（分析化学专业论文）免疫、dna压电生物传感器的研究.pdf

湖南大学分析化学专业博士学位论文楚霞 1 9 9 9 年6 月 免疫、d n a 压电生物传感器的研究 ( 摘要) 1 9 5 9 年，s a u e r b r e y 最先提出了将压电晶体谐振器用作定量测量质量的装置，并从理 论上导出了频率与质量变化之间的关系式s a u e r b ，e y 方程：f 一- - 2 f 芦3 a m 一一 a 凡 c a m ，其中a f 为检测到的频率变化，单位为h z ；f 0 为基本谐振频率，单位为h 2 ；a m 为质 量的改变，单位为g ；a 为压电活性面积( 电极表面积) ，单位为c m 2 ；h 为石英的剪切模 式，2 9 4 7 1 0 1 1 9 c m ；氏为石英密度，2 6 4 8 9 c m ；c 为质量敏感常数( 依应用晶体 类型而定) ，单位为( s g ) 。 自从1 9 7 7 年s h o n s 等利用戊二醛交联修饰白蛋白和7 一球蛋白研制了第一个压电免 疫传感器和1 9 8 8 年f a w c e t t 等首次利用压电分析方法进行了d n a 杂交研究之后，压电 石英晶体被广泛她用于骈制各种免疫和d n a 的生物砖感器。由于压电石英晶体生物传 感系统具备能够在线、实时分析，高灵敏度，高选择性，干扰小，响应时间快，使用简单，仪 器小，便于携带，耗用少等优点，因此，被广泛地用于解决生化研究，临床诊断，环境和工业 监测过程中的问题。1 ， 本论文的第一部分着重于压电免疫传感器的研制以及利用压电石英晶体对免疫反应 的动力学进行研究，论文的第二部分主要是压电d n a 传感器的研制 第一部分：在第一章和第二章中，, i m p s 亘萎鱼焦对其表面吸 容如下： 量敏感的特 性，通过在石英晶体表面屋定相应抗体，攫4 置石英晶体在与相应抗原反应前后在气相中的 频率变化，分别研制成免疫球蛋白m ( i g m ) 和甲胎蛋白( a f p ) 压电免疫传感器，可以对浓 度为5 9 3 p g m l 范围内的i g m 和浓度为1 0 0 8 0 0 n g m l 范围内的a f p 进行定量测定。 在第三章中，通过将双抗体修饰的石英晶体于五种不同p h 值的缓冲介质中反应，构造了 一个五元传感器阵列体系用于i g m 和c 一反应蛋白( c r p ) 的同时免疫分析，用该传感器阵 列系统结合三种线性回归方法( 普通最小二乘o i 。s ，偏最4 - - 乘p l s 和最小截尾平方和 l t s ) 对8 个混合溶液的未知样品进行了浓度预测，三种方法都能获得满意的预钡5 结果。 在第四章中，利用石英晶体微天平技术在线监测了l g m 在固定有抗t g m 抗体的石英晶体 恕 摘要 上的吸附与解吸过程，测得该免疫反应的结合常数k 。为7 1 0 1 0 7 ( m o l i ，) 。对该免疫 反应的动力学过程进行了研究，测得免疫反应的活化能e 为1 8 0 5 2 k j t o o l 。在第五章和 第六章中，利用压电石英晶体能够响应溶液密度与粘度的特性，研制了基于聚合物凝集的 压电免疫分析方法测定了补体第三成分( c ，) 和人血清白蛋白( h s a ) ，可以对浓度为2 2 0 49 1 , u g m l 范围内的c ，和浓度为i 1 2 8 7 8 p g m i 范围内的h s a 进行定量测定。所有 这些工作，对于开发新型免疫传感器，进行免疫反应机理研究，都具有很重要的意义。 第二部分：在第七章中，通过生物素一亲合索反应，将生物素化捕获探针固定于石英晶 体表面，对d n a 杂交过程进行了在线监测。通过形成亲合素一生物索化检测探针一d n a 目 标链的三元络合物，将直接杂交信号放大了3 2 倍，可以对1 0 6 0 p g m l 浓度范围内的 d n a 目标链进行定量测定。在第八章中，利用亲合素与生物素化羊抗人i g g 抗体所形成 的网络复合物，结合生物索化检测探针，将d n a 杂交信号进行质量放大，可对直接杂交 分析不能检测的浓度在5 5 0 , u g m l 范围内的d n a 目标链进行定量测定。这些研究对于 开发新型d n a 传感器具有十分重要的意义。 第三部分：核酸可以与许多化合物发生可逆性相互作用。近年来，这种核酸嵌入分子 与d n a 的相互作用已用各种方法进行过广泛的研究，这些方法包括分光法和x 一射线晶 体学方法等。最近，核酸嵌入分子与d n a 相互作用的电化学研究已引起了人们极大的兴 趣。在第九章和第十章中，开展了抗癌药物与核酸相互作用的电化学研究，详细地研究了 柔红霉素和表阿霉素两种抗癌药物与d n a 相互作用的电化学性质的变化，探讨了它们 与d n a 相互作用的机理，并且利用与d n a 作用后抗癌药物峰电流的降低，对d n a 进 行了定最测定。这些研究对于新型抗癌药物的设计和肿瘤的化学治疗有理论指导意义，同 、 时，对于建立简便而有效的抗癌药物筛选方法也是很有帮助的。