（药剂学专业论文）川渝产细毡毛忍冬的质量标准及指纹图谱研究.pdf

川渝产细毡毛忍冬的质量标准及指纹图谱研究 摘要 目的：细毡毛忍冬( 三d 刀配p 阳s 砌f 凰h e m s l ) 为忍冬属植物细毡毛忍冬的干燥 花蕾或初开的花( 习称长吊子银花) 。具有抗菌消炎、清热解毒、凉散风热的 功效，主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温热发 病等疾病。其主要有效成分为绿原酸、异绿原酸、总黄酮。细毡毛忍冬为川 渝产金银花的主流品种。本课题将对川渝产细毡毛忍冬的生药学特征进行研 究，对其进行薄层鉴别，并进行有效成分的含量测定，同时对其进行指纹图 谱的研究，来提高和完善川渝产细毡毛忍冬的质量控制方法。方法：为了对 川渝产细毡毛忍冬的质量标准进行全面控制，本课题采用原植物鉴定、性状 鉴定、显微鉴定等方法对川渝产细毡毛忍冬进行生药学鉴别，采用薄层色谱 法对绿原酸进行定性鉴别，采用紫外分光光度法测定了总黄酮和总绿原酸的 含量，采用高效液相色谱法测定了绿原酸的含量，并采用高效液相色谱法对 其指纹图谱进行了研究，为开发利用川渝产细毡毛忍冬提供科学依据。结果： 原植物为多年生半常绿木质藤本，幼枝、叶柄和总花梗均被开展的淡黄褐色 长糙毛、短柔毛和稀疏腺毛，双花单生于叶腋或少数集生枝端成总状花序。 药材具有花蕾细棒槌状，表面为黄棕色、红棕色或绿色，非腺毛较稀疏，腺 毛较多的特征。花粉显微特征具有两种腺毛细胞，厚壁非腺毛细胞，薄壁非 腺毛单细胞，花粉粒：类球形，具3 孔沟，还有棱角细尖的草酸钙簇晶。在 薄层色谱中能检测到绿原酸；采用紫外分光光度法测定总黄酮和总绿原酸， 测得川银花中总黄酮在0 0 1 o 0 8m m l 范围内具有良好的线性关系( r = o 9 9 9 8 ) ，回收率为9 7 7 1 ，r s d 为1 4 8 。采用瑚d l c 测定绿原酸，在o 8 8 g 范围内具有良好的线性关系( 厂= o 9 9 9 9 ) ，平均回收率为9 8 3 4 ，r s d 为o 9 1 。采用高效液相色谱法进行指纹图谱研究，测得药材有1 1 个共有峰， 共有峰的参数符合“中药注射剂指纹图谱技术要求”的有关规定。结论：薄层 鉴别显示细毡毛忍冬中含有绿原酸成分；紫外分光光度法测定其总黄酮和总 绿原酸含量，方法操作简便、快速、灵敏、具有良好的重复性和回收率，可 作为细毡毛忍冬总黄酮和总绿原酸的含量测定方法。高效液相色谱法测定绿 原酸的含量，方法操作简便、快速、具有良好的重复性和回收率，可作为川渝 产细毡毛忍冬中绿原酸的含量测定方法。采用高效液相色谱法进行指纹图谱 研究，方法准确，重复性好，建立的指纹图谱检测标准，可作为细毡毛忍冬质 量评价与品种鉴别的重要依据之一。 关键词：川渝产细毡毛忍冬；质量标准；指纹图谱 i 1 i l l ! l i | | l | l | l l l i l 1 1 | | 1 l f f l | l l y 17 8 4 8 7 6 t h e q u a l i t ys t a n d a r d sa n dh p l cf i n g e r p r i n ts t u d yo f 三d 刀记p ，馏 s 砌协h e m s lf r o ms i c h u a na n d c h o n g q i n g a b s t r a c t s ：o b j e c t i v e ：d 刀记g 朋s 砌f 凰h e m s l 行o ms i c h u a na n dc h o n g q i n ga r ed 叫 b u do rw i t ht h ef l o w e r s o p e n i n e a r l y i tb e l o n g sl o n i c e r am a c r a n t h o i d e s h a n d 一m a z z a n dl o n i c e r a h y p o g l a u c am i q a n d l o n i c e r ac o n m s ed c 0 f c a p r i f o l i a c e a ep l a n t s t h eu s e so fw h i c hi n c l u d e sa n t i b a c t e r i a la n t i - i n n a m m a t o r y h e a td e t o x i 6 c a t i o n ，c o l dw i n ds c a t t e r e dt h ee f r e c to fh e a t i ti sm a i n l yu s e df - o rt h e t r e a t m e n to fc a r b u n c l es w o l l e nb o i l s ，h o u b i ，e u s i p e l a s ，f e v e rs e r ad y s e n t e f e n g r e g a n m a o ，i n c i d e n c eo fd i s e a s e ss u c ha sw a n n i t sm a