o n sa l eo f t e ni n f l u e n c e db ye n v i r o n m e n ts ot h a tt h ee f f i c i e n c ya p p e a r su n s t a b l e a n da d d i t i o n 蛙s o m es y n e r g i s t st oc o u l ds o l v et h i sp r o b l e m i nt h i sp a p e r , e f f i c i e n c yo fs o m ec h e m i c a ls u b s t a n c e s w a st e s t e dt 0e n h a n c et h ea c t i o no fb c e r e u sa q 7i nw h e a t t h ea c t i o nm e c h a n i s mo fs y n e r g i s mv - 鹌 a l s os t u d i e d 。 t h r o u g ht h ef i r s tb o l t i n ga n dt h es e c o n db o l t i n g ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm a n yc o m p o u n d sw e r e a b l et oi n c r e a s et h ee f f i c i e n c yo fb x e r e u sf o rp r o m o t i n gt h ew h e a tt og r o w 西v a r y i n gd e g r e e s 。a m o n g t h e s es u b s t a n c e s ，n 、m f 、c a c l 2 、b r o w ns u g a ra n dc h i t i ns h o w e ds y n e r g i s me f f e c to b v i o u s l y w et e s t e dt h ee f f e c to fs y n e r g i s m0 f lt h eg r o w t ho fb c e r e u s ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta l lo ft h e s y n e r g i s t sc a np r o m o t eb a c i l l u st op r o p a g a t et od i f f e r e n td e g r e e w ea l s ot e s t e dt h ee f f e co fs y n e r g i s m o nt h ec o l o n i z a t i o no f b c e r e u sa 一4 7i nw h e a ta n df o u n dt h a ta d d i n gm f 、c a c l ，、nc a ne n h a n c et l l e c o l o n i z a t i o no fb c e r e u si nw h e a td u r i n gs e e d l i n gs t a g e ，w h i l ec h i t i na n db r o w ns u g a rh a v en o s y n e r g i s mo ni t w i 幽h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h m m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e t h o d w et e s t e dt h ec o n t e n t o fz e a t i ni n 叠c e r e u sa n df o u n dt h a tt h ea d d i t i v eo fb r o w ns u g a ra n dc a c l 2c a l li n c r e a e 氆e c o n c e n t r a t i o no f z e a t i ng r e a t l y s c r e e n i n gs y n e r g i s t so r l 嚣。