一7 7 湖南大学舟析化学专业博士学位论文 楚霞 9 9 9 年6 局 一 s t u d i e so ni m m u n oa n dd n a p i e z o e l e c t r i cb i o s e n s o r ( a b s t r a c t ) i n1 9 5 9s a u e r b r e yd e v e l o p e da ne m p i r i c a le q u a t i o nt od e s c r i b et h em a s ss e n s i t i v i t y o fg a sp h a s em a s sd e p o s i t i o no n8p i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l s a u e r b r e ye q u a t i o n ： f 一- - 2 f = ：& = m 一一c m ，w k r ea 1 5 hm e a s u r e df r 。q u e 吐ys h i l t ，hh 。；f 日i s t k u a d a a 、，p q m e n t a lr e s o n a n tf r e q u e n c y ，i nh a ；mi sm a s sc h a n g e ，i ng ；ai sp i e z o e l e c t r i c a l l ya c t i v e a r e a ( a r e ao fe l e c t r o d es u r f a c e ) ，i ne m 2 ；hi ss h e a rm o d u l u so fq u a r t z ，2 9 4 7 1 0 “g c m 一；p qi sd e n s i t yo fq u a r t z ，2 6 4 8 9 c m ；ci sm a s ss e n s i t i v i t yc o n s t a n t ( b a s e d o nt y p e o fc r y s t a lu s e d ) ，i n ( 8 9 ) 。 s i n c es h o n se ta 1 i m m o b i l i z e da l b u m i na n dg a m m ag l o b u l i nt h r o u g hg l u t a r a l d e h y d e c r o s s l i n k i n gt oc r e a t et h ef i r s tp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a lb i o s e n s o ri n 1 9 7 7a n df a w c e t t e ta 1 c o n d u c t e dt h ef i r s ts t u d yo nd n ah y b r i d i z a t i o nu s i n gp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a li n 1 9 8 8 ，p i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l sh a v e f o u n dw i d ea p p l i c a t i o n si nt h ed e v e l o p m e n to f v a r i o u si m m u n oa n dd n ab i o s e n s o r s b e c a u s ep i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a lb i o s e n s i n g s y s t e m sp o s s e s sm a n ya d v a n t a g e si n c l u d i n g t h ep o t e n t i a lf o ro n l i n e a u t o m a t e d ，r e a l t i m ea n a l y s i so u t p u t ；h i g hs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y ；r e d u c e di n f l u e n c eo fi n t e r f e r e n c e s ； r a p i dr e s p o n s et i m e ；e a s eo fu s e ；s m a l l ，r e a d i l yt r a n s p o r t a b l ei n s t r u m e n t a t i o na n d c o s te f f c c t i v e n e s s ，f u t u r es t u d i e sw i l tl i k e l yb ea p p l i e dt os o l v i n gr e s e a r c hp r o b l e m si nb i o c h e m i e a li n v e s t i g a t i o n s ，c l i n i c a ld i a g n o s t i