i ne f f e c t i v ep a r ti s c h l o r o g e n i ca c i d ，i s o c h l o r o g e n i ca c i da n dt o t a lf l a v o n o i d sa n de t 三o ，2 i e p 尸口s 办托i f 括 h e m s la r et h em a i n s t r e a mv a r i e t i e so ff l o sl o n i c e r a e 仔o ms i c h u a n t h i si s s u ew i l l s t u d yt h ep h a m a c o g n o s t i c a lf e a t u r e s ，a n di tw i l li d e n t i f l c a t e d 厅f c p ，曰s f 聊i ，如 h e m s lb yt l c ，a n dd e t e r m i n a t ei t se f r e c t i v ec o m p o n e n t s ，w h i l ef l n g e 印r i n t i n g s t u d i e st h e mt oe n h a n c ea n di m p r o v et h eq u a l i t yo f d 门比p ms 西”f 凰h e m s l 仔o m s i c h u a na n dc h o n g q i n g m e t h o d ：f o rc o n t r o l i n gt h eq u a l i t ys t a n d a r d so f d ，2 f c 8 阳 s 砌f 凰h e m s l 行o ms i c h u a na n dc h o n g q i n g 如l l y ，t h i ss t u d yu s i n gt h eo r i g i n a l p l a n ti d e n t i f i c a t i o n ，t r a i ti d e n t i f i c a t i o n ，m i c r o s c o p i ci d e n t i f i c a t i o na n dc h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n ( t l c ) m e t h o dt om a k eap h a n n a c o g n o s yi d e n t i 行c a t i o n t h i sp a p e r q u a l i t a t i v ei d e n t m c a t e sc h l o r o g e n i ca c i di nl d 力i c p 阳s f 聊i ，括h e m s lf l r o ms i c h u a n a n dc h o n g q i n gu s i n gt l c ，a n dd e t e n n i n e st h et o t a lc h l o r o g e n i ca c i da n dt o t a l f l a v o n o i d sc o n t e n tb yu l t r a v i 0 1 e ts p e c t r o p h o t o m e t 阱w h i l eu s i n gh i 曲一p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t oc a r 拶o u tt h ec o n t e n to fc h l o r o g e n i ca c i d ，a n d u s i n gh p l ct or e s e a r c hi t sf i n g e 印r i n t t h o s ec o u l dp r o v i d eas c i e n t i f i cb a s i sf o r d e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o n o fl d 刀f c 钟讼，砌f 胁h e m s lf r o ms i c h u a na n d c h o n g q i n g r e s u i t s ：t h eo r i g i n a lp l a n t sa r es e m i e v e 略r e e na n dp e r e n n i a lw o o d y p l a n tv i n e s y b u n gb r a n c h e s ，p e t i o l e ，a n dp e d u n c l el e n g t hw e r ec a r r i e do u ti ns h o r t b r o w nc o a r s eh a i r ，s h o r th a i ra n ds p a r s eh a i r ss o r d o u b l ef l o w e