（微生物学专业论文）微紫青霉菌株gxcr的生物浸矿可行性研究.pdf

u li iiir lii i i ii ii ir ll y 18 17 3 6 9 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 橱礞 j岬年6 月日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：烈啜 卜 导师签名：冬j 书冬产6 月岁日 微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 摘要 微紫青霉菌菌株( p e n i c i l l i u m j a n t h i n e l l u m ) g x c r 高抗多种重金属盐( 包 括铜在内) ，能产生多样的有机酸有效地溶解金属，具有潜在的浸矿能力。 本研究主要利用正交设计试验进行g x c r 菌株生物浸矿试验，以寻找可行 而又经济的能从低品位氧化矿石中回收金属的生物浸矿技术。 浸出试验采用摇浸和堆浸方式对各种浸出过程参数进行优化。如培养 液起始p h ，矿浆密度，矿石粒度，初始接种量。 培养液最适碳源都为蔗糖，最适氮源硝酸钠，最适碳源浓度为1 0 ， 通过单因素试验得出最佳发酵培养液起始p h 6 ，最佳发酵矿浆密度5 ，最 佳初始接种量1 o m l 张l 子液( 浓度为3 0 x 1 0 7 个m l ) ，最佳矿石粒度摇浸为 2 0 0 目，堆浸为 2 0 0 目。 在单因素试验中，2 0 天后摇浸和堆浸铜的浸出率分别可达到7 9 9 8 和 1 9 2 9 。正交试验优化条件分别得出最佳发酵条件组合是：摇浸为培养液 起始p h6 0 ，矿浆密度5 ，矿石粒度2 0 0 目，初始接种量1 0 m l 孢子液( 浓 度为3 0 x 1 0 7 个m l ) ，3 2 c ，恒温摇床1 2 0 r p m t 发酵2 0 天，结果最高浸出率 可达到8 7 3 1 。堆浸为培养液起始p h6 0 ，矿浆密度5 ，矿石粒度 5 5 c ) t l l l 。如近几年来从含硫丰 富的酸性热泉水中分离出的酸热硫化叶片菌、嗜酸热硫球菌以及嗜热嗜酸酸杆 菌，它们可在较高的温度下用于硫化矿的酸性浸出。 另外，h a r r i s o n 等人研究了其它相关酸性菌株的特性及各个浸矿菌株混合使 用的效果，认为由于各个菌株对铁离子、元素s 及其它金属离子的作用不同，菌 株混合使用具有优势互补作用。 目前对进行生物浸矿菌种的研究主要还是集中在细菌。而且大部分细菌都在 通过将元素s 和某些还原态的硫化物氧化成s 0 4 2 并从中获得能量，将浸出液中的 f e 2 + 氧化成f e 3 + ，从而获得f e 3 + 盐进行生物浸出中所需的氧化剂。 6 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 尽管如此，但生物浸矿是一个复杂的过程，化学氧化、生物氧化与原电池反 应同时发生。人们对微生物在矿物浸出中的特殊作用的解释各不相同，至今也还 未完全搞清楚，一般认为有以下一些机理【1 2 1 。 微生物的“直接作用 和“间接作用 1 1 】，同时还具有原电池效应及其它化 学作用。在微生物浸矿过程中，微生物吸附于矿物表面通过蛋白分泌物或其他代 谢产物将硫化矿直接氧化分解的作用称为“直接作用 ，如细菌浸出的“直接作 用反应式【1 3 】如下： 细菌 2 f e s 2 + 7 5 0 2 + h 2 0 一f e 2 ( s 0 4 ) 3 + h 2 s 0 4 细菌 f e a s s + 3 5 0 2 + h 2 0 一f e a s 0 4 + h 2 s 0 4 ，到目前为止，微生物在矿物表面的作用尚不十分清楚。科学家们不断在这一 方面进行研究，进而能证实直接作用在生物浸矿中有重要作用。e s c o b a r ( 1 9 8 1 ) 等人1 1 4 1 应用放射学方法，针对不同菌种，研究这些菌种在硫化矿物表面的吸附行 为，但由于浸出体系中干扰的复杂性，并未获得满意结果。有研究细菌在硫化矿 物表面的行为l l5 ，1 6 】并定性地提出了细菌作用模型，此模型展现了细菌在晶体表面 可能的作用为充当电子从矿物表面阴极区到0 2 的催化导体。研究工作者采取了多 种方法对细菌在硫化矿表面吸附的研究，证明了细菌在矿物表面的吸附及吸附特 征，就有可能说明细菌浸矿的直接作用。其中k a r a n ( 1 9 9 6 ) 【1 7 l 等人应用1 4 c 蛋 白质固定，p o g l a z o v a 等人【l8 】运用光谱荧光分析等不同技术手段，希望通过测定 溶液中及吸附于矿物表面上t f 菌的数量来说明细菌在浸矿中的作用，研究证实 了t f 菌在矿物表面确有吸附。