（微生物学专业论文）酿酒葡萄内生真菌、次生代谢产物初步研究.pdf

摘要 摘要 2 0 世纪9 0 年代以后，植物内生真菌研究范围扩大，不再仅限于禾本科植物， 开始倾向从木本植物体内分离内生真菌，研究其生物多样性、生物学作用、内生 机理、与宿主之间的关系以及新型活性化合物研究等。 本文对一个引种实验葡萄园中酿酒葡萄的内生真菌资源进行调查，分析其群 落构成和种群系统发育关系，对这些菌株的抗植物病原真菌、抗人类病原菌活性 进行了初步研究；对活性菌株a 2 3 的代谢产物进行活性追踪，对其分离纯化得到 的化合物进行结构鉴定和抗植物病原真菌活性研究；同时对同一葡萄园的果实所 酿造的葡萄酒进行检测，确定分离到的内生真菌代谢产物e n n i a t i nb 是否对葡萄 酒造成污染。 从酿酒葡萄植株的根、枝条、叶片、果实等组织共分离得到内生真菌4 5 5 株， 统计结果显示，内生真菌的种类和数量与宿主健康状况相关，引种成活率较高的 植株内生真菌分离率较高，而引种成活率低的植株内生真菌分离率相应很低，分 析其群落构成和发育关系，表明a 1t e r n a r i a ，p e n i c i l l i u m ，p u s a r i u m 是优势 种群，一些真菌为潜在的植物病原真菌，如d i a p o r t h e p h a s e o l o r u m , a s p e r g i l l u s o r y z a e ，f u s a r i u me q u i s e t y ，p e s t a o t i o p s i su v i c o a 等；以黄瓜炭疽病菌 ( c o l l e t o t r i c h u m a g e n a r i u m ( p a s s e r i n i ) ) 、棉花黄萎病菌( v e r t i c i i u m d a h l i a ek l e b ) 、棉疫霉果腐病菌( 脚t o p h t h o r ap a r a s i t i c ad e s t u r ) 为指示 菌，初筛采用对峙法测定了1 0 3 株内生真菌的抗菌活性，复筛使用滤纸片法，初 筛得到活性菌株3 0 株，占总数的2 9 1 ，复筛显示，有8 株菌对短小芽孢杆菌 和枯草芽孢杆菌的抑制作用超过氨苄青霉素，并且其中1 3 株对3 种植物病原指 示菌均有抗性，显示了一定的广谱抗性，在这1 3 株菌中，1 0 株属于优势种群。 表明酿酒葡萄蕴含丰富的内生真菌资源，优势种群经过种间竞争，通过产生多种 活性代谢产物增加宿主的抗病害、抗逆能力。 在研究酿酒葡萄内生真菌发育关系时发现一株内生真菌属于虫草属真菌，与 文献中报道的昆虫内生真菌c o r d y c e p s 建立系统发育树，表明植物内生真菌 c o r d y c e p s 与昆虫内生c o r d y c e p s 真菌有较大差异，分别形成独立的类群，在 其发育史上可能通过基因调节经历了从植物到昆虫的宿主“跳跃 。 菌株a 2 3 经过分子鉴定为f u s a r i u mt r i c i n ct u r n ( c o r d a ) ，本文采用固体培养、 有机溶剂提取、分相萃取、柱层析等分离纯化方法从其发酵产物中分离到5 个纯 t 摘要 的化合物，经过核磁共振等波谱解析确定其中两个化合物的结构相同，为 e n n i a t i nb 。测定其抗植物病原真菌生长活性，发现e n n i a t i nb 有广谱抗性，且 活性较好，对黄瓜炭疽病菌m i c 为7ug m l ，对棉花黄萎病菌m i c 为3ug m l ，对棉 疫霉果腐病菌m i c 为1 5 | ig m l ，显示e n n i a t i nb 具有开发成为农用抗生素的潜 力。 为检测葡萄酒是否被对人类有害的内生真菌代谢产物污染，对采用同一葡萄 园收获果实酿造的两种葡萄酒( 红葡萄酒和白葡萄酒x 进行高压液相分析，结果 显示红葡萄酒内不含e n n i a t i nb ，白葡萄酒内则含有e n n i a t i nb ，浓度达到1 1 0 4 p g m l 。表明植物内生真菌及其代谢物有可能通过一定途径进入植物产品，引 发食品安全问题。 本论文研究表明，酿酒葡萄蕴含丰富的内生真菌资源，是研究内生真菌一宿 主发育关系的良好工具，同时蕴含着丰富的活性物质，是寻找新型农药和人用抗 生素的有效来源；但也可能会产生对人类有害的毒素，并进入人类食品，引发其 安全问题，表明植物内生真菌一方面可以提高宿主的抗逆性，为人类提供有益的 活性化合物，对人类农、林、牧业生产活动产生积极影响，另一方面植物内生真 菌也可能降低农、林、牧业产值、威胁食品安全，对人类生活有双重作用。 关键词：酿酒葡萄；内生真菌；e n n i a t i nb ；新型农药；食品安全 i i a b s t r a c t a b s t r a c t s i n c e19 9 0 s ，t h er a n g eo f p l a n te n d o p h y t i cf u n g is t u d yh a sb e e n e x p a n d e d ，n o tb e i n gl i m i t e dg r a m i n e o u sp l a n t so n l y , b u tt e n d i n gt oi s o l a t e e n d o p h y t i cf u n g if r o mw o o d yp l a n t st oe x p l o r et h eb i o l o g i c a ld i v e r s i t y , b i o l o g y i n f l u e n c e ，e n d o p h y t i cm e c h a n i s m ，r e l a t i o nw i t hh o s t ，a n dt h ee x p l o r a t i o