r s 伊o ws o l i t a 拶 a n da x i l l a uo rt e r m i n a lb r a n c h e si n t oaf e wc l u s t e r so fr a c e m e s h e r b sh a v et h e f e a t u r e so fs m a l lw o o d e nc l u b s h a p e df l o w e r ，y e l l o wb r o w ns u r f a c e ，r e db r o w no r 1 g r e e n ， n o n g i a n d u l a rh a i r s c h a r a c t e r i s t i c sw i t ht h et w o a n ds c a t t e r e d g l a n d u l a r k i n d so fg l a n d u l a rc e l l s ， h a i r s p o l l e n m i c r o s c o p i c t h i c k w a ll e dn o n g l a n d u l a r c e l l s ，t h i n w a l l e d s i n g l e 。c e l l e dn o n 9 1 a n d u l a r h a i r s ， p o l l e ng r a i n sa r ec l a s s s p h e r l c a l ，w l t ht h r e e - h o l eg r o o v e ，t h e r ea r es h a 印e d g e sa n dc o m e r ss m a l lc l u s t e r s o tc a l c l u mo x a l a t ec 巧s t a l u s i n gt h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h yi d e n t if i c a t e so ft h e l e g a ln a t u r eo fc h l o r o g e n i ca c i d ，c h l o r o g e n i ca c i dc a nb ed e t e c t e di nt h et h i n - 1 a v e r c h r o m a t o g r 印h y u s i n gu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t 拶t od e t e c tt o t a ln a v o n o i d sa n d t o t a lc h l o r o g e n i ca c i d ，t b t a ln a v o n o i d sc a nb em e a s u r e di no ol o 0 8m 2 m l w l t hg o o dl i n e a r i t yw i t h i nt h es c o p e r e l a t i o n s h i p( r = o 9 9 9 8 ) ，r e c o v e r yw a s9 7 71 ，a n dr s dw a s1 4 8 u s i n gh p l c t od e t e n n i n a t ec h l o r o g e n i ca c i d ，w h i l ei n t h er a n g eo fo 8 8 烬 i th a sg o o dl i n e a r r e l a t i o n s h i p( r = o 9 9 9 8 ) ，t h ea v e r a 2 e r e c o v e 拶w a s9 8 3 4 ，a n dr s dw a so 9 1 u s i n gh p l ct oc a r 拶o u tf i n g e r p r i n t s t u d y i th a v e ，b e e nm e a s u r e dat o t a lo f1 1p e a k s ，a n dt h ep a r a m e t e r so fat o t a lo f p e a k a c c o r dw i t h t r a d i t i o n a lc h i n e s e m e d i c i n e i n j e c t i o n f i n g e r p r i n t i n g r e q u l r e m e n t s ”o ft h er e l e v a n tp r o v i s i o n s c o n c i u s i o n ：t h et l c s h o w 助，2 记2 煅 j 砌f 凰h e m s l 仔o ms i c h u a na n dc h o n g q i n g c o n t a i n sc h l o r o g e n i ca c i dc o m p o s i t i