c sa n di ne n v i r o n m e n t a la n di n d u s t r i a lp r o c e s sm o n i t o t i n g t h ef i r s tp a r to ft h i st h e s i sf o c u s e so nt h ed e v e l o p m e n to fp i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o ra n dt h es t u d yo nk i n e t i c so fi m m u n o r e a c t i o nu s i n gp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l ，a n d t h es e c o n dp a r ti s p r i m a r i l yd i r e c t e dt ot h ed e v e l o p m e n to fp i e z o e l e c t r i cd n a s e n s o r t h ed e t a i l e di n v e s t i g a t i o n sa r ea sf o l l o w s ： t h ef i r s tp a r t ：i nc h a p t e ria n dc h a p t e r2 ，t h ep i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o r sh a v e b e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fi m m u l l 0 9 1 0 b u l j nm ( i g m ) a n da f e t o p r o t e l n ( a f p ) b yt a k i n ga d v a n t a g eo ft h es e n s i t i v i t yo fp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a lt o t h em a s s o ft h em a t e r i a l sa d s o r b e do n t oi t t h ei m m o b i l i z a t i o no fa n t i b o d i e st ot h ec r y s t a l s 7 s u r f a c e sw e r ea c c o m p l i s h e dv i a ac n b r a c t i v a t e de o p o l y m e rc o a t i n go f2 - h y d r o x y e t h y l m e t b a c r y l a t ea n dm e t h y l m e t h a c r y l a t e ，a n dt h ef r e q u e n c ys h i f t sb e f o r ea n da f t e rt h e i m m u n o r e a c t i o n so ft h e s ea n t i b o d y i m m o b i l i z e dp i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l sw i t ht h e i rc o r r e s p o n d i n ga n t i g e n sw e r el i n e a r l yd e p e n d e n t o nt h ei g mc o n c e n t r a t i o n si nt h er a n g eo f5 9 3g g m la n dt h ea f pc o n c e n t r a t i o n si nt h er a n g eo fi 0 0 8 0 0n g m 1 i nc h a p t e r3 ，a s i m u l t a n e o u si m m u n o a s s a yt e c h n i q u eh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fi g m a n dc - r e a c t i v ep r o t e i n ( c r p ) h yc o n s t r u c t i n gap i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a la r r a ys y s t e m t h i sa r r a ys y s t e mw a sc o m p o s e do ff i v ep i e z o e l e c t r i cq u a r t zc r y s t a l s e a c hc r y s t a lw a s i m m o b