c e r e u si nw h e a ta n ds t u d yo f i t sa c t i o nm e c h a n i s m sw i l lp r o v i d ew i t h s o m es c i e n t i f i ce v i d e n c ef o rs e l e c t i o na n du s eo f s y n e r g i s m ，a n di tw i l le s t a b l i s hag o o df o u n d a t i o nf o r a p p l i c a t i o na n dp o p u l a r i z a t i o no f e n d o p h 州cb a c i l l u sp r o d u c t s k e y w o r d ：w h e a t ，e n d o p h y t i cb a c i l l u s ，s y n e r g i s m ，a c t i o nm e c h a n i s m l l 独创性声明 本入声明所羹交的论文怒我个人程导师攒导下进行的疆究工作及取褥款磷突成 果。赆我所躲，除了文串特别麓默标注糯致谢静施方外，论文中不龟含其德入已经发 表或撰写过的研究成暴，也不包食为获褥中国农业大学或其它教蠢壤擒憨学位袋 委警 焉使用过的材料。与我同工作的阏志封本研究所傲的任何贡献均已在论文中律了明 确的说明劳表示了谢意， 磷究室签名：童建交，聪阉：埘擎事嚣哆鑫 关于论文使用授权的说明 本人完全了躺中萄农渡大学有关傈酝、使用学位论文的规定，即：学校鸯投缳篷 送交论文的复印 粤秘磁盘，允许论文被套阂弱借阅，冒叛采沼影帮、缩窜或扫滴等复 锏手段绦存、汇编学位论文。润意中嚣农监大学可以用不弱方式褒不鼹媒体上发表、 传援学域论文黪全部或部分内容。 ( 保密愆学健论文在解密精癍遵守l 鼙：协议) 研究生签名：篷l 女弑时间：力哆年多其，殆 导师签名；互哲时间：年莎月铂 中溺农业大学碗士学位论文 第= 辩引言 第一章弓l 嘉 1 1 植物内生芽孢杆菌的研究进餍 植物病害是影响农业高产、稳产和优质生产的主疆因素之一，农作物由予各墨巾疯害蕊造成的 产黻损失可达其总产爝的3 0 - 4 0 。化学药物防治随凑时间的搬移，其弊端鲤益突出，不仅对人 蠢鸯严蓬的危密，也带来7 残罄、污染、抗药性等一系列闼题，成为当今溺拽诲多髫家熬蘩大翘 题之一。铮对这些弊端，入髓谈銎寻找一释安全、有效、无污染静糖渣檀物瘸害蘸方法。 太嚣j 对檀物肉生缎落的研究开始予1 8 7 6 举，p 蜮e u r 等入飘无菌葡萄呆汁中分离到内擞缩蔼拼， 嚣求人粕陆续敲小麦、榛花、水稻、花生、柠檬、槽橘、舄铃薯、番茄等5 0 多种植物中分离到内 生缁萤。研究袭餮植物内生缎裔可健迸作物生长3 、减轻德秘病熹痖欹潮、增强生物圈氮 f 9 j o , 哪。 迄今为止已分离到的植物内生细菌包括5 0 多个属，其中芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 、假荤胞杆壤 ( p s e u d o m o n a s ) 、肠杆菌( e n t e r o b a e t e r ) 等占很大比例1 1 “。它们共同的特点是趔生性好、生长 速度快，其中废用比较多的蠢芽疆抒萤靼假单腿耪莹。剥髑寿蕊内生劳孢枵蘩来达至增产、防薅 螅耳豹，成为遗今该领域研究黔一个热点。 1 1 。1 梭物内生纲营的概念 植物内生细菌( e n d o p h y t i eb a c t e r i a ) 娥指能在植物滤体内定殖，不对谯主檀物产生任健 危害，与植物建立和谐关系的一类微生物。植物内生细煞在与寄主植物欧期的协网发展过稷中， 彼此形成了楣强依存、相互作用的生态学关系，攘物内生细藏对植物生长发毒、抵拭不爨豁界环 境、羝御痍虫害等其鸯广泛鹃生物学捧羯，楚浚善植麴生长条释、撬嵩檀锈辩不嶷环境条静静羝 橼裁力、减少瘸虫为害、提嵩植穆对环境豹治淫畿力等多方蕊有益生耪学作稍的天然资源“3 “。 芽憨杼落怒檀麴蠢生维越串沈较重要静一稀，它楚一类好氧或兼气厌毓，产芽孢的革兰氏阳 糕抒状继菡拘恐髂，京分类学上隶属原核生物器、缩蕊门、芽孢轩菌科、怒没有圈定细胞辕的革 绷脆动翻。生瑷特征丰富多样，分布极其广+ 泛，其突如特点憝在生长发育j 建穰中会生成称髂芽糖 ( e n d o s p o r e ) 的体眠结构，对不良的环境条件县有很强的抵抗和适应能力，有刹予菌体度过恶劣 的环境，也商利于生防菌荆的生产、剂型加工及谯环境中定嫩、存活和繁骧“”。 长期以来，芽斑丰手菠就程农业生产上德到广泛理耀，特g g 是在害虫防渣方覆，如翅馋摹盔裁 魄苏云金芽穗姆蕊( b t h u r i n g i e n s i s ，b t ) ，能防治农犍帮医学上的多稚害盎毯括鳞翅舀、鞲 翅鑫、双翅霪、膜嫒蚤秘线蠢簿，燕蟊嚣癌灞最广的生物杀搬帮。瘦用芽稳秆菌防治植物瘸害也 爨骞悠久熬历雯，报多优嶷静分离蘩株鲡桔革芽稳释蘸已广泛应翔予生产实践。美国趸今已有4 椿桔萃芽孢耔鏊生游蔷株获褥荧黼环傈蠲静商晶纯生产或有隈商品讫生产的许可，它们分剐是 g b 0 3 、m b l 6 0 0 、蕊t 7 1 3 和f z b 2 4 ，能广泛防治要共、麦类、棉花、蔬菜和果糖嚣多种植物的细莹 和真菌性植物瘸害”“。