（分析化学专业论文）dna电化学活性非活性转换分子信标的制备及其应用研究.pdf

摘要 论文摘要 随着基因结构与基因功能研究的不断深入，特别是“人类基因组项目”的完 成，人类疾病的d n a 诊断及基因治疗的研究正进入一个新的纪元，而研究的基 础，很大一部分在于对致病基因序列的识别以及确定。传统的d n a 序列测定法 消耗时间长，劳动强度大；而新兴的以w a t s o n - c r i c k 碱基互补配对原则为基础的 d n a 生物传感器为分子生物学研究提供了全新的基因检测技术。其中，建立在 d n a 分子杂交基础上的d n a 生物传感器，与一些新的标记方法如荧光法、化学 发光法和电化学法等相结合，使d n a 传感器既免去了放射性标记对人体的危害 以及昂贵的价格，又节省了传统方法操作花费的时间，具有操作简便、快速灵敏、 特异性好和无污染等特点，并且具有分子识别、分离纯化基因等功能。对此类 d n a 生物传感器的研究现已成为基因研究中最具有吸引力的前沿课题之一。 本论文的创新之处有二：首先，分子信标技术优化了d n a 链，设计为分子 信标构型的d n a 链，其特殊的“发卡 结构使得单纯基于d n a 杂交基础上的 分子探针，在检测之前多了一个使“发卡”打开后再与目标分子进行杂交的这样 一个过程，从而在一定程度上增加了杂交反应发生的难度：而纳米金颗粒的引入， 由于其对单链d n a 的吸附作用，在杂交反应的同时增加一个脱附的过程，进一 步加大了杂交反应的发生难度，这两项技术都大大提高了d n a 分子信标的特异 性：其次，本论文设计了一种新型的电化学分子信标模型，它不同于传统的、一 端组装在电极表面的电化学分子信标。传统的分子信标是通过检测分子信标杂交 前后，由于构型变化而引起的连接在其末端信号分子与电极表面距离的变化，从 而导致的电化学信号的差异来间接进行目标分子的检测。论文中使用的新型电化 学分子信标是非固定型的，完全在溶液中而不是在电极表面进行杂交反应。其信 号的发生是基于分子的电化学活性非活性转换来实现的：它们在分子信标闭合 状态下没有电化学活性，而当分子信标打开之后，则可以表现出电化学活性。这 种类型的电化学信标既有荧光分子信标简便快捷、易控制的特点，又有成本廉价、 易于改装成小型化的便携装置的独特优势，目前尚未见有类似报道。 论文分为四章： 第一章：绪论 首先，介绍了d n a 电化学生物传感器，着重介绍了d n a 电化学检测。接 摘要 着介绍了分子信标技术，从荧光分子信标和电化学分子信标两个方面，分别对近 年来分子信标检测目标分子的原理、方法、应用及发展趋势等方面做了综述；并 对纳米金颗粒的特性及在生物分析中的应用作了简介。最后阐述了本论文的目的 意义及创新之处。 第二章：新型电化学活性非活性转换分子信标的研制及其应用 本章中，首先提出了一种基于电化学活性非活性分子转换的新型分子信标。 此类分子信标本身在实验选定条件下无电化学信号，与完全互补序列杂交后产生 电化学信号，论文采用碳纳米管修饰电极对杂交前后的电化学信号进行检测。实 验发现该分子信标的电化学信号强度与完全互补序列的浓度在 ( 6 0 x 1 0 一m o l l 1 4 x 1 0 。6 m o l l ) 范围内成线性关系，相关系数为0 9 9 7 2 ，检出限为 l x l 0 嗡m o l l ；其中，完全非互补序列的电化学响应信号与空白信号基本相同，且 对一、二、三碱基错配序列的响应信号与完全互补序列的响应信号差别明显，表 明分子信标可以实现对目标d n a 的定量检测和在一定程度上鉴别碱基错配。 第三章：基于纳米金颗粒的高特异性d n a 电化学活性非活性转换分子信标体 系的研制及其应用 本章通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备纳米金颗粒，利用其与单链 d n a 和双链d n a 的不同相互作用，构建高特异性的d n a 电化学分子信标。实 验发现，完全非互补序列的电化学响应信号与空白信号基本相同，完全互补序列 与一、二、三碱基错配序列电化学响应差别明显，且单碱基错配序列的电化学响 应信号仅为完全互补序列的1 0 左右，与以往的方法相比，二者的电信号差别明 显扩大。这说明纳米金颗粒与单链d n a 和双链d n a 的不同相互作用大大提高 了杂交反应的特异性，完全有可能实现对单碱基突变基因片段的检测，为临床医 学诊断提供了一种行之有效的突变基因检测方法。 第四章：纳米金颗粒增强d n a 电化学活性非活性转换分子信标特异性的作用 机理研究 本章运用电化学方法对纳米金颗粒提高d n a 检测特异性的机理进行了更深 一步的考察研究。实验发现，纳米金颗粒与单链d n a 的结合力确实远高于双链 d n a ，并且认为分子信标环状部分的单链d n a 序列与其完全互补d n a 序列形 摘要 成双链d n a 的作用力要强于分子信标与纳米金颗粒之间的作用力。另外，分子 信标的识别能力还与错配碱基的类型及在分子信标中的位点有关。该方法对核酸 特定顺序的测定及基因突变的检测提供了新的理论依据。 