i l i z e dw i t ha n t i i g ma n da n t i c r pa n t i b o d i e sb u tw o r k e du n d e rf i v ed i f f e r e n td e t e c t i o nc o n d i t i o n s t h i sa r r a ys y s t e mw a sa p p l i e ds u c c e s s f u l l yt ot h ee s t i m a t i o no ft h e c o n c e n t r a t i o n so fe i g h tu n k n o w ns a m p l e sc o m b i n e dw i t ht h r e el i n e a rr e g r e s s i o nm e t h o d s i e ，o r d i n a r yl e a s ts q u a r e s ( o i s ) ，p a r t i a ll e a s ts q u a r e s ( p l s ) a n dl e a s t t e r m i n a t e d s q u a r e s ( i 。t s ) i nc h a p t e r4 ，t h ea d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no fi g ma n t i g e no nt h ec r y s t a l m o d i f i e dw i t ha n t i l g ma n t i b o d yh a v eb e e nc o n t i n u o u s l ym o n i t o r e da n dt h ei m m n n o r e a c l i o nk i n e t i c sh a sb e e ni n v e s t i g a t e du s i n gt h eq u a r t zc r y s t a lm i c r o b a l a n e e t h ea s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( k 。) a n dt b ea r r h e n i u sa c t i v a t i o ne n e r g y ( e ) o ft h ei m n m n o r e a c t i o nw e r ee a l c u l a t e dt ob e7 1 0 1 0 7 ( m o l i ) a n d1 8 0 5 2 k j t o o l ，r e s p e c t i v e l y i nc h a p t e r5a n d c h a p t e r6 ，t h ep i e z o e l e c t r i ci m m u n o a s s a yt e c h n i q u e s ，w h i c ha r eb a s e do nt h ea g g l u t i n a l i o no fa n t i b o d y o ra n t i g e n b e a r i n gp o l y m e rc a u s e db yi m m u n o r e a e t i o n s ，h a v eb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc o m p l e m e n t1 1 ( c ，) a n dh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) t h ef r e q u e n c ys h i f t sw e r el i n e a r l yd e p e n d e n tt ot h ec 3c o n c e n t r a t i o n si nt h er a n g eo f2 2 0 4 9 1p g m la n dt h eh s ac o n c e n t r a t i o n si nt h er a n g eo f1 1 2 8 7 8 9 9 m 1 t h es e c o n dp a r t ：i nc h a p t e r7 ，a2 0 一r n e rb i o t i n y l a t e dc a p t u r ep r o b ew a si m m o b i l i z e d o n t ot h es u r f a c eo fq c mb yt h ea v i d i n b i o t i nb r i d g e ，a n dt h es u b s e q u e n th y b r i d i z a t i o n w i t hd n at a r g e ts t r a n di ns o l u t i o nw e r em o n i t o r e di n s i t uf r o mq