no f n e wb i o a c t i v ec o m p o u n d s ，e t c t h i st h e s i sf o c u s e do nt h ee n d o p h y t i cf u n g io fv i t i sv i n i f e r ai na n i n t r o d u c t i o ne x p e r i m e n t a lv i n e y a r d ，a n a l y z e d t h e c o m m u n i t yc o n s t i t u e n t s a n dt h e p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n ，s u p p l i e d a p r e l i m i n a r ys t u d yo nt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h es t r a i n st op h y t o p a t h o g e n i ca n d h u m a np a t h o g e n 。i n v e s t i g a t e dt h ec o n s t i t u e n t sa n dt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yt o p h y t o p a t h o g e n i cf u n g io ft h ec o m p o u n d sw h i c hw e r et r a c e da n di s o l a t e df r o m t h em e t a b o l i t e so fa c t i v es t r a i na 2 3 ，a n di n s p e c t e dw h e t h e rt h ew i n eb r e w e d f r o mt h ef r u i t si nt h i sv i n e y a r dw a sp o l l u t e do rn o tb yt h ee n d o p h y t i cf u n g i s m e t a b o l i t e sh a r m f u it 0h u m a nb e i n g s 4 5 5e n d o p h y t i cf u n g is t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h er o o t s ，b r a n c h e s ， l e a v e s ，a n df r u i t so fv i t i sv i n i f e r a s t h es t a t i s t i c si n d i c a t e dt h a tt h et y p e sa n d q u a n t i t i e so ft h ee n d o p h y t i cf u n g iw e r er e l a t e dw i t hh o s t sh e a l t hs i t u a t i o n t h e s e p a r a t i o nr a t eo ft h ee n d o p h y t i cf u n g if r o mp l a n t sw i t hh i g hs u n ，i v a lr a t i ow a s r e l e v a n t l yh i g h ，a n dt h ev i c ev e r s a t h ea n a l y s i so fc o m m u n i t yc o n s t i t u e n t s a n dp h y l o g e n e t i cr e l a t i o nd e m o n s t r a t e dt h a ta l t e m a r i a ，p e n i c i l l i u m ，f u s a r i u m w e r ed o m i n a n t s p e c i e s ，b u ta m o n gw h i c ht h e r ew e r es o m ep o t e n t i a l p h y t o p a t h o g e n i cf u n g i ，s u c ha sd i a p o r t h ep h a s e o l o r u m ，a s p e r g i l l u so r y z a e ， f u s a r i u m e q u i s e t i ，p e s t a l o t i o p s i su v i c o l a ，e t c t a k e d c o l l e t o t r i c h u m l a g e n a r i u m ( p a s s e r i n i ) ，v e r t i c i l l i u md a h l i a ek l e b ，a n dp h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c a d e s t u ra si n d i c a t o rf u n g i ，t h ep r i m a r ys c r e e n i n ge m p l o y e da n t a g o n i s t i cm e t h o d t oc h e c kt h ea n t i s e p t i ca c t i v i t yo f10 3e n d o p h y t i cf u n g i ，w h i l er e s c r e e n i n gu s e d f