关键字：d n a ，电化学，分子信标，胭脂红酸，活性非活性分子转换，纳米金 颗粒，单碱基错配 a b s l r a c t a b s t r a c t s t u d yo nt h es t r u c t u r eo fg e n ea n dt h em e c h a n i s mo fi t sf u n c t i o n i n gn o w a d a y s a r ear a t h e rh o tr e s e a r c hf i e l d a n dt h em o s ts i g n i f i c a n ts u c c e s so ft h i sf i e l di st h e “h u m a ng e n o m ep r o j e c t ”，w h i c hm e a n sg e n o m i cd i a g n o s ea n dt r e a t m e n to fh u m a n d i s e a s ea r ei ng r e a tp r o s p e c t t h ef o u n d a t i o no ft h i sk i n do fr e s e a r c hi sb a s e do nt h e r e c o g n i t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fd i s e a s er e l a t e dd n as e q u e n c e t h et r a d i t i o n a l s e q u e n c ed e t e c t i o nm e t h o d s ，h o w e v e r , a r eu s u a l l yt i m ec o n s u m i n ga n di n c o n v e n i e n t d n ab i o s e n s o r , an e wc o n c e p t i o no fg e n o m ed e t e c t i o nw h i c hb a s e do nw a t s o n c r i c k b a s em a t c hp r i n c i p l eo f f e r e da ni d e a lo p t i o n a n dt h ed n ab i o s e n s o rb a s e do nd n a h y b r i d i z a t i o nt e c h n i q u e ，c o m b i n i n g w i t hd i f f e r e n t l a b e l i n g m e t h o d ss u c ha s f l u o r e s c e n t ，c h e m i c a ll u m i n e s c e n to re l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s ，d e m o n s t r a t eg r e a t a d v a n t a g e ss u c ha se a s yh a n d l i n g ，q u i c kd e t e c t i o n ，f a v o r a b l es e l e c t i v i t y , t o g e t h e rw i t h m o l e c u l er e c o g n i t i o na n dd n as e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o na b i l i t i e s r e s e a r c ho n t h e s eb i o s e n s o r sh a sb e e no n eo ft h em o s ti n t e r e s t i n gf i e l d si ng e n o m es t u d y t h ed i s s e r t a t i o n h i g h l i g h t e di nt w oa s p e c t s f i r s t l y , m o l e c u l eb e a c o na n d n a n o t e c hw e r ei n t r o d u c e di n t ot h ed n ab i o s e n s o rm o d e l m o l e c u l eb e a c o nw a su s e d t oo p t i m i z et h ed n as t r a n d ，w h i c hw a st h em a i np a r to fb i o s e n s o r i t s h a i r p i n s t r u c t u r ec a u s e da na d d i t i o n a l h a i r p i no p e n p r o c e s si nt h eb i o s e n s o rd e t e c t i o n , r i g h t b e f o r et h ed n a h y b r i d i z a t i o np r o c e s s n i sm a d et h eh y b r i d