c mf r e q u e n c y c h a n g e s t h ef r e q u e n c ys i g n a lr e s u l t i n gf r o mb y b r i d i z a t i o nw a sa m p l i f i e db yt h ef o r m a t i o no fa v i d i n - b i o t i n y l a t e dd e t e c t i o np r o b e d n at a r g e ts t r a n dt e r n a r yc o m p l e xa n di n 湖南大学分析化学专业博士学位论文楚霞1 9 9 9 年6 月 v c r e a s e db y 3 2t i m e s t h ei na i rf r e q u e n c yc h a n g e sb e f o r ea n da f t e ra m p l i f i e dm a s sh y b r i d i z a t i o na s s a yd e p e n d e dl i n e a r l yo nt h ec o n c e n t r a t i o n so fd n a t a r g e ts t r a n d i nt h e r a n g eo fl o 6 0 p g m 1 i nc h a p t e r8 ，t h ef r e q u e n c ys i g n a lp r o d u c e db yh y b r i d i z a t i o nw a s a m p l i f i e ds i g n i f i c a n t l yb yt h ea v i d i n 一( b i o t i n y l a t e dg o a ta n t i h u m a ni g ga n t i b o d y ) c o m p l e x ，a n dt h ef r e q u e n c yc h a n g e sd e p e n d e di n e a r l yo nt h ec o n c e n t r a t i o n so fd n at a r g e t s t r a n di nt h er a n g eo f5 5 0 p g m 1 t h et h i r dp a r t ：a 、一e f yo fs m a l lm o l e c u l e si n t e r a c tr e v e r s i b l yw i t hd o u b l e s t r a n d e d d n a t h ei n t e r a c t i o n so fd n aw i t hn u c l e i c a c i db i n d i n gm o l e c u l e sh a v eb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e do v e rt h ep a s ty e a r su s i n gv a r i o u st e c h n i q u e s ，i n c l u d i n gs p e c t r o s c o p i ca n dx r a yc r y s t a l l o g r a p h i cm e t h o d s i nt h er e c e n ty e a r s ，g r o w i n gi n t e r e s th a sa r i s e ni ne l e c t r o c h e m i c a l i n v e s t i g a t i o n s o fi n t e r a c t i o n sb e t w e e n n u c l e i c - a c i d ，b i n d i n g m o l e c u r sa n d d n a i nc h a p t e r9a n dc h a p t e r1 0 ，v o h a m m e t r i cs t u d i e so ft h ei n t e r a c t i o n so fa n t i c a n c e r d r u g sw i t hd n a w a sc a r r i e do u t t h ev a r i a t i o n si nt h ec y c l i cv o h a m m e t r i cb e h a v i o ro f d a u n o m y c i na n dp h a r m o r u b i c i ni na na q u e o u sm e d i u mo na d d i t i o no fd n a h a v eb e e n s t u d i e d ，a n dt h em e c h a n i s mo ft h ei n t e r a c t i o n sh e t w e e na n t i c a n c e rd