o n ： ul t r a v l o l e ts p e c t r o p h o t o m e t 拶d e t e c t i n g t h e i rt o t a lf l a v o n o i d sa n dt o t a lc h l o r 0 2 e n i c a c i dc o n t e n t t h em e t h o di s s i m p l e ，r a p i d ，s e n s i t i v ea n dw i t hg o o dr e p e a t a b i l i t y a n dr e c o v e r y i tc a nb eu s e da st h ec o n t e n to f t o t a lf l a v o n o i d sa n dt o t a lc h l o r o g e n i c a c l dd e t e r n l m a t l o no f 三d 刀缸p ，祝s 办卯i ，括h e m s l 矗o ms i c h u a na n d c h o n g q i n g u s i n g h p l ct od e t e r m i n a t e c h l o r o g e n i ca c i d ，t h i sm e t h o di s s i m p l e ，r a p i d ，e m c i e n t ， s e n s l t l v e ，a c c u r a t ea n dw i t hg o o dr e p e a t a b i l i t ya n dr e c o v e r y ，i tc a nb eu s e da sa q u a n t l t a t l v e a n a l y s i s m e t h o d f o r 三d ，z 记p m ，砌刀括h e m s l行o m s i c h u a na n d m e t h o di s b eu s e da s i f i c a t i o no f ； q u a l i t y 刖舌 - - - ，j 一- - j 一 细毡毛忍冬( d ，2 f c p 朋s 砌f 协h e m s l ) 为忍冬属植物细毡毛忍冬的干燥花 蕾或初开的花( 习称长吊子银花) ，以花蕾入药。具有抗菌消炎、清热解毒、 凉散风热的功效，主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感 冒、温热发病等疾病。全国各地使用的金银花原植物4 0 种以上。细毡毛 忍冬种分布广泛，资源丰富，绿原酸含量较高，质量好，使用历史悠久，尤其 。 是在四川和重庆，为川渝产金银花的主流品种，现在四j i | 【3 】、湖南【4 1 、贵州5 l 省中药材标准中均有收载，是一值得开发利用的金银花类药材的新资源，但目 前各药材标准中均仅见生药学鉴定和含量测定，未对细毡毛忍冬做全面的质量 标准研究。 细毡毛忍冬作为川渝产金银花的主流品种、大宗药材，为常用中药材，具 有等多种药理作用，具有显著的抗菌消炎作用，在制药、保健品等许多领域市 场前景广阔。研究表明细毡毛忍冬的化学成分主要含挥发油、黄酮类、有机酸、 三萜类及无机元素。无机酸的主要有效成分包括总绿原酸( 绿原酸和异绿原 酸) 。药典对金银花规定了薄层鉴别和含量测定项。本文采用薄层色谱法对细 毡毛忍冬中绿原酸进行定性鉴别。细毡毛忍冬分布广泛，而产地不同，绿原 酸的含量存在较大差异阳，7 | 。文献1 采用紫外分光光度法测定了青银注射液中 总绿原酸的含量。为全面了解细毡毛忍冬中绿原酸的变化及差异，本课题采用 高效液相色谱法和紫外分光光度法法测定了四川和重庆产区采摘的细毡毛忍 冬中所含的绿原酸和总绿原酸。细毡毛忍冬中黄酮类化合物包括：木犀草素7 葡萄糖甙、槲皮素3 0 一b d 葡萄糖甙、金丝桃苷阳3 等。现代医学研究表明： 黄酮类化合物具有降低心肌耗氧量，使冠脉、脑血管血流量增加【1 0 】，抗心律 失常【1 l 】、软化血管【1 2 】、降血糖【1 3 】、降血脂等作用，同时它还是一种天然的 气 抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子的自由基，抗衰老，增加机体免疫力的 生理活性n5 1 。黄酮类化合物作为金银花的活性成份之一，一直受到人们的重 视，为全面了解细毡毛忍冬中总黄酮的变化及差异，采用紫外分光光度法对 四川和重庆不同产区采摘的细毡毛忍冬中所含的总黄酮进行了含量测定，为 开发利用本地区的细毡毛忍冬提供科学依据。 由于受到产地、气候、采收时间及加工方法的影响，致使细毡毛忍冬有 效成分的含量存在着一定的差异，从而影响其临床疗效。指纹图谱可以较全面 地体现中药材的内在质量，而细毡毛忍冬的指纹图谱在各地方中药材标准中尚 未收载。为全面评估川渝产细毡毛忍冬有效成分的变化及差异，本课题采用 高效液相色谱法建立了川渝不同产区采集的细毡毛忍冬的指纹图谱，为其质 量控制、药材鉴别以及进一步开发利用川渝产细毡毛忍冬提供科学依据。 