i z a t i o nm o r ed i f f i c u l tt o h a p p e n l i k e w i s e ，g o l d n a n o p a r t i c l e ss h o wa f f i n i t yt os i n g l es t r a n dd n a ，a n dt h e i n t r o d u c t i o no fg o l d n a n o p a r t i c l e sa d d e da n o t h e r “p e e lo f f p r o c e s so ft h ed n as t r a n d ， a n di n c r e a s e dt h ed i f f i c u l t yo fh y b r i d i z a t i o na g a i n t h u s ，t os o m ee x t e n t ，b e c a u s eo f t h e s et w om e t h o d s ，t h es e l e c t i v i t yo ft h eb i o s e n s o rw a sg r e a t l yo p t i m i z e d s e c o n d l y , i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，at o t a l l yn e we l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l eb e a c o nm o d e lw a ss e t t l e d d i f f e r e n tf r o mt h et r a d i t i o n a le l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l eb e a c o nw h i c hd e p e n d e do n s t r u c t u r a l c h a n g eo ft h eo n e - e n d - i m m o b i l i z e dm o l e c u l eb e a c o ni n d u c e dd i s t a n c e v a r i a t i o nb e t w e e nt h es i g n a lm o l e c u l ea n dt h ee l e c t r o d es u r f a c ea n df i n a l l yc a u s e dt h e d i f f e r e n c eo fe l e c t r i c a l s i g n a l t h i sn e we l e c t r o c h e m i c a l m o l e c u l eb e a c o ni s t i n - i m m o b i l i z e d ，a n di tc o n d u c th y b r i d i z a t i o ni nt h et e s ts o l u t i o ni n s t e a do fo nt h e e l e c t r o d es u r f a c e t h es i g n a lv a r i a t i o nc a m ef r o ma l le l e c t r i c a la c t i v e - i n a c t i v e m o l e c u l es w i t c h t h e yw e r ee l e c t r i c a li n a c t i v ew h e nt h em o l e c u l eb e a c o nw a si n “h a i r p i n ”s t r u c t u r e ，a n dc o u l db e c o m ee l e c t r i c a la c t i v ea f t e rt h e “h a i r p i n s t r u c t u r e a b s t r a c t w a so p e n e d t h i sn e wk i n do fe l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l eb e a c o ni n h e r i t e da d v a n t a g e s o ff l u o r e s c e n tm o l e c u l eb e a c o n ，s u c ha sq u i c k ，s i m p l ea n de a s yt oc o n t r o l ，a n dh a d s o m eu n i q u ep r e d o m i n a n c e ，s u c ha sl o wc o s ta n dt h ep r o s p e c to fr e f i tt o p o r t a b l e d e v i s e s t h ed i s s e r t a t i o ni n c l