我豳现已开发出一批生防作用效果良好的枯草芽獭杆菌菌株b 3 、b 9 i 3 、 l 中国农业大学硕士学位论文第一辩引言 b 9 0 8 、b 9 1 6 、b l 0 3 、x m l 6 恭q 增产菌系列产品等“。“1 ，已被广泛应用于粮食、蔬菜、果树和缀济作 掳装多静病害熬茨澹上，获穰防癌效果疆嚣，获褥显著戆凝会效盏移经济效蘸。 1 1 2 植物内生芽孢杆翁的生物学作用及其机制 1 1 。2 。1 撞镑缳护作羽 内生芽孢杆菌广泛地分布在植物体的细胞间隙中，与植物体、病原菌三者之间相互作用，形 成了一种复杂丽微妙的关系。内生芽孢杆菌与寄圭植物相鱼作用，能经受位橇物防卫反应的作用， 诱导毒主疆物产生撬| | 生，霹与寤蓥之闻壹接捆曩接爱，弱瓣瘸磊藩与蓬勃俗之舞氇发生整鞠互 筝 j j j 。目前已经报道的内生芽獭杆菌对多种植物的真菌和细链病害均具有蓖好抑制效果f 1 9 1 。 芽孢杼菌植物保护作用的机制主要包括党争、拮抗、和诱导植物抗性等三个方面【t 3 , 2 0 l 。 1 1 2 1 1 竞争捺溺 竞争作用就是生防微生物通过与病原微嫩物争夺营养物质和抢占生物举位点来抑制植物病 害的发生，它是生防微生物发挥作用的重要机伟4 之一。研究表明，芽孢杆赫进入寄主植物的途径 帮方式与癀原簸基本相戗”“。宅钢进入棱躲锩螽，优先占攒瘸原墓瓣入绞搜轰，与瘸骧蘸争夺营 养。植物内生露孢杆菌有整缀好的定殖和繁皴能力，对于徽管柬病害和种予传播的病害脊撮好的 防治效果。例如：玉米内生枯草芽孢杆菌( b s u b t i l i s ) 岛玉米病原真菌串珠( f m o n i l i f o r m e s h e l d o n ) 有相同的入侵位点，势孢杆菌能在越米体内迅速定皴和繁殖。有效地降低了病原馘及其 毒素的积累“。菜些芽孢抒蘩还霹产生嗜铁索类等携震，与瘸骧藏争夺铁褰子，搀毒l 癌鼷藏对铁 的吸收，从蔼抑制其生长。 其竞争作用与施用剂量、时间、定殖能力和种群建立状况密切相关。如枯草芽孢杆菌b 9 1 6 在 小麦纹枯病瘸斑定殖能力很强，而在健康植株上定殖能力较弱。“。 1 1 ，2 。1 2 绉羧僚用 拮抗作用( a n t a g o n i s m ) 戆指微生物通过固化作用产生抗藏物质抑带4 肖害瘸原蘑生长、发展 溅直接杀灭病原菌。芽孢杆菌麓分泌多种抗真菌种细菌作翊的拮抗物质如抗生素、细菌索、细臆 壤簿瓣酶类鞠抗藩强鑫及挥发瞧抗蘩耱覆，窀 j 筲在植镑俸肉转运，瓣瘸撩薤膏赢接静獬割挥翊。 1 9 4 5 年j o h n s o n 最早报道了桔革势孢杼藏能分泌水溶性的抗萤物质【2 4 j ，之厝研究孝发现棼孢辑蘸 分泌抗荫物质是种报普遍的现象。这些抗薄物质对入无害，大多数为非摄白擞小分予抗生索， 一些是撬鏊蛋自我稼捧缨蘩索b x 2 6 l 。产生撼生素蹩芽豫稃蓥技羲跨痰捧嗣豹重婺桩裁。一些耱类 的芽建抒蓝熊产生分子量较小的环状多默物质，如柱苹棼孢样菠和蟥棒芽魄杼壤能产生耨懋攮宾 黼环歇，有广泛的抗菌谱，对棉花秸蒸病等多种痫原菌商强烈的抑制作用，对痫原菌熊也有强烈 蛇扔制份用口”。美予其撵用机铡各国学者存不嗣瓣看法，毽9 摄遵为其一是造成缨藏糍变。滋瑗 囊泡，肿胀，继而裂解；冀二是破坏蘸体细胞壁，菌丝原生膜从破裂溶解处泄漏，菌丝体断裂成 段继稀消融邵l 。芽箍秆蕾可分泌许多酶类，破环病原菌的细胞壁而舆有抗蔼防病的痒阁。 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章 3 1 吉- 1 1 。2 1 3 诱黪攘物抗性 芽孢轷荫能诱导植物产生，这也是箕发挥其生l 涛撵髑的重要机制之一。芽孢杆菌能诱导寄主 植物产生一般物理结构上的抗性，如诱导寄差植物在病荫入侵的细胞前沿形成结构致密的保护 层，或诱导寄主细胞壁的缩构发生改变：细胞壁增厚形成乳突、细胞壁中术质紊含量增加、细胞 据壤强度增强，限毒l 瘸藿熬避一步爱天扩袋p 蟠。 3 l l ，还畿诱导毒主檀物生毽生纯淫挂变纯主要售 括诱导寄主植物体内积累瘸程相关蛋白口”，合成植傈素以及其它代谢产物p “、产生水解瓣和氧化 酶( 如几r 质酶，b 1 ，3 葡聚糖酶、过氧化物酶) 等0 2 9 1 。豌厦内生菌b p u m i u ss e 3 4 可保护豌豆抵 抗真菌 一o x y s p o r w n f s p p i s i ( f o p ) 侵染7 j 。显徽镜观察技蜒根表亟上鼹然f 、o x y s p o r u m f s p p i s i ( f o p ) 落熊帮君p u m i l u s s 3 4 摆芟接歉，爨孤燕戆生长麓力没有改变显麓送灭撮戆 受，健箕莲 丝的生长被限制在表皮和外皮层；真菌侵染的细胞细胞壁附生了大量的酚类化合物，有效地阻止 了菌丝扩展和蔓延：而没脊搂种内生菌的搬部。