仪器与试剂 1 仪器 电热恒温干燥箱( d h g 一9 0 7 7 a ，上海精宏实验设备有限公司) ：c q x 2 5 一0 6 超声波清洗器( 上海必能信超声有限公司，功率2 5 0w ，频率2 5l ( h z ) ；瑞士 p r e c i s a 电子天平( x r2 0 5 s m d r ) ；恒温水浴锅( 余姚电讯仪器实业公司) ； 中药材粉碎机( 浙江武义县屹立工具有限公司) ；紫外灯( 上海顾村电光仪器 厂z f i 型三用紫外分析仪) ；戴安高效液相色谱仪( p 6 8 0 a 四元低压梯度泵， p d a 一1 0 0 二极管阵列检测器，t c c 一1 0 0 柱温箱，c h r o m e l e o n 色谱工作站) ； 双光束紫外一可见分光光度计( u v 一2 1 0 0 ，北京瑞利分析仪器公司) ；药典1 、 2 、4 号筛( 新乡市同心机械有限责任公司) 。 2 试剂和对照品 芦丁( 中国药品生物制品检定所，批号1 0 0 0 8 0 - 2 0 0 3 0 6 ，供含量测定用) ； 绿原酸( 中国药品生物制品检定所，批号1 1 0 7 5 3 2 0 0 4 1 2 ，供含量测定用) ； 面积规一化法测定，纯度均在9 8 以上。甲醇和乙腈均为色谱纯；其余试剂 ( 无水乙醇、甲酸乙酯、甲酸、甲苯、三氯化铁、三氯化铝、甲烷、9 5 乙醇、 盐酸、磷酸、三乙胺等) 均为分析纯；水为重蒸馏水；硅胶g 薄层板( 1 0 0 l o o m m ，青岛海洋化工厂分厂) ，临用前活化。 3 实验材料 川渝产细毡毛忍冬，1 l 批，分别收购于重庆南江、四川德阳和宜宾，见 表1 。经泸州医学院药学院中药教研室欧丽兰老师鉴定均为细毡毛忍冬 三d 门地p 阳s 砌f 凰h e m s l 的干燥花蕾。 0 7 0 6 1 8 南江大河乡 2 0 0 7 0 6 1 8 0 7 0 6 2 0 南江白院乡 2 0 0 7 0 6 2 0 0 7 0 6 2 2 南江大河镇 2 0 0 7 0 6 2 2 0 7 0 6 2 5 南江兴马乡 2 0 0 7 0 6 2 5 0 7 0 6 2 8 南江赤溪乡 2 0 0 7 0 6 2 8 0 7 0 7 0 3 南江沙河镇 2 0 0 7 0 7 0 3 0 7 0 7 2 5 宜宾蕨溪镇 2 0 0 7 0 7 2 5 0 7 0 8 0 l 德阳拱星镇 2 0 0 7 0 8 0 1 0 7 0 8 0 3 德阳遵道镇 2 0 0 7 0 8 0 3 0 7 0 8 0 7 德阳新市镇2 0 0 7 0 8 0 7 8 披针形至条状披针形，长约2 4 5m m ；萼齿近三角形，5 裂；花冠先白色后 变淡黄色，长4 6c m ，二唇形，外被开展的长、短糙毛和腺毛或完全无毛， 管细，内面被白色柔毛；花冠筒长于裂片；雄蕊5 ，花丝无毛，花柱稍超出 花冠。浆果蓝黑色，卵圆形。花期5 6 ( 7 ) 月，果熟期9 1 0 月。 1 2 药材性状 花蕾细棒槌状，长2 6 6 3c m ，上部稍膨大，个体纤细，皱缩。表面为 黄棕色、红棕色或绿色，被毛或近无毛，非腺毛较稀疏，腺毛较多，且展开。 萼齿近三角形五裂，被毛。开放者花冠二唇形。雄蕊5 ，附于筒壁；雌蕊1 ， 花柱无毛。气清香，味甘微苦。 1 3 显微特征 ， 粉末腺毛一般较长，头部类方形、长圆形、倒圆锥形或类圆形，顶端 平坦，侧面观约6 1 7 个细胞，排成2 3 层，直径6 2 5 7 2 5 m ，细胞含 淡黄色或黄棕色物质，腺毛柄部2 3 个细胞，上部细胞短，基部细胞甚长 ( 6 4 6 0 0 胛) 。非腺毛为两种单细胞。一种壁较厚，平直或稍弯曲，胞腔向 上渐窄而成线形，足部较宽，末端壁平截，有时可见2 个短小非腺毛足部并 生；另一种长而弯曲，壁薄，有微细疣状突起。花粉粒极多，黄色，类圆形， 直径6 7 5 8 2 o 胛，外壁表面有细密短刺及圆形细颗粒状雕纹，具3 孔沟。 柱头顶端表皮细胞呈乳头状突起；花柱碎片有管状分泌细胞，内含黄色物。 草酸钙簇晶较多，散在或存在于薄壁细胞中，直径约1 7 5 5 吮m 。 1 4 绿原酸的薄层色谱鉴别 1 4 1 对照品溶液的制备 取经五氧化二磷减压干燥至恒重的绿原酸对照品适量，精密称定，加甲 醇制成l i n l 含2 m g 的溶液。 1 4 2 供试品溶液的制备 取细毡毛忍冬适量，6 0 烘约4 小时，粉碎( 过6 0 目筛) ，取约o 4 9 ， 精密称量，置具塞锥形瓶中，超声4 5 m i i l ，冷却，过滤，作为供试品溶液。 1 4 3 薄层层析 取对照品溶液和供试品溶液各5 l ，分别点于同一硅胶薄层板上，以醋 酸丁酯一甲酸一水( 1 4 ：5 ：5 ) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1 三氯 化铁乙醇溶液，在1 2 0 加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色 谱相应的位置上显相同颜色斑点，阴性对照无此斑点，结果见图1 。 图1 川渝产细毡毛忍冬薄层层析图谱 1 绿原酸对照品；2 1 2 供试品 l o 。 ； 。 ， 2 含量测定 2 1u v 法测定细毡毛忍冬中总黄酮的含量 2 1 1 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的芦丁对照品1o om g 置5 0 m l 容量瓶中，加7 0 乙醇适量，水浴加溶解，放冷，用7 0 乙醇稀释至刻度， 摇匀。配制成0 2m 酌n l 的对照品溶液。 2 1 2 供试品溶液的配制 精密称取各批细毡毛忍冬( 6 0 目) o 5 9 左右至1 5 0 m l 的锥形瓶中，加7 0 乙醇7 5 m l 超声4 5 m i n ，过滤，滤液蒸干，用7 0 乙醇定容于1 0 m l 容量瓶中， 待上柱。精密称取聚酰胺( 8 0 一1 0 0 目) 1 9 ，用蒸馏水浸泡一天，搅拌排除气 泡，装入层析柱中，用蒸馏水洗至从柱子里流出来的水清澈为止。精密吸取 上述7 0 乙醇提取液1 m l ，沿层析柱慢慢滴入柱内，放置2 h ，使充分吸附。 分别用水3 0 m l ，1 0 乙醇2 0 m l ，2 0 乙醇1 5 m l ，沈脱，弃去沈脱液，再依 次用3 0 乙醇3 0 m l ，4 0 乙醇5 0 m l ，5 0 乙醇3 0 m l 洗脱，合并洗脱液， 水浴蒸干，并定容至1 0 m l 。精密吸取1 o m l 于l o m l 比色管中，加5 n a n 0 2 溶液o 5 m l ，摇匀放置6 m i n ，加入1 0 a 1 ( n 0 3 ) 3 溶液o 5 m l ，摇匀放置 6 m i n 后，再加l m o l l 的n a 0 h 溶液4 m l 用7 0 乙醇溶液定容，摇匀，放置 1 5 m i n ，作为供试品溶液。 2 1 3 测定波长的选择 取芦丁对照品溶液1 m l ，照标准曲线项下方法制备供试品溶液，在2 0 0 6 0 0 n m 进行波长扫描，以7 0 乙醇为随行空白试剂。结果提示，供试品与芦 丁对照品均在5 1 0 m 处有最大吸收，故确定其为检测波长。 2 1 4 标准曲线的建立 l l 分别精密吸取上述芦丁对照品溶液o 、o 5 m l 、1 o m l 、2 o m l 、3 o m l 、 4 o m l 于1 0 m l 比色管中，加5 n a n 0 2 溶液o 5 m l ，摇匀放置6 m i n ，加入 1 0 a l ( n 03 ) 3 溶液o 5 m l ，摇匀放置6 m i n 后，再加l m o l l 的n a 0 h 溶 液4 m l 用7 0 乙醇溶液定容，摇匀，放置1 5 m i n 。在5 1 0 n m 波长处，以第 一管溶液作为空白。测得不同浓度下吸光度值，以吸光度值为纵坐标，浓度 为横坐标进行回归，绘制标准曲线。标准曲线方程为y = 1 4 16 8 x + o o l21 ， 产o 9 9 9 8 ( ，2 = 5 ) 。结果表明芦丁对照品在o o 卜o 0 8m g m l 范围内呈良好的 线性关系。 2 1 5 精密度试验 取同一批细毡毛忍冬( 批号：0 7 0 6 1 5 ) 供试品溶液，在5 l o n m 测定吸光 度a ，连续测定6 次，计算得月妨为o 2 0 ，见表2 。试验结果表明仪器精密 度良好。 表2 总黄酮精密度试验结果( 门= 6 ) 2 1 6 重复性试验 取同一批细毡毛忍冬( 批号：0 7 0 6 1 5 ) ，照2 1 2 项下方法制备供试品 溶液六份，分别于5 l o n m 测定吸光度，并计算总黄酮含量，测得总黄酮的 平均含量为7 4 2 ，r s d 为1 1 2 。见表3 。试验结果表明本方法重复性良 好。 表3 总黄酮重复性试验结果( 门= 6 ) 2 1 7 稳定性试验 取对照品供试溶液液及样品供试品溶液于室温分别放置o m i n 、2 m i n 、 4 m i n 、8 m i n 、1 6 m i n 、3 0m i n 后，测定吸光度，见表4 。试验结果表明对照品 及供试溶液在3 0 m i n 内稳定。 表4 总黄酮稳定性试验结果( 门= 6 ) 时i 剐( m i n ) 0 24 81 63 0了尺肋( ) 一一! 对照品 o 5 8 7 2 o 5 8 2 3o 5 7 8 l0 5 7 3 6 0 5 6 8 90 5 6 1 30 5 7 5 21 6 3 供试品o 5 3 8 50 5 3 3 70 5 2 9 4 0 5 2 4 7o 5 1 9 7o 5 1 2 90 5 2 6 51 7 8 2 1 8 回收率实验 精密称取已知含量( 7 4 2 ) 的细毡毛忍冬细粉9 份，每份约o 2 5 9 ，分 别精密添加芦丁对照品适量，加7 0 乙醇2 5m l 超声4 5m i n ，冷却，过滤， 滤液蒸干，用7 0 乙醇定容于1 0m l 容量瓶中，作为样品溶液。精密量取1 m l ， 照标准曲线项下方法测定，并计算回收率。回收率9 7 7 1 ，r s d 为1 4 8 ， 试验结果见表5 。试验结果表明，本法具有良好的回收率。 表5 加样回收率试验测定结果( ，z = 9 ) 2 1 9 样品的测定 取细毡毛忍冬药材，照2 1 2 项下方法制备供试品溶液，照分光光度法， 在5 1 0 n m 波长处测定吸收度。并以标准曲线法计算含量，结果见表6 。 