i l t e r p a p e rm e t h o d t h i r t ya c t i v es t r a i n sw e r eo b t a i n e df r o mt h ep r i m a r y s c r e e n i n g ，a c c o u n t i n gf o r2 9 1 o ft h et o t a ls t r a i n s t h er e s c r e e n i n gd i s p l a y e d t h a tt h e r ew e r ee i g h ts t r a i n sw h o s ei n h i b i t i o nt ob a c i l l u sp u m i l u sa n db a c i l l u s s u b t i l i ss u r p a s s e da m p i c i l l i n ，a n dt h i r t e e ns t r a i n s ，a m o n gw h i c hs e v e ns t r a i n s b e l o n g e dt od o m i n a n ts p e c i e s ，h a dr e s i s t a n c et ot h et h r e ea b o v e m e n t i o n e d i n d i c a t o rf u n g i ，w h i c hi n d i c a t e dac e r t a i nb r o a ds p e c t r u mr e s i s t a n c e t h e h i a b s t r a c t r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tv i t i sv i n i f e r ac o n s i s t e do fa b u n d a n te n d o p h y t i cf u n g i t h r o u g ht h ei n t e r s p e c i f i cc o m p e t i t i o n ，t h ed o m i n a n ts p e c i e sc r e a t e dv a r i o u s a c t i v em e t a b o l i t e st oi m p r o v et h eh o s t sa n t i d i s e a s ea n da n t i a d v e r s i t ya b i l i t y , w h i c hp r o v e dt h ev i e wo fm u t u a lc h o i c ea n dm u t u a la d a p t a t i o nb e t w e e nh o s t a n de n d o p h y t i cf u n g i 。a n d t h eh o s tr e l a t e d n e s sh y p o t h e s i s ” o n e e n d o p h y t i cf u n g u sw a s f o u n do u tt ob e l o n gt oc o r d y c e p sf u n g id u r i n g t h er e s e a r c ho fe n d o p h y t i cf u n g ip h y l o g e n e t i cr e l a t i o n 。a n dt h ep h y l o g e n e t i c t r e ew a sc r e a t e dt o g e t h e rw i t hi n s e c tc o r d y c e p sf u n g ir e p o r t e di np a p e r s t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ec o r d y c e p sf u n g ii np l a n t sw e r ed i f f e r e n tw i t ht h o s ei n i n s e c t s ；t h e yh a db e c o m ei n d e p e n d e n ts p e c i e s ；a n da “l e a p ”f r o mp l a n tt o i n s e c t s h o s th a d h a p p e n e dt h r o u g h t h e g e n er e g u l a t i o nd u r i n g t h e d e v e l o p m e n t a lp r o c e s s t h ev i t i sv i n i f e r ab e l o n g e dt oo n eo ft h es e g m e n t s t h es t r a i na 2 3b e l o n g e dt of u s a r i u mt n c i n c t u m ( c o r d a ) t h r o u g ht h e m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n t h es e p a r a t i o nm e t h o d s ，s u c ha ss o l i dc u l t u r e ， e x t r a c t i o n ， s i l i c a c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ，d e x t r a ng e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，e