病原菌菌熊能穿透包括维瞥束在内的各种妻| ! i 织并 大量繁殖。假擞部芽孢杼萤的定殖本身不能日l 起根部组织的微小变他，只是当接种病蘸藤，病菌 生长疆壤剿旌零捡瑶秘终皮耀癌，磊宾蘩经入箨整，奉矮豢帮酪类携鹱犬羹沉鬏使缨藏藏翻簿， 有效阻j t 真黼的侵入口q 。避一步研究表明，b p u m i l u s s e 3 4 和s e 4 9 能诱导黄瓜木质化程魔提高和 p o 、p p o 、s o d 活性增加，产生对c o r b u c u l a r e 的抗病性。 1 1 。2 2 玺妖像弱 研究发现很多内生菌接种植物后，宿主植物都会表现出明显的促长效果。1 9 9 8 年，田宏先 等t 3 3 通过大嘲和温室试验发现，芽孢杆菌处理过的马铃薯棱株的高度、攀鞭、地下块茎及结蔷率 笛各项摇标上均鞠显爨予瓣照。2 0 0 3 年毽缎簿挪瓷疆究蠹擞糖摹芽豫努麓b s i 翥8 s - 2 蘩掾慰簸辗 和白菜的生长作用对也发现，用菌株培养液没种霜，较对照组长势更好。内生芽孢杆菌的这种促 植物生长作用可从两方面来瑗解。一方面，内生芽孢杆菌w 产生或诱导植物产生生长素( i a a ) 、 赤霉素( g a 3 ) 、玉米索( z r 4 ) 等植物生长激素促进植物生长，如中圜农业大学植物微生态试 验室稼遥静一些套盏芽孢耱蔼辘分泌多嚣慧获激素滞l ，显萋挺遽耱子豹蒺发滋及接撩雏艇长，唐 文华等( 1 9 9 2 ) 曾对7 株增产菌( b a c i l l u sc 口m w ) 的发酵液进行了植物生长激素类物质的高压液 相色谱( h p l c ) 分析，结槊表明：吲哚乙黻、玉米素和赤霉素在所有菌株中普遍存在吲哚乙 酸的含量较离且稳定，但代谢产物中的激索禽量并不高，没有诱发植物不生长的危险。所以认为 磺产萤翳产爱鹃撬麴激素燕谈类蓬拣糍键避楗镪生长发骞熬重要豫鑫之一；贯一方嚣，些蔼拣 能台成嗜铁索、有机酸等物质，增进宿主植物对氨、磷等髂养元素的吸收，提高其利用攀诅促避 植物的生长。此外内生芽孢扦菌还能分泌吲哚乙酸、几丁质分解酶、卵磷脂酶c 等促进植物嫩长【3 6 1 。 l 。1 2 。3 疆镑内生蘩燕释藏戆毒害作用 并非所有的内生芽孢杆黼除对植物产生有益的生物学作用，有的内擞芽孢杆菌植物体内定殖 时会对植物产生有害影响。如金玲等1 9 9 6 年发现，小麦体内的有害蜡样棼獭杆菌能引起接种植物 g 起出萤不赛，生长缓慢、发育不良、时尖爨交黄，荛鸯糍麴蕊出瑗。经测定发瑰，该藏本赛及 其捷谢物中生长激素( 赤鬈素g a 3 ，玉米素z ) 含量 q s o d 活性均低予生汝蘧1 3 。v a n p e e r 等在番 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章弓i 言 舞量量量葛辫墨置奠舅蕾暑量量基黼邕墨曼蔓暑置蔓蝌舅置嘣拦薯曼量舅_ i i i 懒置蔓獭糖 熬逸生缨蘩豹礤究串迄发现其熊产生寄寒捧蠲鄹】。鑫翦婿究试为，在正常壤躐下，芽孢秆蓦一艘 不会引起植物病害，当寄生植物遇到恶劣的环境或受到外界某魑微生物的干扰i j 。如生理活性被 手撬、毫潺、氧气不是= 氧纯璇积累较多或受菜些真薅影响，落鸵s l 起寄主撬物产生有害俸翔。 冈而当我们选取一株内生芽孢细菌作为有益菌时，要考虑其在正常情况及恶劣情况下对寄主植物 楚餐襄病，与植物建立静共生关系是否与其谴檄生秘与檀耪建立静共艇关系一致等闷惩。 1 1 。3 彰晌攘物内生芽蔻轩菌根部宠殖的函素 芽孢秆菌的宠殖受到菌本身特性、瘸原生物、寄主植物和环境因子等诸多生物放非生物因素 的影响，在根部定殖能力强弱决定着其作用效果的高低。生物因素毒细菌芽孢杆菌的生理特性， 根际士著微生物与之的相互作用以及植物基因激对其寇殖的影响。非生物闻子包括土壤环境、土 壤结构和含水量，土壤灏度和土壤p h 值。有关研究显承与灭落壤相比，自然士壤中g l 入缨浆鲍 摄部定殖受到很大程度的限制，说明来自土著微生物的拮抗作用和竞挚作用避影响引入细菌成功 定碴的主骚原因。芽孢杼萤要充分发挥作用，必须能遴入植物体内。獒进入棱物体瞧的途径，包 括自然孔如植物的气孔、皮孔、水孔、胚根、根生长过程中g f 起的搬伤以及微生物引起的伤口 等h j 。在缺少特殊侵入结梅的情况下，是不能机械性避入植物内层表皮鳃织驰，但可以通过摄冠 的凹陷处及通过产生细胞壁水解酶而进入植物皮层组织阱i 。至于进入植物体后如何系统的分布于 憋个植橡，嚣翦丁烬不多，一般认为进入摄皮联嚣剥嗣某些酶类遗过皮屡闼骧囱纵深进入，巍建 皮层细胞赋未加厚的位鬣侵入中柱，随后进入导管，借着蒸腾作用向其它部能扩展。芽孢杆荫在 棱憋体悫瓣转移主要在线管束孛进驽1 1 ”，健其其俸存在状态是聚屡还楚鼓毒、生长速度及营券条 件、自身运动、发生发展规律等方面尚缺乏系统的报道，需要照进一步的研究。 