r u g sa n dd n aw a s p r o b e d t h ed e c r e a s ei nt h ea n o d i cp e a kc u r r e n to fa n t i c a n c e rd r u g sa f t e rt h ea d d i t i o no f d n aw a su t i l i z e df o rt h eq u a n t i t a t i o no fd n a t h e s ei n v e s t i g a t i o n sf o r mat h e o r e t i c g u i d ef o rt h ed e s i g no fn e wa n t i c a n c e rd r u g sa n dc h e m i c a lt r e a t m e n t so ft u m o ra n d v i r u s t h e ya r ea l s ov e r yv a l u a b l ef o re s t a b l i s h i n gc o n v e n i e n tm e t h o d st oe f f e c t i v e l y c h o o s es p e c i f i ca n t i e a n e e rd r u g s 湖南大学分析化学专业博士学位论文 楚 霞1 9 9 9 年6 月 绪言 从卒世纪4 0 年代起，就已开始用酶作为分析试剂来检测特定的物质。除了酶以外，其 它具有分子识别作用的物质，例如抗体、抗原、激索等，也可固定于载体膜上构成传感器的 敏感元件。此外，固定化的细胞、细胞器及动、植物组织的切片也有类似的作用。这类用固 定化的生物体成分( 酶、抗原、抗体、激素) 或生物体本身( 细胞、细胞器、组织) 作为敏感元 件的传感器通常称为生物传感器。在生物传感器中除敏感元件( 分子识别元件) 外还包括 信号转换器件。常用的信号转换器有电化学电极、离子敏场效应晶体管、热敏电阻及微光 管等。除上述四种常用的信号转换器以外，随着科学技术的发展，基于新的物理响应原理 的生物传感器不断涌现，其中，一种声学传感器压电石英晶体( p q c ) 传感器，由于其 高质量灵敏性、响应快、使用简便等优点而在近几十年中得到了迅速的发展，成为生物传 感器领域中一个全新的方向。 l p q c 气相传感原理 1 9 5 9 年，s a u e r b r e y 1 3 推导出p q c 上物质沉积的质量敏感性的经验方程： f 一- - z f 拾m 一一c m( 1 ) a p 。p q 其中f 为检测到的频率飘移，单位为h z ；f 。为基本谐振频率，单位为h z ；m 为质量的 改变，单位为g ；a 为压电活性面积( 电极表面积) ，单位为c m 2 ；为石英的剪切模式，2 9 4 7 1 0 ”g c m ；“为石英密度，2 6 4 8 9 c m ；c 为质量敏感常数( 依应用晶体类型而 定) 单位为( 5 9 ) 。 s a u e r b r e y 的工作表明，加于p q c 上的薄膜可当作晶体的质量改变来处理。这个方 程构成了p q c 分析应用的基础。当分析物物理或化学吸附到p q c 表面时，它增加了晶体 的质量，这种质量的改变能被晶体谐振频率的相应改变所确认。只有在电极下的区域内才 具有压电活性，在裸石英上，质量敏感度几乎可以被忽略。并且，物质必须均匀沉积在 p q c 的整个压电活性区域，即电极表面。同时，对能加到p q c 上的质量也有一个限度。当 超过这个限度时，晶体将会停止振动。 从方程( 1 ) 中可看出测量的敏感度决定于p q c 的基频。质量灵敏度随p q c 基频增 一1 一 绪言 加而增加，基频则随p q c 厚度减小而增加。所以，增加灵敏度的一种途径就是构造更薄的 晶体以提高工作频率和敏感性。但是，微型化只能在物理限度内进行。在不影响装置耐用 性的情况下，其大小只能按有限地减小。最常用的晶体是5 1 5 m h z 的石英片，直径l o 1 6 m m 。对于基频为i o m h z 、电极表面积为0 2 2 c m 2 的石英晶体，在气相中的质量敏感度 大约为1 h z n g 。压电石英晶体在气相中的物质传感已是一门比较成熟的技术，现在正应 用于一系列广泛的科研和工程检测“。 。 2 p q c 液相传感原理 1 9 8 5 年，k a n a z a w a 和g o r d o n r “”报道了一个理论模型。这一模型把液层看作是加于 p q c 上的一层物质，并且，p q c 表面与液层之间不存在边界。通过考虑p q c 剪切波与传 播到液相中的阻尼剪切波之间的耦合，描述了液相中频率响应与p q c 被分析物溶液物理 特性之间的关系。通过用一面接触的p q c 与葡萄糖和乙醇溶液接触的实验证实了这个方 程的正确性，表明，液相中p q c 频率的变化随溶液牯度与密度的乘积而改变。 y a o 和z h o u 1 “发现溶液的电导也影响p q c 的频率响应。他们检测了石英晶体在与 4 7 种纯有机溶液、水与有机物的混合溶液和电解质溶液接触时的频率，给出了类似的与 粘度、密度有关的方程式，但引入了电介质常数和电导两个参数使方程式更为完整。 