t c w e r ee m p l o y e di nt h i st h e s i st og e tf i v ep u r e c o m p o u n d sf r o mt h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i o n t h es p e c t r a la n a l y s i s ，s u c ha s n m r ，d i s p l a y e dt h a tt h es t r u c t u r eo ft w oc o m p o u n d sw a st h es a m e ，t h a tw a s ， e n n i a t i nb i t si n h i b i t o r ya c t i v i t yo fp h y t o p a t h o g e ni n d i c a t e dt h a te n n i a t i nbh a d b r o a ds p e c t r u mr e s i s t a n c ea n dg o o da c t i v i t y ：t h emi cf o rc o l l e t o t n c h u m ，a g e n a f i u mw a s7 p g m l ，f o rv e r t i c i l l i u md a h l i a e ，t h em i c w a s3 p g m l ，a n df o r p h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c am i cw a s15u g ml - c o m b i n e dw i t hp o te x p e r i m e n t t e s t ，e n n i a t i nbw a sp r o v e dt oh a v et h ep o t e n t i a l i t yt ob eq u a l i f i e da g r i c u l t u r e a n t i b i o t i c s t oc h e c kw h e t h e rt h ew i n ew a sp o l l u t e db yt h ee n d o p h y t i cf u n g i 7 s m e t a b o l i t e st h a tw a sh a r m f u it oh u m a nb e i n g s ，t w ok i n d so fw i n e ( r e dw i n e a n dw h i t ew i n e ) b r e w e df r o mt h ef r u i t si nt h es a m ev i n e y a r dw e r ea n a l y z e db y h p l c t h er e s u l tp r o v e dt h a tr e dw i n ed i d e sn o tc o m p r i s ee n n i a t i nb ，w h i l e w h i t ew i n ec o m p r i s e si t ，r e a c h i n gt o11 ，0 4p g r t l l 。i ti l l u s t r a t e dt h a tt h ep l a n t e n d o p h y t i cf u n g ia n dt h e i rm e t a b o l i t e sm a ye n t e r e di n t op l a n tp r o d u c t i o n t h r o u g hs o m ec e r t a i nw a y s ，w h i c hm a yg e n e r a t e df o o ds a f e t yp r o b l e m s t h ep r e s e n t s t u d yp r o v e dt h a tw i t ha b u n d a n te n d o p h y t i cf u n g i ，v i t i s v i n i f e r aw a sag o o dw a yt oi n v e s t i g a t ee n d o p h y t i cf u n g ia n dh o s tp h y l o g e n e t i c r e l a t i o n a n dw i t hl a r g eq u a n t i t yo fa c t i v ec o m p o u n d s ，i tw a sa l s oa ne f f e c t i v e a b s t r a c t 一一 w a yt of i n do u tn e wa g r i c u l t u r a lc h e m i c a l sa n dh u m a na n t i b i o t i c s h o w e v e r ， h a r m f u lt o x i n u mm a yb ep r o d u c t e da n dt a k e ni n t oh u m a nf o o d ，g e n e r a t i n g f o o ds a f e t yp r o b l e m s o nt h eo n eh a n d ，p l a n te n d o p h y t i cf u n g ic a ni m p r o v e h o s t sa n t i a d v e r s i t ya b i l i t y ，s u p p l yu s e f u la c t i v ec o m p o u n d s f o