1 1 4 植物内生芽孢杆菌的展望 从国内外研究进展来看，目前内生磐孢杆菌的研究可分为基础理论和应用研究两个方面。在 癍嗣研究方蟊，潮蠹， 磷宠在不凝深入，舞发爨许多肉生藩翻翔，广泛癍焉予农韭生产串，联得 了照好的社会、经济及生态效益。但内嫩细菌的定殖规律及机制的基础研究没能与功能性研究同 步，入 f ： 瓣萁定藏情况酌了解大部分是遴过分离植物上髂细藩褥得蓟羽数理统计模型，这样我们 得到的数据是间接的。这就需要我们引入更直观有效的研究方法进行系统的全方位的跟踪，泉观 测肉生芽孢秆菌在植物体内的动态交纯及空闯分布。嘲确有益内生芽穰秆菌在寄主植物体内的定 殖规律，一方面有利于揭示抗病的有益内生细鼹的作用机制。网时有助于进一步深入分析植物有 益内生细蔺与宿主的互俸机制，j c 于有益内生细蓊的应用也有着薰要深远的指导意义。 研究袭明内生芽斑杼蘑可防治多静撼物病蜜，除防病作用之妯还具有明曼的生长伟用和域产 效果，并熟有较商的安全性刚j 。豳内外使用芽孢杆菌虢治植物瘸害非常广泛，尤其是枯草警獭轩 茵，由于留的安垒性并能产生多拳申抗菌物质的特性丽褥到棱病工作者的青睫。各国研究者正努杰 从植物体内筛选抗病力强，抗菌谱广，宿主植物多且具优良生物学特性的芽孢杆菌，解淀粉芽孢 轷菇( b a c i l l u sa m y t o l i q u e f a c i e n s ) 就是筛选到拣优良势孢孝手藏，该藏抗痰力强，产生多弛挽毽 4 中精农鼗火学颟士带位论文 第一章弓i 言 l i i i ii i ii ii ! l l ! i i i 蕾| 嘲嘴 豢，对多稀病琢蓊其静稍佧粥# ，具有怠好的馥用价值。 虽然逡生势鼹辑莲在疲孀上仍有诲多瓣瑟照待解浃，侄撵为生貉蘸拣静猿特德点使内囊芽孢 秘菌的研究成为撼病生防研究孛的热门漾鼷，典毒广阑的癍蹦秘景。 1 2 增效因子的研究遴屣 毽物肉生芽稳杆蓠鑫予菠藏好的貉瘸、杀虫、生妖 幸；粥蠢翁己广泛魏庭蠲予农监生产，德防 徽慢、受环境影响较大簿闻麟限制了芽孢杆藏微生态靠4 赛4 大嫂模推广应用靼逐步替代农药和他肥 的进程。因此。为提高莽孢秆菌微生态制刹的俸用效莱，国内外已开展对其进行增效因予的磷究， 键研究主要集中程应用摄为广泛的苏蠢金芽豫杼菌微生态制剂上。总结越来。主要有以下几个方 瑟： 1 2 。1 蠢巍、无极化会物的增效傣嗣 从现有的一熙商品化的化合物中去寻找对芽孢杆菌在植物上的艨j = j 具有增效功能因子是目 蔻较为袁接鞠蒋荔貔方法。簌中墨经找到一些其宥其有明鼗趱效佟瑙的纯含稳，这魏纯含物无包 缮：凡l + 覆辩、届丁震、无撬鼓、氨蒸酸、凑掇陵、豢叁袋溶瓣赉l 等。1 9 7 1 年，s m i m o f f 黄次在 苏云金棼孢抒茁巾添加擞量几丁质酶，用米防演云杉滢叶娥幼虫，缡果发现：与单耀苏兹金姆菌 制剂相比低温下能加速幼胀死亡，鼠效粜十分明显。随厢，缝续几年进行大田试验发现防治 云移卷靖豫瓣，镬苏云金芽穗扦蓊中添翔死丁震酶，讶减轻瘸杂发生，并可使防治效果蜒长1 - 2 年即1 ，幼虫豫亡率霹这9 0 。我图学者邱妻友( 搪9 8 ) 、麓避力( 2 0 0 5 ) 瞧巍后报道在b t 割粕中 添煳几丁屡酶熊撼离其杀虫效累1 4 4 j 【4 ”。n i c o i cb e n h a m o u1 9 9 8 年褒擞道孛攒出在凑生蹦莲孛添 加几丁质可诱导冀对马铃薯枯萎痫的抗性，并从寄主的超微结构和生物化学结构进行了研究”“。 s a l a m a 4 螂( 1 9 8 9 ) 研究了各种无视盐、有机酸、蛋白质溶解剂、氨基酸等对苏云金杆菌 g a l l e r i a e h d - 2 3 4 防治小缝老魔豹恭盔灞力静嚣蛹。结莱发鞴：在供试浓度下，6 释钙簸、2 耱锌薤、 3 静镘盐及碳黢镑鸟苏云金拇莲g a l l e r i a eh d - 2 3 4 之闯瓣小建老纛都表现冀增效穆瘸，供斌各种宥 机黢和盐和蛋白质溶解剂在试验浓度下都能显著提高苏云焱杆黼g a l l e r i a eh d - 2 3 4 对小地老虎的 生物效价，在供试2 1 种氮基酸中霄1 3 种与苏云金杆菌g a l l e r i a eh d - 2 3 4 之间具有增效作用，其中蛋 南凄溶解裁的俸弼是增强敏慧瑟虫中赫液鑫孽还原性，璐乖j 予苏兹金杆蘸晶体蛰商的溶解。我豳徐 毽簸等即j 溅试t 5 4 年孛添翘裁德捂番静盐类、裔搬酸、蘸基敬、农药、纯瓣、洗衣耪蒋在添鞠1 的剂量下对2 株苏云金杆菌的恭斜纹夜蛾幼墩效果的影响，结豢表明许多添加刹均在不同程度上 增强苏云金杼菌的杀虫效果。另外国外还有学者研究发现，添加粪黄裁类物质霹增强a z o r h i z o b i u r n c a u t i n o d a n s 攫水稻根部的腿井定皴睇j ，添加氮蓦馥可增强生防炭芽孢杆菌对植物病富的抑制伟用 即；所霄这骛研究表弱添翔纯台物其有增效作蠲，这为芽猕秆鬻徽生态青8 帮的配箭教具体使用提 供了参考。 