在吸附特征得到证实后，研究者【1 9 】应用扫描电镜 研究又得到一个重要的结果，即细菌在矿物上的吸附较多吸附于晶体表面的离子 镶布点、位错点上，使矿物表面形成腐蚀点1 1 0 1 。因而，微生物吸附至矿物表面是 生物浸出过程的最重要的环节，也是通过直接作用机理浸出矿物的先决条件【1 2 们。 “间接作用 则指，对于大多硫化矿，微生物将硫化矿物氧化过程产生的及 其它存在于浸出体系的亚铁离子氧化成三价铁离子，产生的高铁离子具有强氧化 作用，其再对硫化矿进一步氧化，硫化矿物便氧化析出有价金属及铁离子，铁离 子被催化氧化，如此反复。如细菌浸出的“间接作用 ，其利用铁细菌和硫细菌 7 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 的代谢物( 硫酸高铁和硫酸) 与金属硫化物起氧化还原反应，硫酸高铁被还原为硫 酸亚铁或产生元素硫，金属则成硫酸盐形成溶解，而亚铁又被氧化成高铁，元素 硫被细菌氧化成硫酸，从而形成了一个氧化还原的浸出循环体系。反应式如下： 细菌 2 f e s 0 4 + h 2 s 0 4 + o 5 0 2 _ 哼f e 2 ( s 0 4 ) 3 + h 2 0 f e s 2 + f e 2 ( s 0 4 ) 3 一3 f e s 0 4 + 2 s o 2 f e a s s + 2 f e 2 ( s 0 4 ) 3 + 1 5 0 2 + 3 h 2 0 6 f e s 0 4 + 2 h 3 a s 0 4 + 2 s o 那么对于氧化矿物来说，其含硫较硫化矿少，则大大影响了硫化细菌对其的 浸出。 在矿物浸出体系中所涉及到的微生物种类是多种多样的，除了化能自养菌， 还有异养菌和真菌圈，甚至还有原生动物的存在【6 】。 关于真菌应用于生物浸矿的研究报道较少，其相应的机制也还不是很清楚。 目前可能机制与其吸附矿物可能存在直接作用和产生大量代谢产物有机酸 【2 l 】能有效溶解金属相关。因此大多研究者希望通过了解真菌的有机酸代谢机制， 及提高其有机酸产量以达到也能将之应用于生物浸矿。那么关于代谢产物有 机酸的研究较多，有研究者称真菌代谢产生有机酸的过程为真菌溢出代谢，即真 菌在含充足碳源培养基上少量的碳源被用来合成蛋白质( 信息前体和能量) ，在这 样的形势下，部分多余的碳源被氧化成二氧化碳和部分通过分泌中间体的形式被 溢出。真菌溢出代谢的生物技术应用最重要的是通过用黑曲霉生产柠檬酸产品。 真菌溢出代谢的有机酸大多为三羧酸循环中间产物，而三羧酸循环中间产物的分 泌发生在每一个生长在高碳氮比培养基的真菌菌丝体菌落【2 2 。2 7 】。 1 2 5 生物浸矿研究方向 生物浸矿在冶金工业中的重要地位越来越凸显，它说明了生物工程应用于矿 物加工具有重要意义，目前对这方面的研究及商业化应用方向主要有： 一方面在研究方向上：对菌种还要进行改良，主要是对耐受极端条件的微生 物选育；基因工程菌的构建；机理上对生物浸出机理还需要进一步的研究；开发 8 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 出低浓度溶液中镍、钴等金属的提取新技术，地下生物溶浸技术，还有高效反应 器的研制；浸出过程的优化与控制；对能运用于生物浸矿的多种多样的微生物进 行研究，如异养菌，真菌浸矿的研究。 另一方面，商业化应用方向：现今已经进行中试的要加快投产步伐，黄铜矿 搅拌浸；硫化镍矿生物提取；硫化锌矿生物提取等。 1 3 生物浸矿研究现状 最初的生物浸矿研究还是沿着c o l m e r 和h i n l d e 的发现进行研究，研究者通过 分离、驯化所得的氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌等菌株，将其有目的地运用于 矿山污水处理、煤炭脱硫以及从硫化矿中提取金属等领域。研究进行到现在研究 者们已经不在局限于研究氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌，自然界中还存在有大 量在冶金方向有巨大应用潜力的菌种，所以对这方面的研究工作已经拓展到各种 各样的能用于进行生物浸矿的微生物。 硫化细菌浸矿机理上，主要是硫的氧化和f e ”的生成，对于含硫较多的硫化 矿使用效果极佳，但是对于含硫较少的矿物如氧化矿等，其浸出效果则欠佳。因 此，除了研究用硫杆菌浸出硫化矿外，还研究采用的异养真菌浸出。异养真菌生 长产生的代谢产物有机酸能有效地溶解金属。两类菌的浸矿机制上有相似也 有不同的。硫化细菌等细菌和异养真菌浸矿都存在一样的直接作用，只是在浸矿 过程中是否为主要作用不同，而且它们间接作用也稍有不同，细菌的间接作用是 大部分细菌都在通过将元素s 和某些还原态的硫化物氧化成s o ? 。并从中获得能 量，将浸出液中的f e 2 + 氧化成f e 3 + ，从而获得f e 3 + 盐进行生物浸出中所需的氧 化剂。