rh u m a nb e i n g s ， a n dm a k eac o n t r i b u t i o nt oa g r i c u l t u r e ，f o r e s t r ya n dl i v e s t o c kp r o d u c t i o n ，o n t h eo t h e rh a n d ，t h e ym a yr e d u c et h eo u t p u tv a l u eo fa g r i c u l t u r e ，f o r e s t r ya n d l i v e s t o c k ，a n dt h r e a t e nf o o ds a f e t y t h e yh a v et h ed o u b l e r e s p o n s et oh u m a n l i f e k e yw o r d s ：v i t i sv i n i f e r a ；e n d o p h y t i cf u n g i ；e n n i a t i n b ：n e wa g r i c u l t u r a l c h e m i c a l s ；f o o ds a f e t y v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导f ，独立完成的研冗成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 彳够墓绚扬净幻 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 锚毛韵题杨) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 欠稻毛钧毖桫实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) 无嗜语 吵d 这年留月f 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( 、力2 不保密，适用上述授权。 v ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人。签名) ：之七常湍 钟这月日 第一章背景 第一章背景 l 植物内生真菌 植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物 的各种组织和器官内部的真菌，被感染的宿主植物( 至少是暂时) 不表现出外在 症状，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直 接扩增出微生物d n a 的方法来证明其内生【1 ，2 】。内生真菌与寄生真菌、病原真菌 和腐生真菌在概念上有所不同，它是与植物互惠共生的真菌【3 】。根据此定义，植物 内生真菌应包括专性寄生真菌、潜伏性病原真菌和菌根真菌【2 ，4 1 。所以我们可把 植物内生真菌理解为植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的和中性 的内生真菌，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原真菌。内生真菌生活在健康植 物组织内部，长期以来与植物宿主形成了密切的关系，但由于其并不引起明显的 感染症状，所以其存在和作用很长时间一直为人们所忽视【5 】。 有关植物内生真菌的研究起始于1 9 世纪末，g u e r i n ，h a n a u s e k ，n e s t l e r 和 v o g l 等人先后在几种黑麦草( d j 脚a r v e r s 、l o l i u ml i n i c o l u m , l o l i u m r e m o t u r n 和l o l i u mt e m u l e n t u r n ) 中发现了几种内生真菌。在这以后的1 0 0 多年时 间里，国外由最初的发现、检测、分类和分离培养，到8 0 年代以后内生真菌对植 物有益影响的研究，至现在对其影响机理和群体特征的研究，经历了一个逐步深 入的过程。 2 内生真菌目前研究热点 2 1 新药物以及先导化合物的研究与开发 目前，越来越多的人面临着各种病原菌引起的传染病、感染性疾病的威胁。 一些严重危害人类健康的传染病，由于对常用药物有耐药性的致病病菌的出现， 使医药卫生业工作更加艰巨，与此同时寻找和更新更有效的治疗药物来解决这些 问题已迫在眉睫。而从临床实践来看，一般治疗感染性疾病的抗生素药物来源主 要为化学合成和天然产物药物。现在临床常用的抗生素易产生耐药性；化学合成 药物多半对人体产生较大毒副作用；天然药物虽然具有化学合成药物无法比拟的 优越性，而且越来越受到人们的青睐，但植物来源的天然药物活性成分在其体内 含量一般都很低，且有些只存在于植物体的某一特定部位或某一生长时期，靠天 然采挖不仅受地理、环境、时间等因素的影响，而且过度采挖可能导致该物种的 枯竭，这样会造成植被和人类生存环境，以及生物多样性不可弥补的损失【6 】。 第一章背景 自1 8 9 8 年v o g l 从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生真菌作 为一种新的微生物资源受到了广泛的关注【6 一。植物内生真菌是植物微生物系统 中天然组成成分，在进化过程中与植物寄主建立了和谐的共生关系，其次生代谢 产物十分丰富，并且具有抗肿瘤、抗虫、抗病等活性【羽，这些活性天然产物有的 可以直接作为药物，有的可以作为先导化合物，通过化学修饰和结构改造成为药 物。