其它研究者发现频率还依赖于固一液相界面的性质，如石英晶体电极表面的亲水性和 憎水性电极一水界面的界面牯度等。t h o m p s o n 等i n 在实际工作中检测到由于键合产生 的频率增加。这一结果与前述所有描述物质加到p q c 表面的方程 s , 9 3 所预期的相反。他 们认为这一频率的增加与p q c 涂覆亲水和憎水界面之间的差异有关，由于亲水性影响了 交界处的粘度从而影响了频率。 总之，对p q c 在液相中传感的研究表明流体动力层的粘弹性和物质沉积两个因素都 会影响p q c 的频率响应。p q c 在液相介质中振动时，液层由于粘性阻力将随着p q c 的 振荡而移动。键合待测物到p q c 表面将改变界面的枯弹性，从而使得频率的整体改变将 与s a u e r b r e y 方程预测的不同。 3 压电石英晶体生物传感器 将压电效应应用于生物传感n n - - 般的方法是在压电石英晶体上固定一种能选择性 地与待测物质相互作用的物质。在大部分压电石英晶体生物传感器应用上，使用两种常用 的实验设计，每一种都是先把生物物质修饰到晶体表面，一种方法是在生物物质修饰上去 一2 一 湖南大学分析化学专业博士学位论文 整侵1 9 9 8 年6 其 之后，测量晶体干燥时的频率，然后将压电石英晶体浸入反应溶液中一段时间，使溶液里 的待铡物质与被修饰的生物物质结合。当反应物和修饰在压电石英晶体上的物质相互作 用时，能物理的或化学的吸附在压电石英晶体上，因此增加了总质量。然后将压电石英晶 体从溶液中取出，淋洗，干燥，通过测量振荡频率相应的变化可得到附加的质量。这种方法 的局限在于液相反应和气相干燥方法太繁琐，而且该法不提供实时数据。第二种方法弥补 了这些不足。它使用一个压电石英晶体流通器或检测池提供待测物结合到压电石英晶体 表面的时间过程的实时数据。分析在溶液中进行，压电石英晶体表面吸附分析物后界面 结构的粘弹性发生变化，这些变化通过振荡频率的降低来进行识别。 3 1 压电石英晶体生物传感器的修饰方法 在石英晶体的电极表面修饰上所需要的物质是生物传感器应用的关键问题。通常，有 四种基本的修饰方法将生物物质结合到压电石英晶体电极上或电极表面的惰性支持物 上0 2 “。第一种方法是利用戊二醛实现交联。第二种方法是通过硅烷或生物素抗生物素 蛋白实现共价键舍。第三种方法是利用凝胶或聚合物进行包埋。第四种方法是利用直接 的物理吸附。在许多情况下，可以联合使用这些方法。不管是哪种操作，都必须在修饰之 前清洗电极表面，以便除去任何可能干扰修饰过程的物质。 s h o n s 等n ”利用戊二醛交联修饰自蛋岛和7 一球蛋白研制了第一个压电石英晶体生 物传感器。随后，有许多的研究者利用交联方法n “”- 2 “，生物素和抗生物紊蛋白的化学键 合法”。“”3 ，硅烷层的共价键合法 2 6 - - 3 3 ，凝胶“。3 3 或聚合物n 3 “5 _ 2 “”弘3 的包埋法，或者是 蛋白a 上的键合修饰法o “”1 “”+ 3 6 3 分别研制成各种压电石英晶体生物传感器。所有这些 方法的不足之处在于：在分析物检测前，已在压电石英晶体上修饰了大量的物质。这样会 增加界面的粘度，降低灵敏度和或质量负载，使其可能接近压电石英晶体稳定振荡的极 限。 p r u s a k s o c h a c z e w s k i 和l u o n g 乜妇进行了多种自蛋白的测定，对用蛋白a 的修饰法 和用聚环乙亚胺层和戊二醛的变联法进行了比较，结果表明，在再生性方面，用蛋白a 修 饰法比用聚合物交联法好。k o n i g 和g r a t z e l n 6 - 2 “，s u r i 等m 3 和p l o m e r 等2 钉的工作分别 对三种修饰过程进行了比较，除上述两种方法外，还有一种是用硅烷层( a p t e s ) 和戊二 醛进行交联主要考察不同修饰方法对生物传感器的再生性的影响。k o n i g 和g r a t z e l 发 现测定人的t 一淋巴细胞”3 、红细胞1 ”。3 和粒性白细胞1 ”时，用聚合物交联法较好，分析 病毒和细菌用蛋白a 修饰较好 2 。同样，p l o m e r 等2 幻和s u r i 等叫3 独立地发现测胰岛 寒和肠肝菌用蛋白a 修饰最好。g u i l b a u h 等1 叼和p r u s a k s o c h a c z e w s k i 等2 钉应用了上述 一3 一 绪言 三种修饰方法以及生物素一抗生物索蛋白的键台方法检测了沙门氏菌。结果表明，用聚环 乙亚胺交联法最好，而用生物素一抗生物素蛋白修饰效果的较其它三种方法差。评价好坏 的主要因素是看能否经受苛刻的再生步骤。 此外，还有一种修饰方法是通过与晶体表面的电极直接键合而修饰到压电石英晶体 上。d a v i s 和l e a r y t ”3 尝试了将蛋白a 键合到金电极表面。结果表明金蛋白a 结合常数 为1 0 e m ，稳定性较高，其主要的结合力是范德华力。一般来说，蛋白质疏水性降低，吸附 于固体表面的能力也降低咖 。