表6 细毡毛忍冬中总黄酮的含量( 门= 3 ) 2 2u v 法测定细毡毛忍冬中总绿原酸的含量 参照四川省中药材标准中规定方法，取细毡毛忍冬粉末o 5 9 ，精密 称定，置锥形瓶中，精密加入5 0 甲醇5 0 m l ，称定重量，超声处理4 5 分钟， 放冷，再称定重量，用5 0 甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤 液o 5 m l ，置5 0 m l 棕色量瓶中，加o 2 m o l l 盐酸液稀释至刻度，摇匀，用 o 2 m o l l 盐酸液作空白，照分光光度法，在3 2 4 n m 波长处测定吸收度，按绿 原酸( c 1 6 h 1 8 0 9 ) 的吸收系数( e ) 为5 2 6 计算呻1 ，即得。川渝产细毡毛忍 冬中总绿原酸的测定结果见表7 。 表7 细毡毛忍冬中总绿原酸的含量( 萨3 ) 2 3h p l c 法测定细毡毛忍冬中绿原酸的含量 2 3 1 色谱条件 色谱柱：d i k m ak r o m a s i lc 1 8 ( 5 m ，2 5 0 4 6 m m ) ，流动相：乙腈一 o 4 磷酸溶液( 12 ：8 8 ) ，流速：o 8 m l m i n ，柱温：3 0 ，检测波长： 3 2 6 n m 。 2 3 2 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的绿原酸对照品适量，置棕色量 瓶中，加5 0 甲醇制成浓度为o 4 m m l 的溶液，即得。 2 3 3 供试品溶液的制备 取细毡毛忍冬适量，6 0 烘约4 小时，粉碎为细粉( 过四号筛) 。取约0 5 g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5 0 甲醇2 5m l ，称定重量，超声 处理4 5m i n ，放冷，再称定重量，用5 0 甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤， 精密取续滤液5m l ，置2 5m l 棕色量瓶中，加5 0 甲醇稀释至刻度，摇匀， 即得。 2 3 4 系统适应性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各1 0 l ，注入高效液相色谱仪， 记录色谱图，结果见图2 。绿原酸的保留时间约为l o 2m i n ，绿原酸峰与相邻 色谱峰的分离度均大于1 5 ，拖尾因子为o 9 6 ，理论塔板数( 以绿原酸峰计) 为1 9 16 8 ，绿原酸峰纯度因子为l o o o 。 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 1 0 0 a 2 3 5 线性关系考察 b 图2 川渝产细毡毛忍冬h p l c 色谱图 a 绿原酸对照品；b 供试品； 1 绿原酸 o 分别精密吸取绿原酸对照品溶液( o 4 0m g m l 1 ) 2 、4 、6 、8 、1 0 、1 5 、 注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，结果见表8 。以峰面积 1 6 值彳对进样量c ( g ) 进行回归，得标准曲线方程：彳= 3 5 6 5 2 9 c 十o 1 7 6 9 ， r = o 9 9 9 9 ，见图3 。结果表明，绿原酸在o 8 8 g 范围内，峰面积值与进样 量有良好的线性关系。 表8 绿原酸的进样量与峰面积 6 g l o 图3 绿原酸标准曲线图 2 3 。6 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液1 0 l ，按上述色谱条件连续进样6 次，测得 绿原酸峰面积r s d 为o 3 5 。见表9 。试验结果表明仪器精密度良好。 表9 绿原酸精密度试验结果( 玎= 6 ) 次数 l23 456 可 r ( ) 峰面积1 4 2 8 9 0 81 4 3 6 0 7 51 4 2 3 8 6 61 4 2 1 9 6 31 4 2 9 9 5 21 4 2 6 5 9 21 4 2 7 8 9 3 o 3 5 2 3 7 重复性试验 1 7 o o o o o o 0 如 筋 加 m 5 取同一批细毡毛忍冬，按供试品溶液制备方法制得6 份供试品溶液，分 别精密进样测定，测得绿原酸的平均含量为6 1 3 4 0 ，r s d 为o 8 2 。见表 1 0 。表明本方法重复性良好。 表1 0 绿原酸重复性试验结果( 门= 6 ) 姿鍪!三 345 6 可脚( ) 含量( )6 1 5 7 86 1 8 1 46 0 9 1 2 6 1 6 7 46 1 5 3 66 0 5 2 7 6 1 3 4 00 8 2 2 3 8 稳定性试验 取本品供试品溶液，分别于制备后0 、4 、8 、1 2 、2 4 、3 6h 精密进样1 0 l ， 测得绿原酸的峰面积r s d 为1 6 8 ，见表1 1 。试验结果表明供试品溶液在 3 6h 内稳定。 表1 1 绿原酸稳定性试验结果( 门= 6 ) 堕型兰竺兰! ! 兰兰 ! 皇夏墨竺! 