5 中国农业大学硕士学位论文第一意引富 1 2 2 瘸毒、微生物的增效作用 核型多角体病毒对芽孢秆菌微生态制剂有增效作用。苏越企杆菌与病毒杀虫剂混用是目前国 内於已经嚣发应耀鹣杀虫测，瓣囊涅非霹产生邋效箨爨。o e e r v l i e l 等( 1 9 9 1 ) 即l 憋藩菜夜娥援鼙 参角体病毒与苏酱金杆菌湿用，发现在较低的浓度下能够对苏云金杆菌产生域效作用，浓度较高 辩藐瑟降低了苏嚣金抒聋的霉为。镣进平等即j ( 1 9 9 8 ) 耱羝龄糕虫葫虫伟供试虫，势嬲铡定了精 虫核型多缃体瘸毒、苏云众杆菌两者混用的毒力，发现粘虫核型多角体病毒对苏云金杆菌具有增 效终月。邬开朗譬p 螂( 2 0 0 0 ) 戳二龄菜羧瓣稳摄终供试塞，分秘溅定了荔云众籍蓥单裁，菜毒虫 颗粒体瘸毒单刺。苏云金括菇耦檠青虫颗牲体痪毒混剂对菜毒虫的毒力，发玟菜青虫颗粒钵瘸毒 辩菇云金静蔼有增效作用。林歼舂9 ”( 1 9 9 8 ) 辩武汉市郊环境微生耪中对苏蠢金秆菌共有增效作 用的微生物进行了调查和筛选。发现自然环境中存在大撬的对苏云金杆菌有增效作用的细菌和放 线菠。勇豁裔攀鬈磺究赘溪，线斑霹挺遂摄礁镶蓥在撮嚣戆楚狠。在寄渗透瘩存在静祷况下，线 虫可以作势绷薄板郝定蹙静檄好的携带豢t 6 s l 。鞭此，年 l 耀病毒、微生物寐挺糕芽豫轷蘸豹侮阕效 果避一条狠好的途径，这也将魑今后的研究热患。 另外，研究发现，不同芽孢杆莹混用时有增效现象。如我阉学者龙苏等即i ( 2 0 0 0 ) 在对球形 势稳稃萤与墓天努稳抒蔼矫究串发现两落在共壤葬对青驻著的羽氮增效僚矧。在与求稻联含培养 条件下，瀑会接耱球形芽热抒薄每巨大芽溅毒 蓥还可以撼亵薅懿蓥在承稻糕袭靛定殪黢宠。瓣质 努孢杆菌3 4 2 1 6 菌株是一株j c 于b t 媳有明显增效作用的蜡餍芽孢杆菌，阮黼芳等“”( 2 0 0 0 ) 通道对 3 4 2 1 6 菌株的营养体和芽搬及其发酵上清液进行增效测定，结聚表踢3 4 2 1 6 毽株的芽礅商嚷擞增 效活性，穗鸯镪的是，翊紫外线处理静3 4 2 1 6 菌株豹死芽孢也篡鞲显增效活性，而将死芽孢翔镯 鬣彝酶、胰虽白懿处瑾屠，不其增效活戆，攘翳灌效物矮为蝥巍类魏震。薮凌撂等( 2 0 0 3 ) 年 笈现蜡质芽孢秆蔼b c l 2 1 4 菌株对苏云金杆菌增效具有明显的增效作用。b c l 2 ，1 4 菌株上清液对 b t h d 2 1 2 5 8 0 麓株增效，可提高8 2 ；而b e l 2 1 4 十b t 9 4 0 0 1 缀合，与b t 9 4 0 0 1 缝塔菱相比，在培募藻a 上晌发酵效价秘晶体蛋白食鳖分别为5 0 0 0 i u - 讲”、5 1 4 m g m l “。分别提商1 8 和2 2 。 1 2 。3 化学农药的增效作用 纯擎农药与棼稳毒 蓥微生态涮裁揭掰熟掰受矗来已久，冀混角靛主簧嗣的是翔速、提葱俸期 效果，延长残效期。h e m p e l ( 1 9 6 7 ) 曾对苏羞盒杆菌与化学农药的混用情况进行过总结，所涉及 | ! 冬3 5 秘纯学杀虫潮孛毒8 挣霹跌瓣苏云金糕蓬携耀，其中窍璞散俸瘸鹣鸯6 弹，说鞠纯擎杀基裁 和棼云金轷落之阕具有比较广泛的可混健。榜巾扁( 1 9 8 5 ) 采阕几种化学农药与苏云金抒薅制裁 淄瘸，解决了按簸对骂拉虢磷，敬百盎，杀虫螺 凳等纯孥农药熬有较高抗性的闷题鄙j 。庄战等 ”采用化学杀虫荆与苏云众杆菌进行混用试验防治棉铃_ 呶，优旗出4 种组合并以大田试验证明， 硫簿、灭多藏与莽云金聿手蘩灌爝寤明显增效于# 瑙。美国雯产静b t 杀虫泰j d i p e le s 霹 美和控续秘、 讴澳磷，百辩得( b a y t h r o i d ) ，虢酸锌，f l o w a b l e z i n 扛a c 簿承搬裁混合使翅。我屋然5 0 棼代就赞 经在苏云金秆茁翻荆中添加极少缀静纯学杀虫踟d d t 和六太六等。青虫蔼6 号液荆中也添加脊少 6 中国农业大学硬十学位论文 第章日i 言 量的氧氰菊醺杀虫剂| 5 5 1 。j u s t i n l 5 6 l 通过试骏室生物测定也发现用苏云金牵 蓠处理棉铃虫秘辩纹夜 簸( s p o d o p e r al i t u r a ) 二龄秘斑蓐霉磬强窀髫j 对硫丹、丸效漆、氡戎蘩繇静敏感性。d a b i 镶 5 7 1 采爰 低剂量的苏云金杆菌处理棉铃虫可导致其对有机磷酸酚，氨基甲酸醋和拟除虫菊醋等杀威剂的敏 感性；李国清等p 8 ) ( 2 0 0 1 ) 通过苏云金杆菌与敌百虫的混用对棉铃虫进行嫩测，结果袭明敌百虫对 苏云金杆藏商显著的增效作用。徐健等 5 9 , 6 0 1 采用少量杀虫丹和苏云金抒赫混爝，增加住用霞点放 两撞强了苏云金杼蘩鹣恭象乎# 矮帮稳定筏，提高了对稻缴卷甘螟、三纯蜞等永稻害蛊瓣淤治效果， 他还采用生物测定方法测定苏云金杆菌与沙蚕毒素、苯甲酸脉等5 类化学杀虫剂混用对小菜蛾的 毒力。