美国蒙大拿州立大学有机化学家s t r o b e l 首次于1 9 9 1 年从短叶红豆杉( t a x u s b r e v i f o l i an u t t ) 的树皮中分离出一株能产生紫杉醇( t a x 0 1 ) 的内生真菌 t a x o m y c e sa n d r e a n a ，为解决紫杉醇的资源危机提供了一个新的思路【9 】，以后许 多学者从多种红豆杉的韧皮部中分离到能产生更多量紫杉醇的菌株【m 1 2 】，表明了 植物内生真菌是人们寻找新型抗肿瘤药物的重要来源。从内生真菌中寻找和发现 新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。 近年来，大量研究已证明植物内生真菌中分离到的一些小分子化合物具有广 谱抗菌活性【1 3 - 1 9 】，以内生真菌及其代谢物作为具有农用价值的菌株和化合物所开 展的研究正在兴起，由此而开发新的生物农药正在成为这一领域的研究重点【2 们。 2 2 共生机制 揭示内生真菌与宿主的相互关系及作用机理可阐明内生真菌产生活性化合 物的原理、途径，为更好的利用内生真菌提供必要条件，因此内生真菌的共生机 制近年来也受到密切关注。 2 2 1 生物间的“基因水平传递 及“内共生理论 宿主植物与其内生真菌因长期的共同生活、相互影响而关系十分密切，它们 相互之间的影响是很大的。目前，已有不少研究者从药用植物中筛选出个别内生 真菌，它们能够产生与宿主相同或相似的生理活性成分；在发育早期已分化的放 线菌与子囊菌皆存在有相同的次生代谢产物0 一内酰胺；由此产生了这样的假 设：具有相同次生代谢产物生物合成的途径，是获得了相关基因的直接传递。这 种传递可以发生在“共生生物一寄主 或“寄生生物一宿主 间的相互作用过程 中，或者更直接地在共同生活的环境中( 如土壤) ，经长期相处直接接触而传递 吸收遗传物质【2 l 】，t i 质粒从致癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 传递到 寄主植物是遗传物质传递的一个很好例证，其基本的生化过程信息有时还会传递 到其它生物中去。在生物早期的系统发育过程中，一些具有完全互补的遗传特性 或参与代谢过程的其它整个生物( 如细菌或蓝藻) ，被认为可组合进真核细胞并 第一章背景 发育成线粒体和叶绿体 2 2 , 2 3 】。 2 2 2 生物之间的相互作用和“协同进化 “内共生理论”还认为，在共生体内，一旦次生代谢中存在有用的生化途 径，它就能被其他生物所利用，表现出相互作用和“协同进化 ( c o e v o l u t i o n ) 2 4 1 。有的真菌激素，包括有性生殖过程中的一些激素，其化学结构与哺乳动物的 性激素十分相似，r o t h 等认为哺乳动物的某些细胞调节机制即是从微生物协同 进化而来【2 5 1 。 不同的植物其内生真菌的种类、基因型是不相同的，内生真菌对宿主也具有 选择性，其相互作用还受到环境因子的影响，环境条件和宿主基因型决定内生真 菌的遗传多样性，环境与宿主基因型的相互作用可能使宿主对某一种特殊内生真 菌基因型敏感性会随环境的改变而改变，一种特殊的内生真菌基因型需要找到正 确的宿主基因型才能成功感染【2 6 】，在宿主的影响下，内生真菌的不同亚群会在不 同的环境中形成，当宿主植物在环境恶化的情况下，它会选择那些增强其抵抗恶 劣环境的内生真菌亚群的侵染【2 7 】。在宿主与内生真菌的相互作用过程中，内生真 菌的生长代谢行为会受到宿主基因型的影响，有的物质代谢会受到制约，但宿主 植物对内生真菌的选择性调控更有利内生真菌代谢口8 1 。 在这种相互作用和协同进化中，内生真菌与宿主可能在基因水平上已经形成 了相互的免疫性。如果n a r u on i k o h 等2 9 】在研究真菌c o r d y c e p s 在不同宿主之间 的表现时发现，它在不同的宿主其细胞核r d n a 和线粒体r d n a 均有显著差异性，通 过进化树分析可明显发现不同宿主体内的c o r d y c e p s 独立组成各自类群，表明 其在发育史中在不同宿主之间发生过“跳跃 ，从侧面反应内生真菌和宿主之间 在基因水平上相互适应、相互选择。 3 植物内生真菌的多样性 3 1 植物内生真菌生态多样性 植物内生真菌分布广泛，从目前已经研究过的植物看，未发现没有分离到内 生真菌的植物。因此可以推断内生真菌在植物体内是普遍存在的，几乎所有的植 物组织中都发现有内生真菌的存在 3 0 , 3 h ，如f i s h e r 等从e u c a l y p t u sn i t e n s 上 分离到6 0 多种内生真菌【3 2 】；而a r n o l d 等发现，仅在中美洲的两处雨林中的两 种树中就共生着约4 1 8 种分属不同形态学种类的内生真菌( 属于大约3 5 0 种具有 遗传特性的种类) 【3 3 】。p e t r i n i1 9 9 1 年估计内生真菌总数可以超过i 0 0 万种【3 4 1 ， 第一章背景 我们统计了近1 0 年来左右发表调查内生真菌资源的文章，表明内生真菌具有广 泛的物种多样性，仅2 0 个宿主内就存在1 0 1 个属和2 0 7 种，见表1 ，2 。 尽管内生真菌分布广泛，但其对宿主可能会有严格的特异性，大部分植物内 生真菌由d o n m i n a n tf u n g i ( 优势菌群) 和r a r ef u n g i 组成d 引，且在同一宿主 内存在器官和组织特意选择性【3 6 】。内生真菌的菌丝生长于植物组织的细胞间，分 布于叶鞘、种子、花、茎、叶片和根中，其中叶鞘和种子中菌丝含量最多，而叶 片和根中含量极微【3 7 1 。大多数内生真菌都属于子囊菌类( a s c o m y c e t e s ) ，包括核 菌纲( p y r e n o m y e t e s ) 、盘菌纲( d i s c o m y e t e s ) 和腔菌纲( l o c u o a s c o m y e t e 5 ) 的许 多种类以及与之相关的半知菌类及少数担子菌和接合菌等【3 7 1 。