u d e sf o u rc h a p t e r s ： c h a p t e r1p r e f a c e t h e p u r p o s ea n dd e v e l o p m e n to fd n ae l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o r s 、r e i n t r o d u c e df i r s t l y , e l e c t r o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o n sw e r et h e e m p h a s i s m o l e c u l a r b e a c o n sa n di t se s p e c i a ld e t e c t i o nm e t h o d sw e r ea l s oi n c l u d e d g o l d n a n o p a r t i c l e sa n d i t sa p p l i c a t i o ni nb i o a n a l y s i sw e r ei n t r o d u c e d a tl a s tt h e p u r p o s ea n di n n o v a t i o n p o i n to ft h ed i s s e r t a t i o nw e r ep o i n t e do u t c h a p t e r2s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fan e we l e c t r i c a l a c t i v e - i n a c t i v es w i t c hm o l e c u l a rb e a c o n w e d e v e l o p e dan e we l e c t r i c a la c t i v e i n a c t i v es w i t c hm o l e c u l a rb e a c o na n du s e d c a r m i n i ca c i da ss i g n a lm o l e c u l e m o l e c u l a rb e a c o nc o u p l e dw i t hc a r m i n i ca c i dw a s e l e c t r o c h e m i c a l i n a c t i v i t y , b u t a f t e r h y b r i d i z e dw i t hc o m p l e m e n t a r ys e q u e n c e e l e c t r o c h e m i s t r ys i g n a lw a sg r e a t l ye n h a n c e d ，a n di tw a sl i n e a rr e l a t e d 埘t l lt h e c o n c e n t r a t i o no fc o m p l e m e n t a r ys e q u e n c ei nt h e r a n g eo f6 0 xl0 一m o l l - - - 1 4 x10 6 m o l l ，w i t ht h ed e t e c t i v el i m i to flxl0 一m o l l t h es i g n a lo fn o n c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c ew a sa l m o s tt h es a m ea st h a to fm o l e c u l a rb e a c o n ，a n dt h er e s p o n s e so fo n e b a s em i s m a t c h e d s e q u e n c e ，t w ob a s e sm i s m a t c h e ds e q u e n c ea n dt h r e eb a s e s m i s m a t c h e ds e q u e n c ew e r eo b v i o u s l yd i s t i n g u i s h e df r o mt h a to fc o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e w i t hh i g hs e n s i b i l i t ya n ds e l e c t i v i t y , t h i sm o l e c u l a rb e a c o ni ss u i t a b l ef o r q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no ft a r g e td n a c h a p t e r3s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no fah i g hs e l e c t i v ed n a e l e c t r i c a la c t i v e 。