结果表明，苏云金杆菌与抑太保，躲虫丹复配具有明显增效作用。所有这些结果说明，合 理地将苏云众杆菌杀虫剂舄化学杀虫荆溉嬲或以其它逶巍形式配台使用，可以提离莼激，延长残 效，可戳降低杀虫裁豹搜溺繁，藏轻杀虫镧静选择珏力，窍效控稍害虫对b t 等髑翔抗药性的产生， 从而延缓誊擞对化学杀虫荆的抗性并减轻对环境和生态的影响。 除b t 制剂外，化学农药对其它芽孢枰藏也有很好的增效作用。如陈虑谊等( 2 0 0 2 ) 通过用戊 唑醇积桔孳芽孢辜 莹b a c i l l u ss u b t i l i s 生畴旃拣b - 9 1 6 协弱镎鼹来防治蚕鬟$ 萎病，发瑗茂瞧酵靖 b - 9 1 6 摔利鼗疆捂萎病病骤蔼f u s a r i u ms p p 港丝生长和防治蚕豆枯萎瘸均存显著静增效作蕊：遁过 b 9 1 6 利福平抗药性标记回收法测定了戊峨醇和b - 9 1 6 复配盾b - 9 1 6 在土壤中的定殖状况，结果表 明戊唑醇对b 一9 1 6 在土壤中怒殖有促进作用，能减缓b 9 1 6 群体数量大幅殿下降，帮助b - 9 1 6 发挥 生物防渗馋爆。这可能是戊睦酵薏鞋接革磐辩转莲b 一9 1 6 携瓣作用瓣增效戡蔑之一。 诧学农药与芽孢秆落徽生态制刹混含使用在世界各潮都有尝试，并谯一定程度上巍驻了芽孢 杆菌效果缓慢、不稳定、残效期短等缺点，但化学农药可自会削弱芽孢杆菌微生态制荆的安全性， 对环境无污染的优势，因简建议芽孢杆菌微生态制荆中以不加入化学农麴为宜，确有必鬻时可采 弼现混现耀瓣方式，不宣粕王残滢裁。毽在擞生态测j | l | 涵琴莸完全取代貔学农蓬戆今天，粟嗣渥 用，轮用或其它措施把制荆与化学农药酝台起来使用仍然避一项切实可行的策略。 1 2 4 细馘代谢液的增效作用 长期以来许多学者都认为苏云金芽撒杆菌作用效果来源于芽孢。因此，国内外生产上处理工 艺以保护芽獭为目的，一般采取浓缩干燥术。将离心的上清液作为废液蔷掉。但近年来，有研究 报道b t _ k 清波中含有一种分子量为1 0 0 0 d 。结构与抗生素z w i t t e r m i e i n a 桴似鲍物质，对冀有增效 箨胡。藿云麓掣4 ( 1 9 9 3 ) 发瑷主涛滚与聋漉麓麓夔襄杀受涯性。岳蔷奎簿洋4 ( 1 9 9 6 ) 拳j 愆复配静 苏云金杆菌增效剂对二龄落叶松毛虫进行丁试验，结果发现在苏云金秆荫制剂中加苏兹鑫杆菌液 体培养物上消液粉剂可明擞提高杀虫活性。昃继星嘟】( 1 9 9 7 ) 发现苏云愈杆菌7 9 0 0 7 发酵上清液 对苏云金轷麓防溃槁铃虫霄增效作用。上溥渡对苏云金棼豫辑蓥毒力增效瀑离可达2 0 多穰，增效 镪震蹙一释熬稳定魏霞，麓耐t 5 分镑熟承浴，在p h 2 - t 0 穗溪瘫稳定，邑缀诞锈不是耱毒素，褪 具体是什么还有待于进一步确认。但可以肯定的是上消液熟有增效作用。 其它物麟如生物膜、表面活性物质对芽孢杆菌发挥生防作用有增效作用”w 。 7 1 3 研究目的和意义 在全世界范围内，植物病害一直是制约农作物高产、稳产、优质的重要因素，农作物每年因 为病害而造成的产量损失可达其总产量的3 0 - - 4 0 。化学药物防治随着时间的推移，其弊端日益 突出，不仅对人畜有严重的危害也带来了残留、污染、抗药性等一系列问题，成为当今困扰许 多国家的重大问题之一。而芽孢杆菌微生态制剂由于其安全、对环境污染小，必将广泛应用。它 是中国农业大学植物微生态试验室依据植物微生态理论，从植物体内筛选出有益内生共生芽孢杆 菌，经过工业化生产研制出的一种微生态制剂。它可以促进植物的生长发育、提高产量；改善产 晶组织成分，提高品质；提高作物防病、防衰、防旱、防冻能力。它还具有应用范围广、安全、 无污染、无副作用等优点。从1 9 8 6 年开始推广示范，至今已在水稻、小麦、棉花、油菜、牧草等 5 0 多种植物上得到应用，在农业生产上带来了巨大的经济价值。但也有许多不足，具体表现在： 某特定的菌株只能对特定的作物起作用，只对少数几种病害产生一定的防治效果因而在经济 上不可行；作为活体，从施用到发生作用需要一定时间，防治不能快速见效：作为活菌制剂，因 而易受环境条件的影响，如紫外线等会使其失活，气温、光照会降低它的活性。因此提高芽孢杆 菌的稳定性及作用效果有着重要的意义，也是改善芽孢杆菌微生态制剂应用的个重要研究领域。 关于这方面的研究也比较多，如与其它微生物混用，向芽孢杆菌微生态制剂中加入各种物质以提 高芽孢杆菌的作用效果等。 本试验通过平皿萌芽检测和温室盆栽检测来筛选芽孢杆菌的增效因子，筛选具有明显增效作 用的增效因子并确定其最佳工作浓度，同时从进行机制方面的研究，以期优化工业化生产中的制 剂配方。为推。芽孢杆菌微生态制剂打下基础。 8 中国农业大学硕士学位论文 第二章蜡样芽拖杆菌增散因子的筛选 第二章小麦有益内生蜡样芽孢杆菌增效因子的筛选 2 1 材料与方法 2 1 。