翌 峰面积8 7 6 5 8 28 7 4 5 9 7 8 7 2 2 1 68 6 6 9 5 38 6 1 6 3 48 5 2 4 5 6 8 6 7 4 0 61 0 5 2 3 9 加样回收试验 精密称取已知含量( 6 1 3 4 0 ) 的细毡毛忍冬细粉9 份，每份约o 2 5g ， 分成3 组，每组3 份，分别精密添加绿原酸对照品溶液( 3 8 6m g m l 一1 ) 3 、 4 、5m l ，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，并 计算回收率。试验结果见表1 2 。试验结果表明，本法具有良好的回收率。 表1 2 加样回收率试验测定结果( 胛= 9 ) l 0 2 5 0 61 5 3 7 1 8 1 1 5 8 0 02 6 7 3 7 69 8 1 5 2 o 2 5 0 915 3 9 0 2 1 1 5 8 0 02 6 7 0 2 7 9 7 6 9 3o 2 5 2 2 1 5 4 6 9 91 1 5 8 0 0 2 6 9 7 1 29 9 3 2 4o 2 5 1 6 1 5 4 3 3 l1 5 4 4 0 0 3 0 4 3 6 29 7 1 7 5 o 2 5l l15 4 0 2 5 15 4 4 0 03 0 4 3 0 2 9 7 3 39 8 3 40 9 1 6o 2 5 0 7 1 5 3 7 7 91 5 4 4 0 0 3 0 7 4 3 89 9 5 2 7 0 2 5 1 51 5 4 2 7 0 1 9 3 0 0 03 4 4 0 0 8 9 8 3 1 8 0 2 5 0 2 l5 3 4 7 3l9 3 0 0 0 3 4 5 3 7 39 9 4 3 9o 2 5 0 5 1 5 3 6 5 7 1 9 3 0 0 03 4 3 1 0 69 8 1 6 1 8 2 3 1 0 样品测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各l o l ，注入高效液相色谱仪， 按上述色谱条件测定，纪录色谱图，以外标法计算样品中绿原酸的含量，结果 见表1 3 。 表1 3 细毡毛忍冬中绿原酸的含量( 刀= 3 ) 3 川渝产细毡毛忍冬的h p l c 指纹图谱研究 细毡毛忍冬分布广，资源丰富，绿原酸含量较高，质量好，在四川大量 栽培，且广泛使用，是一值得开发利用的金银花类药材的新资源，目前各地 方中药材标准种尚未收载细毡毛忍冬的指纹图谱，为全面评估本地区细毡毛 忍冬有效成分的变化及差异，本课题采用高效液相色谱法建立了川渝不同产 区采集的细毡毛忍冬的指纹图谱，为其质量控制、药材鉴别以及进一步开发 利用本地区的细毡毛忍冬提供科学依据。 3 1 色谱条件 色谱柱：d i k m a 心o m a s 订c 1 8 ( 1 0 m ，2 5 0 4 6 m m ) ；流动相：乙腈一o 1 磷酸溶液，梯度洗脱，o m i n ，1 0 ：9 0 ；1 2 m i n ，1 4 ：8 6 ，3 2 m i n ，3 0 ：7 0 ；流速： 1 om l m i n ；柱温：3 0 ；检测波长：3 2 6n m 。 3 2 参照物溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的绿原酸对照品适量，置棕色量 瓶中，加5 0 甲醇制成浓度为o 4 m m l 的溶液，即得。 3 3 供试品溶液的制备 取细毡毛忍冬适量，6 0 烘约4 小时，粉碎为细粉( 过四号筛) 。取约0 5 g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5 0 甲醇2 5m l ，称定重量，超声 处理4 5m i n ，放冷，再称定重量，用5 0 甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤， 精密取续滤液5m l ，置2 5m l 棕色量瓶中，加5 0 甲醇稀释至刻度，摇匀， 即得。 3 4 方法学考察 3 4 1 精密度试验 取细毡毛忍冬药材( 批号：0 7 0 6 1 5 ) 供试品溶液，连续进样6 次，检测指 纹图谱。各共有峰的相对保留时间、单峰面积占总峰面积1 0 的色谱峰的 峰面积比值基本一致，其r s d 均小于3 。结果见表1 4 。表明精密度良好，符 合指纹图谱的技术要求。 表1 4 精密度试验结果( = 6 ) 3 4 2 稳定性试验 取细毡毛忍冬药材( 批号：0 7 0 6 1 5 ) 供试品溶液，分别于制备后0 、4 、 8 、1 6 、2 4 、3 6h 检测指纹图谱。以绿原酸峰的保留时间和峰面积为参照，各 共有峰的相对保留时间、单峰面积占总峰面积1 0 的色谱峰的峰面积比值 基本一致，其r s d 均小于3 。结果见表1 5 。表明供试品溶液在3 6h 内稳定， 符合指纹图谱的技术要求。 表1 5 稳定性试验结果( 玎= 6 ) 3 4 3 重复性试验 取细毡毛忍冬药材( 批号：0 7 0 6 1 5 ) 样品6 份，按“3 3 项下方法制备供 试品溶液，分别检测指纹图谱。以绿原酸峰的保留时间和峰面积为参照，各 共有峰的相对保留时间、单峰面积占总峰面积1 0 的色谱峰的峰面积比值 基本一致，其r s