i n a c t i v es w i t c hm o l e c u l a rb e a c o nb a s e do ng o l d n a n o p a r t i c l s g o l d n a n o p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db yt h er e d u c t i o no fc h l o r a u r i ca c i d a n v a b s t r a c t e l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l a rb e a c o nb a s e do ng o l d n a n o p a r t i c l sw i t hh i g hs e l e c t i v i t yw a s d e v e l o p e d t h es i g n a lo fn o n - c o m p l e m e n t a r ys e q u e n c ew a sa l m o s tt h es a m ea st h a to f m o l e c u l a rb e a c o n ，a n dt h er e s p o n s e so fo n eb a s em i s m a t c h e ds e q u e n c e ，t w ob a s e s m i s m a t c h e d s e q u e n c e a n dt h r e eb a s e sm i s m a t c h e d s e q u e n c ew e r eo b v i o u s l y d i s t i n g u i s h e df r o mt h a to fc o m p l e m e n t a r ys e q u e n c e t h es i g n a lo fs i n g l e m i s m a t c h e d d n aw a so n l y10 o ft h a to ft h ec o m p l e m e n t a r ys e q u e n c e ，w h i c hw a sm u c hm o r e s u p e rt h a na n ym e t h o d sm e n t i o n e db e f o r e ，t h u si tc o u l de a s i l yi d e n t i f yb a s em u t a t i o n o fd n ai np r a c t i c e t h ee l e c t r o c h e m i c a l s i g n a l w a sl i n e a rr e l a t e d 丽t h t 1 1 e c o n c e n t r a t i o no f c o m p l e m e n t a r ys e q u e n c e i nt h e r a n g eo f8 3 9 x10 一m o l l 1 0 5x10 m o l l ，w i t ht h ed e t e c t i v el i m i to f2x10 - 9 m o l l c h a p t e r4t h ep r i n c i p l eo fah i g hs e l e c t i v ed n ae l e c t r i c a la c t i v e i n a c t i v es w i t c h m o l e c u l a rb e a c o nb a s e do n g o l d n a n o p a r t i c l s e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sw e r eu t i l i z e df o rs t u d y i n go nt h ep r i n c i p l eo f t h eh i g h s e l e c t i v em o l e c u l a rb e a c o nb a s e do ng o l d n a n o p a r t i c l s t h i sm o l e c u l a rb e a c o nc o u i d e f f i c i e n t l yd e t e c ts i n g l e - b a s em i s m a t c ho fd n a t h er e a s o nw a st h a ts s d n aa n d d s d n aw i t h g o l d n a n o p a r t i c l sh a dt h ed i f f e r e n tp r o p e r t i e s s s d n ah a ds t r o n g a t t r a c t i v ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n sw i t h n e g a t i v e l yc h a r g e dg o l d n a n o p a r t i c l s ，a n d c o u l di n t e r a c tw i t ht h e mt h r o u g ht h ec o o r d i n a t i o no fn i t r o g e na t o m s ，w h i l ed s d n a c o u l dn o t m o r e o v e r , t h es e l e c t i v i t yo fc a s m bw a sr e l a t e dt ot h ep o s i t i o na n dt h e t y p eo fm i s m a t c h e db a s e t h i sd n ae l e c t r o c h e m i c a lm o l e c u l a rb e a c o ni ss u i t a b l ef o r s i n g l eb a s em i s m a t c hd e t e c t i o n ，w h i c hp r o v i d e san e ww a yf o rd e v e l o p i n gs i m p l e ， s p e e d ya n di n e x p e n s i v eb i o p r o b e k e yw o r d s ：d n a ，e l e c t r o c h e m i s t r y , m o l e c u l e b e a c o n ，c a m i n i ca c i d ， e l e c t r o 。a c t i v e i n a c t i v e s w i t c h ，g o l d n a n o p a r t i c l s ，s i n g l e b a s e m i s m a t c h 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或 撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明 确说明并表示谢意。 作者签名：塑逝日期：2 堂：坚：! l 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位 论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论 文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 靴做储摊：黼翮鹕。 艰c 卅 日期：姗8 町j 7 日期： 二卯子基f 7 第一章绪论 第一章绪论 一、d n a 电化学生物传感器 1 引言 核酸是重要的生物大分子，核酸研究是分子生物学的重要领域【1 1 。核酸分脱 氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 和核糖核酸( r i b o n u c l e i ca c i d ，r n a ) 两大 类，其中d n a 中含有大量的基因遗传信息，是遗传信息的载体，具有储存和传 递信息的功能，绝大多数生物体的遗传信息都储存在d n a 分子中，d n a 的复制 构成了遗传的基础。1 9 5 3 年w a s t o n 和c r i c k 以立体化学上的最适结构构建了与 d n a x 射线衍射资料相符的分子模型，即d n a 双螺旋结构模型【2 】是分子遗传 学诞生的标志，开拓了分子生物学的领域。 d n a 分子是由两条脱氧核糖核酸链组成的具有复杂三维结构的大分子化 合物。构成d n a 的基本单元是脱氧核糖、核苷酸和磷酸。核苷酸的碱基有四种： 腺嘌呤( a ) 、乌嘌呤( g ) 、胸腺嘧啶( t ) 和胞嘧啶( c ) ，结构如下： 昧嘌呤 鸟嘿峰胞嗜嚏 胸腺嘧唿 核苷酸通过3 ，5 。磷酸二酯键连接而形成没有支链的直线型或环状结构， d n a 分子中核苷酸的排列顺序成为d n a 的一级结构。d n a 的二级结构一般指 d n a 分子的双螺旋结构，即w a s t o n c r i c k 模型。d n a 链的内侧是碱基，两条链 以平行方向盘绕同一条轴形成右旋的双螺旋结构，两条链上的碱基是匹配的，称 为碱基互补。腺嘌呤和胸腺嘧啶以两个氢键连接，鸟嘌呤和胞嘧啶以三个氢键连 接，在d n a 分子中互补碱基的含量相等。在二级结构的基础上，d n a 分子还可 以扭曲或卷曲形成超螺旋三级结构。 基因是d n a 分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最 小功能单元。人们形象地将d n a 碱基序列称为遗传编码，而d n a 序列分析是 揭开遗传密码地关键，也是基因研究的核心【3 】o 由于基因d n a 分子序列中微小 的改变，导致基因突变及多态性，如一个或几个核苷酸的取代、缺失或增多，就 会导致遗传性状的改变或各种疾病的出现，例如，家族性高胆固醇血症是最常见 第一章绪论 的常染色体显性疾病之一，该病由低密度脂蛋白受体基因突变造成，并引起冠心 病的高危险性【4 】；亨廷顿症是因为正常的基因插入了重复的多碱基而引起的【”。 