在多种植物中广泛 分布的几个属是：半壳霉属( l e p t o s t r o m a ) 、c r y p t o c l i n e 属、拟隐孢霉属 ( c r y p t o s p o r i p s y s ) 、拟茎点霉属( p h o m o p s i s ) 和叶点霉( 忍一l o s t i ct a ) ，其宿主 范围涉及藻类、针叶树、灌木和草本等多个植物类群【3 引。被子植物和裸子植物内 生真菌也不相同，被子植物的优势菌群多数属于d i a p o r t h a l e s 目，而裸子植物优 势菌群多数属于h e l o t i a l e s ，但一些双囊壁子囊菌如d o t h i d e a l e s ，p l e o s p o r a l e s 和m y c o s p h a e r e l l a l e s 以及x y l a r i a l e s 在被子植物和裸子植物内都可以成为 优势菌群【3 9 】。目前研究主要集中于内生真菌与禾本科植物的关系上。与禾本科植 物关系密切的内生真菌主要是子囊菌中核菌纲麦角菌科( c l a v l c i p i t a c e a e ) 中的 一些类群，其中对瘤座菌属( b a l a n s i & 、麦角菌属( c a v j c e p s ) 和香柱菌属 ( e p i c h l o e ) 的研究为最多的。而半知菌类的顶孢霉属( a c r e m o n i u m ) 作为香柱菌属 的无性型，因其与栽培牧草的密切关系而受到广泛关注1 4 5 j 。 3 2 植物内生真菌次生代谢产物多样性 微生物次生代谢产物十分丰富，在人类的生产生活中一直具有广阔的应用 范围，如治疗药物、精细化工、农用药物、发酵及食品工程、单细胞蛋白、酶制 剂、生物多聚物、污水处理、石油勘探及人类蛋白质遗传工程等。其中医药和农 用药物更受到特别重视【4 0 】。 s c h u t z 认为某些微生物代谢产物可能在特定的群落生境中产生，这种生境 包括了环境方面和有机体方面。进一步研究表明，微生物和那些受其代谢产物和 环境影响的生物，两者互相影响，会产生更多的次级代谢产物【4 。内生真菌生活 在健康植物组织中，其群落生境特殊；而大量的植物又生活在特殊的环境( 如高 第一章背景 表1 不同宿主叶片中的内生真菌优势种群i 3 9 1 t a b l e ld o m i n a n tf u n g a le n d o p h y t e si nl e a v e s o fv a r i o u st r e eh o s t s n u m b e r o f 旦旦坠垒q 塑盟翌箜i 堕里q 里i 望塑! ! 巳呈里i 堕型笪 a c e r a c e a e a c e rm a c r o p h y l l u m b r i t i s hc o l u m b i a1 6 b e t u l a c e a e a i n t 堪r u b r a b e t u l a p u b e s c e n s b r i t i s hc o l u m b i a s w i t z e r l a n d f i n l a n d 2 3 1 5 c u p r e s s a c e a e c a l o c e d r u sc i t ，c z f 阿p h ， o r e g o n 3 c h a m a e c y p a r i s l a w s o n i a n a o r e g o n d u n i p e r u sc o m m u n i s s w i t z e r l a n d j u n i p e r u s o c c i d e n t a l i s o r e g o n c a l i f o m i a p h o m o p s i ss p d i a p o r t h ee r e $ p h l o e o s p o r aa c e r i s c r y p t o d i a p o r t h e 坶s t r 我 g n o m o n i as e t a c e a g n o m o n i e l l at u b i f o r m i s v e n t u r i ad i t r i c h o p h o m o p s i ss p d i a p o r t h a l e s d i a p o r t h a l e s m y c o s p h a e r e l l a l e s d i a p o r t h a l e s d i a p o r t h a l e s d i a p o r t h a l e s p l e o s p o r a l e s d i a p o r t h a l e s l i n o d o c h i u ms p g e n w u ，d s p o r i u ms p x y l a r i a l e s 9 s c o l e c o s p o r i e l l as p n o d u l i s p o r i u ms p 8 3 k a b a t i a j u n i p e r i a n t h o s t o m e l l a f o r m o s a 5 2 6 o r e g o n 6 f a g a c e a e f a g u sc r e n a t a j a p a n g e r m a n y s w i t z e r l a n d m a r y l a n d i t a l y s a r e ad i f f o r m i s c h l o r o s c y p h ac h l o r o m e l 口 c 时p t o c t i n es p p e z i c u l al i v i d a c h l o r o s c y p h as e a v e r i g e