在d a v i s 和l e a f y 之后，又有很多的生物成分被直接修饰于 p q c 电极上，包括抗人血清白蛋白哪! ，人丙种球蛋白( 1 9 g ) n 州，羊的蓖麻子自蛋白抗 体，霍乱抗体“ ，一号疱疹单病毒3 和重组h i v 蛋白片断的特别抗体“3 。未经修饰 的p q c 也可用于监测细胞在晶片表面的键合过程“”“3 。目前，还没有一个通用的修饰标 准，这说明任何修饰方法，都需要通过实验来鉴定和证实。 3 2 液相反应和气相测量的p q c 生物传感器的应用 “液相反应和气相测量”方法的一般程序包括将一种选择性结合的生物物质键合到 p q c 表面，测量被修饰的p q c 和待分折物相互作用前后的频率。这样t 反应在溶液中进 行，但定量测定在气相中进行。在测频率前，用一步或多步清洗步骤洗去p q c 上没有特异 键台的物质以消除非特异性吸附的影响。修饰物和分析物之间的反应时间由测定条件和 分析物类型决定，清洗和干燥条件也随之变化。 s h o n s 等d 4 j 于1 9 7 2 年最先研制p q c 免疫传感器。他们在5 m h z 的p q c 上修饰白蛋 白或7 一球蛋白，然后浸入不同浓度的抗血清中测定抗体的活度。结果发现灵敏度相当于 或高于当前常规的测定方法被动凝集法。o l i v e i r a 和s l i v e r n ”于l9 8 0 年申请了一个 间接的、选择性测定抗原的专利。同年，r i c e s ”发明了一种鉴定抗体子代的方法。在此之 后，越来越多的研究者研制成各种p q c 生物传感器测定了白蛋白哪 、莠去津”5 “” 、人 转铁蛋白州、胰岛素汹 、可卡因” 、i g mc 执“1 和转铁酶“1 。 p q c 生物传感器也可用于检测和定量细胞。m u t a m a t s u 等【s ”最早进行压电微生物 的测定，对1 0 6 5 1 0 8 细胞m l 范围内的c a n d l d aa l b i c a n s 进行了测定。结果表明该方法 的选择性良好，和其它种类的酵母或抗原不起反应。随后，研究者用类似的方法分析了许 多细菌、病毒和细胞体，包括沙门氏菌“ ，李司忒氏菌“ ，肠杆菌2 “，粒性白细胞”3 ，人 t 一淋巴细胞1 引，人红细胞1 8 2 。1 ，对腹泻1 7 、疱疹病毒锄 、霍乱2 3 起作用的病毒和细菌等。 利用“液相反应和气相测量”方法还可进行d n a 杂交研究d 0 。2 3 “5 “。f a w c e t t 等r “于 1 9 8 8 年最早通过苯乙烯和丙烯酸的共聚物将合成的寡核苷酸共价键合到p q c 表面，然 一4 湖南大学分析化学专业博士学位论文 楚霞 后加2 0 - 1 聚乙烯醇到p q c 表面来测定质量和频率的关系。尽管用他们这种方法来进行 定量还有疑问，但确实表明p q c 生物传感器可鉴定d n a 杂交。后来，c a m p b e l l 等“”将 聚合( a ) 修饰于p q c 上，然后与聚合( u ) 进行杂交，通过变性步骤展示了传感器的再生 性。w u 等口卵发展了另一种d n a 探针的固定方法。他们将晶体电极作为正电极，负电荷 的d n a 磷酸骨架被正电极吸引到电极表面，然后，用紫外线照射p q c 使d n a 探针共价 结合于p q c 表面。 液相反应和气相测量的压电传感技术的优点在于：一些情况下频率信号能用s a u e r b r e y 公式来解释，尽管该法对由于水化、湿度和溶剂保留等原因的误差较为敏感。但是， 分析过程的繁琐和耗时使得液相反应和气相测量的方法不可能成为常规的分析方法。 3 3 液相p q c 生物传感器的应用 r o e d e r e r 和b a s t i a a n s ”3 最早提出液相压电免疫测定，用修饰了羊抗人l g g 抗体的 表面声渡( s a w ) 装置对0 0 2 2 5 2 2 5 m g m l 浓度范围内的k g 进行了测定。m u r a t s u g u 等 s 9 3 对浓度为0 1 1 0 0 p g m i 的人血清白聋白进行了浏定，他们建议用这种方法检测尿 中的白蛋白。c a r t e r 等“3 测定了低至0 5 p g 1 的蓖麻子白蛋白的浓度。 p q c 响应和溶液密度与粘度的关系被用来传感凝集作用。m u r a m a t s u 等o ”通过监 测鲎属纤维蛋白原溶解产物的凝集作用测定内毒素浓度。k u r o s a w a 等“o 一利用抗原和带 有抗体的胶乳发生凝集作用导致溶液的枯度和密度发生变化测定了c 一反应蛋白。m u r a t s u g u 等“”利用凝集作用测定了抗链球菌0 抗体。他们用频率对时间变化的一阶导数与 分析物浓度作图，从而大大提高了方法的灵敏度。g h o u c h i a n 和k a m o 6 2 3 分析了胶乳测定 中电极一溶液界面性质的影响，发现p q c 界面变化很大程度上由粘度变化引起。c h u 等口”发展了种和胶乳测定相似的方法，通过一种聚合物来测定补体第三成分，同样是 基于分析溶液的粘度变化。 m u r a m a l s u 等“”对l 舻1 0 8 细胞m l 范围内的e c o l i 进行了测定，为了放大信号， 在反应混合溶液中加入了用抗一e c o l i 抗体修饰的聚苯乙烯微粒，在e c o