因此，通过对人体的血液、组织和体液等样品中特定d n a 序列的测定，可用来 确诊感染疾病的根源。所以核酸的研究已成为生物化学、遗传学、分子生物学和 细胞生物学等生命科学研究领域中的热点，其覆盖面之广、进展之速，为其他学 科所望尘莫及。随着基因结构与基因功能研究的不断深入，特别是“人类基因组 项目的快速进展，迅速推动人类疾病的d n a 诊断及基因治疗的研究。至今， 对人类基因组含有的3 x 1 0 9 个碱基对的“人类基因组 草图已经提前绘制完成， 这一宏伟目标的实现不仅使人们从根本上对人体的所有生命活动有了全面的了 解，而且会对某些现在还不能控制的疾病，找到根本的治疗方法。 传统的对d n a 序列的测定一般采用凝胶电泳法，该方法需要经过放射性标 记、聚合酶链式反应( p o l y m e r s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 和电泳等一系列操作过程， 消耗时间长，劳动强大。在这种情况下，以w a t s o n c r i c k 碱基互补配对原则为基 础的d n a 生物传感器应运而生，为分子生物学研究提供了全新地基因检测技术， 并很快成为了一个研究热点。目前，多数d n a 生物传感器都是建立在d n a 分 子杂交基础上的，它是分子生物学与微电子学、电化学和光谱学等学科交叉结合 的产物，在生命科学与信息科学之间驾起了一座桥梁，成为d n a 信息分析检测 最重要的手段之一。一些非放射性的新的标记方法如荧光法 6 - 8 】、化学发光法【9 。1 1 1 、 电化学法【1 2 。18 】等取代了传统的放射性同位素法，这些检测方法与d n a 杂交技术 相结合，组成各种类型的d n a 生物传感器。d n a 生物传感器既免去了放射性标 记对人体的危害以及昂贵的价格，又节省了电泳操作花费的时间，具有操作简便、 快速灵敏、选择性好和无污染等特点，并且具有分子识别，分离纯化基因等功能。 因此，近年来受到了国内外科技工作者的广泛重视，已成为基因研究中最具有吸 引力的前沿课题之一【1 9 2 4 】。 2i ) n a 电化学生物传感器 基于核酸杂交过程的电化学d n a 传感器促进了基因疾病的诊断、传染媒介 的检测、基因表达差异的测量，以及法庭科学、药物筛选与环境监测等的发展。 d n a 电化学传感器结合了电化学方法的分析能力和核酸识别过程的特异性，因 而在检测d n a 杂交方面受到广泛关注。因其具有灵敏度高、价格低廉、自动化 程度高和易微型化等特点，被认为是一种有发展前景的分析测试方法，是目前传 感器中最成熟的一种。 d n a 电化学传感器是由一个支持d n a 片断( 即探针d n a ) 的电极( 包括金电 2 第一章绪论 极、玻碳电极、热解石墨电极和碳糊电极等) 或固体表面以及电活性杂交指示剂 构成。d n a 探针一般是由2 0 4 0 个碱基组成的核苷酸片段，包括天然的核苷酸 片断和人工合成的寡聚核苷酸片断。将探针d n a 固定在电极或固体表面，由于 单链d n a 与溶液中的互补链( 即目标序列) 杂交的高度序列特异性，使其具有极 强的分子识别能力。d n a 探针与目标序列杂交形成双链d n a ，从而导致杂交前 后d n a 结构的改变，这种杂交前后的差异可用杂交指示剂来识别，从而达到检 测的目的。 d n a 自身的结构和组成很适合进行电化学信号测定，例如碱基的氧化和碱 基对电子的传递能力，因此，很多电化学检测方法都在试图探询d n a 的此类特 征。电化学检测d n a 可以分为直接检测和间接检坝, u t 2 s 。直接检测的依据在于 d n a 与某些电极表面的直接电子转移是可能的，而且d n a 的一些组分包括碱 基和核糖在一定电势窗口下也是有电化学活性的。间接检测则是通过一些氧化还 原媒介来实现电子传递，借助于这些与d n a 选择性结合的有电化学活性的指示 剂来进行杂交检测。例如，一些具有电化学活性的阳离子会与带负电荷的d n a 磷酸骨架静电结合；d n a 双螺旋的沟槽也可作为电化学活性分子的连接位点； 在d n a 链上标记一些电活性标记物作为信号探针；另外，也可利用电催化反应 或一些新型纳米材料对杂交信号进行放大。 2 i 电化学信号的直接检测 由于杂交能引起电化学信号发生改变，因此利用这种性质不仅可以简化检 测过程( 不需加入指示剂) ，而且可以即时检测d n a 双螺旋结构的形成。这种检 测方法监测的是目标d n a 或探针d n a 本身的氧化还原活性的改变，或者监测 探针界面的电化学性质的变化。在4 个碱基中，鸟嘌呤( g ) 是最容易被用于非标 记法检测d n a 的，它较易发生电化学氧化反应，由于杂交后d n a 的双螺旋结 构外侧的脱氧核糖阻碍内侧碱基的电化学反应，因此g 的电化学氧化信号在杂 交后明显下降，基于此可设计出无标记( 或无试剂) 的电化学基因传感器。研究表 明可用于非指示剂型传感器杂交的检测【2 6 】。 w a n g 等【z7 】将探针中的g 都用次黄嘌呤核苷的残基取代( 取代后仍能和c 配 对) ，通过直接检测目标d n a 中鸟嘌呤的氧化还原电化学信号来检测杂交情况。 