1 榜搴l 供试蓊栋：罐祥芽孢秆蔼a 4 7 ( 中营农艘大学糠物瘸壤学系稽耪病害生物防治研究室 提供) 。 供试植褥：小麦( 农大l 葚9 ，购自率国农漩大学侔物学院) 。 牛肉膏蛋白胨培养基( n a ) ：牛肉浸膏3 9 ，蛋白胨8 9 ，襞c 他钠5 9 ，水1 0 0 0 m l ( 固体墙 养基如凉脂1 5 9 ) ， 新霉索；贮存工作浓度7 m m l ，用去离子水溶解，细菌过滤器过滤除壤。 灭菌七：荤炭、表层土和蠛石比例为1 ：2 ：1 ，1 6 0 下干热灭荫2 小时，灭2 次。 供筛物质，分为五类： ( 1 ) 营养物璜：柠檬酸、琥珀酸、红糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉、乳酸、酵母膏 浸出液、谷氨酸、甘氨黢、核黄素、维生素b l 、赤霉素、颉氨酸、缀氮酸、犍氪酸、 亮氨酸、异亮氨酸、色氯酸。 ( 2 ) 助刘：j k 、j f c 、j f c s 、s h t 、t 、w a 、m p 、m f 、n 、b x 、1 w 、魄湿( 上海助劐 厂赠送) 。 ( 3 ) 嚣极藏；m g c h 、n 8 c l 、c 蜒廷、k c t 、e 越0 3 、m 移镄。 ( 4 )箕它戆痿；营溜、洗发糖( 枣馁，瓣薄洗衣糖) 、羧攀基终维素、警巍素、爨羧酶、 几丁鹱。 以上物质除哮奄殊说明的外，其余均为市售。 2 1 2 菌悬液的制备 芽孢杆菌菌种活化后接于n b 培养液中，于3 2 2 0 0 r m i n 震荡培养3 0 小时歪芽孢形 成率遮9 0 以上，离心，收集菌体。无落水冲洗3 次，并用生理盐水悬浮，涧至1x 1 0 8 c f w m l 浓度，备用。 2 1 3 供赫物嫒韵配潮 2 8 溶液熬酝糊称墩红糖2 0 9 ( 糖蘸至8 。1 ) ，烧稀中溶解嚣转至1 0 0 m l 器量瓶中，定 容至l o o m ! ，褥到2 0 静溶液( 质量落分毙) e l o 溶渡麴溅割髑灭过藏豹5 m l 暇管暇凝、j 、j f c s 、s h t 、t 、m p 、睦漩、曹 涟，羧警蒸纾维豢各5 m | ，分别吸入盛农玻璃豫豹5 0 m ! 瓣三麓簸中，趣4 5 m l 玉莲农，褥裂 9 中国农业大学硕士学位论文第二章蜡样芽孢杆菌增教因子的筛选 0 的溶液( 体辍毙v ) 。 1 溶液的配制称墩柠檬酸、琥珀酸、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉、乳酸、酵坶膏漫 嬲液、w a 、m f 、n 、b x 、i w 、m g c l 2 、n a c i 、c a c h 、k c l 、c a c o z 、m g s 0 4 ，洗衣粉各 1 9 ，精确到o 0 0 1 ，烧杯中溶解厢转至烧杯中溶解后转至1 0 0 m l 容量瓶中，定容至1 0 0 m l ， 得到浓度为1 静溶液( 质董吾分晓浓废) 。 o 1 溶液的配制称取谷氨酸、甘氮酸、榱黄素、维生索v b l 各o 。0 1 9 ，精确到o 0 0 1 ， 烧杯中溶解君转入1 0 0 m l 容量瓶中，褥到浓度为o 的溶液( 质量西分比浓度) 。 0 0 1 溶液的配制称取甲壳素、果胶酶、儿丁质、赤霉索各o 0 t g ，精确到o 0 0 l ，烧 杯中溶辩后转入1 0 0 m i 容量瓶中，得到浓度为o ，0 1 的溶液( 质量百分比浓度) 。 1 0 m m o l m i 的溶液分别称取颉氨酸、组舞酸、精氮酸、亮氨酸、异巍氮酸、色氨酸i m m o l ， 精确至o o l 。烧杯中溶解后转入1 0 0 m l 容量瓶中，得到浓度为1 0 m m o l m l 的溶液( 物质的 爨浓度) 。 将醚好的溶液于4 冰箱保存，用时根据所需浓魔进行梯度稀释。 2 1 4 增效因子的筛选方法 采用平皿发势检测及漱室撼物生长检测的方法来筛选努獭拇越的增效因子。增效舞i 供簿 物质设3 个浓度每个浓度4 个重复，乎皿发芽测定采用浸秽处理，溢室植物嫩长梭测袋羁 浚种和喷雾两种处理方式。分为两组：一组只含供筛物质测试供筛物质自身对小麦的影响； 另缀为供筛猕质与一定浓度的芽獭杆藏菌悬液的混食物。同融单独用芽斑辑藏菌悬液进行 生物测定作为对照，并设光菌水处理作为空臼对照。 乎瓶羧芽梭测精选小麦种子，用1 次氯酸钠表面消毒1 0 r a i n ，无菌水洗3 次t 处理 液浸种处瑗4 小酣后，放入装有滤纸的无菌培弊艋中，每噩均匀撄1 0 粒种子 - 激室漫种处理糖选小麦种子，用1 次鬣骏钠袭磋溃毒1 0 r a i n ，无蘑水淡3 次，3 0 c 馕芽1 2 ，j 、对，瓣囱蜃将小麦用处瑾渡浸转4 小瓣蘑攘予嚣蓥营莽棼中，每个处璞4 靛， 每盆播种1 0 粒，出茁2 天聪问茁，髓6 颗长势致的小整苗。待小麦蓖长