h h t h o r p 等人【2 8 】发现r u ( b p y ) 3 2 + 氧化还原的电催化过程可以极大地提高杂交后 鸟嘌呤的信号。由于目标d n a 中存在鸟嘌呤，可以通过上述的电催化过程输出 经放大的信号。他们【z 9 j 还用这种方法检测了含有鸟嘌呤d n a 链的碱基的突变和 第一章绪论 缺陷。除了对d n a 中的鸟嘌呤进行阳极检测外，还可利用对目标d n a 中的腺 嘌呤进行阴极扫描，也有较高的灵敏度。 杂交反应会改变电极界面性质，使电极界面的负电荷增加，即相对应的交 流阻抗谱图会发生改变，因此可以通过阻抗方法构建非标记型的电化学d n a 生 物传感器。w i l l n e r 小组【3 0 - 3 8 系统研究了法拉第交流阻抗谱图在d n a 杂交检测中 的应用，发现d n a 杂交会导致界面负电荷增多，阻碍溶液中指示剂( 如 f e ( c n ) 6 3 4 ) 幂- j 电子传递，使阻抗值增大。这种阻抗值变化对d n a 的杂交和突 变具有很高的灵敏性，并且其变化信号可进一步扩增。我们研究小组报道了基于 交流阻抗技术的无标记型的d n a 电化学生物传感器【3 9 枷】，这种方法的灵敏度可 达1 0 。1 3 m o l l 。这类传感器简单快速，使用方便，可进行连续在线动态检测，因 此发展无标记型的d n a 生物传感器很可能成为d n a 生物传感器的一个新的发 展方( h - j 4 1 1 。 2 2 基于电活性嵌入式杂交指示剂( i n t e r c a l a t o r ) l i 勺检测 一直以来，人们对基于d n a 的氧化还原活性或电催化嵌入剂的电化学检测 非常感兴趣，因为这种方法不需对目标d n a 作任何化学修饰。一般情况下，嵌 入剂是一些具有电化学活性的小分子物质，它们能选择性地与电极表面的双链 d n a 结合。若将杂交反应后的电极浸入含有嵌入剂的溶液中反应一定时间，或 在杂交反应之前，先加入一种电化学活性分子再进行杂交反应，电化学检测到的 信号大小或变化值可以反映电极表面双链d n a 的多少，从而测定被测溶液中目 标d n a 片段的含量。 常用的插入剂包括一些抗肿瘤药物和小分子染料等【4 2 - 5 0 。h a s h i m o t 掣5 1 1 和 w a n g 等【5 2 j 采用一种与d n a 双螺旋的小沟特异连接的电化学活性染料h o e c h s t 3 3 2 5 8 作为信号指示剂，在d n a 修饰的金电极上检测了特异序列的杂交反应。 h o e c h s t3 3 2 5 8 在5 5 0m v ( a g a g c l ) 发生不可逆的氧化反应，在双链上的电化学 信号比单链强两倍以上，可以区分开互补与非互补的序列。但是，它与电极间存 在非特异性吸附，限制了检测的灵敏度。t a n s i l 掣5 3 】随后合成了一种类似的连接 吡啶锇的萘衍生物( p i n d 2 0 s ) ，这种电化学活性指示剂不仅可以通过萘的平面结 构嵌入d n a 双链中，还可以通过锇的正电荷与带负电的d n a 实现静电吸附， 进一步增强了插入剂与d n a 的相互作用。在优化的实验条件下，对5 0 个碱基 的目标序列检测限为6 x 1 0 1 3 m o l l ，线性范围为1 1 0 。1 2 3 1 0 。1 0 m o l 。这种杂交 指示方法对单碱基错配序列有较好的区分能力，信号强度的比值约为3 5 ：1 。 m o r i t a 等【5 4 】利用光黄素可以选择性地与胸腺嘧啶结合的能力以及自身的电化学 4 第一章 绪论 活性，对双链d n a 中胸腺嘧啶碱基的错配进行了检测，但这种方法只适用于胸 腺嘧啶相关的突变检测。 2 3 基于电化学活性标识剂的检测 合成带有电化学活性官能团的寡聚核苷酸与电极表面的目标基因选择性进 行杂交反应，在电极表面形成带有电化学活性官能团的杂交分子，通过测定其电 信号可以识别和测定d n a 分子。 g a m i e l 5 5 1 将一个含1 3 个碱基的寡聚核苷酸连接到聚吡咯上，d n a 分子的导 电性，使其不仅可以增加聚毗咯的电导，而且可以使其在水溶液中具有更高的电 化学活性。实验发现，当杂交反应发生后，电流会降低，并且认为这是由于聚合 物骨架形态的改变而引起的。目前这种方法的灵敏度为1 0 。1 3 m o l l 。b a u e r l e 5 a l 已在实验中观察到当连接到聚噻吩的冠醚与碱金属配合时，产生电信号的改变。 t a k e n k a 等瞪7 1 成功地用电化学活性的羧基二茂铁制成二茂铁寡聚核苷酸探针，与 含有互补序列的单链d n a 选择性杂交后，经h p l c 分离和电化学检测，其响应 与复合物的量呈线性关系，线性响应范围为2 0 1 0 0f m o l 。我们小组曾用电化学 活性物质醛基和氨基二茂铁制成二茂铁标记d n a 探针【5 8 - 6 2 】杂交后直接测定二茂 铁的氧化还原峰电流，实现了对小牛胸腺d n a 的检测以及d n a 损伤和保护方 面的研究。最近我们小组又用各种量子点如a u 、a g 、c u a g 、c d s 以及联吡啶 钻包裹的二氧化硅等【6 确8 】制成纳米颗粒标记的d n a 探针，并与阳极溶出法结合，