但是异养真菌是溢出代谢其代谢产物为浸矿有用成分，例如被释放进入培 养媒介的产生能与重金属螯合为水溶复合物的有机酸2 8 ，2 9 1 。复合形成的草酸复合 物能有效溶解金属，例如铝、铜、铁、锂和锰等。对在这方面具有潜在浸矿能力 的菌的研究不多，主要集中在青霉菌，曲霉菌和根霉菌。在青霉菌一个可诱导柠 檬酸盐吸收系统特征研究中，结果表明青霉菌在没有碳源存在时，能利用有机酸 与重金属形成的金属盐做为单一碳源【3 0 0 2 1 。k w a c k ，e r r e c f l d e 等研究表明柠檬酸 盐除了可以做为真菌生长利用的单一碳源外，其与各种重金属结合形成的金属复 合物会降低重金属离子的毒性，还可以帮助真菌对金属离子的吸收1 3 0 1 。有研究为 9 广西大学硕士学位论文微紫青霉茵菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 了给生物湿法冶金过程生产大量的草酸，优化黑曲霉( 一种能生产草酸广为所知 的真菌) 产草酸。如果以在同一批控s f j p h 为6 0 时有2 1 个摇瓶反应器来计算，黑 曲霉能分泌4 2 7m m o l l 以的草酸。对于该菌蔗糖和乳糖为产生草酸适合碳源。在 蔗糖培养基中，黑曲霉产生大量的葡( 萄) 糖酸和草酸，而在含有乳糖的培养基中 只产生草酸。在糖蜜和糖浆培养基中菌体生长旺盛，但产生草酸很少( q 0 m m o l l - ) 【3 3 1 。目前研究从低品位黄铜矿生物浸出使用的2 6 种分离的嗜酸真菌已 经被报导。大部分这些真菌菌株属于曲霉菌属、青霉菌属和根霉菌属。来自这些 菌中，有分离到的4 株展示了重要的生物浸出活力，浸出实验是采用c z a p e k 培养 基含l 矿石( 1 0 0 目) 在室温下摇浸2 0 天。观察发现用a s p e r g i l l u s f l a v u s ( d s f 8 ) 和a s p e r g i l l u sn i g e r ( d o f - 1 ) 的浸出铜值达( 7 8m g l ) 。进行优化生物浸出的营养 和环境条件的研究以利于其能应用于工业。目前还有研究表明在生物浸出铜中那 些从低品位的矿石中分离来的嗜酸真菌也是有应用价值的 4 1 。t i m n a ( 含有1 1 碳酸铜、硅酸铜) 和其他金属氧化物的铜矿石浸出实验证实异养微生物代谢产物 有机酸是作为浸出金属活跃成分。在含1 4 蔗糖的发酵培养基上黑曲霉的表面培 养在浸出两个星期后从1 0 的悬浮液总的铜浸出率达8 7 3 。在工业垃圾产品亚 硫酸盐纸浆废液黑曲霉在四个星期内溶解铜7 3 8 的。发现在过滤的含蔗糖1 4 的培养基溶液中的铜高达1 7 8 0 p p m 。在用含有蔗糖7 的海水培养基做浸出实验时 只有6 8 4 p p m 铜溶解。四个星期用含有乳清的乳酸杆菌浸出时总铜的产率为 8 3 4 【3 4 1 。同样一株能分泌柠檬酸盐已经被用在从工业废水和矿石中浸出重金属 的菌p e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u m1 3 5 】，应用该菌进行实验，实验表明有各种有机酸 生成，而的柠檬酸分泌是一个能量溢出的过程，这个过程要避免合成太多的 n a d h 或是a t p ，葡萄糖是与p e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u m 溢出代谢相关最重要的因 素，但是有氧与生长量无关。增加碳源浓度和能量源能够增加中间体的分泌【3 引。 因为大量的重要金属主要存在于低品位矿石和矿山残渣中，c a t h e r i n en m u l l i g a n 等应用a s p e r g i l l u sn i g e r 进行生物浸矿试验，主要是为了找到可行而又经 济的用微生物从氧化低品位矿石中回收金属的技术。研究结果表明a s p e r g i l l u s n i g e r 有很好的潜力产生大量的有机酸，这些有机酸能高效的浸出金属。在实验室 相同条件下，前者采用不同浓度的草酸与柠檬酸对矿石( 含铜0 7 2 4 5 ，铁 2 6 4 7 0 ，锌0 0 2 0 1 和镍0 0 0 2 7 ) 进行化学浸出( 摇浸4 8 d 时) ；后者在不同 1 0 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 碳源条件下应用a s p e r g i l l u sn i g e ，进行生物浸矿研究( 摇浸1 4 天) ，结果后者浸出 率高，最大的浸出率分别为铜6 8 ，锌4 6 ，镍3 4 ，铁7 。另外，还表明柠檬 酸对铜的浸出效果较为明显【3 9 1 。同样特泽费司p g 采用黑曲霉菌和青霉菌从希腊 低品位红土矿( 主要由含镍的绿泥石组成，n i 的含量为0 7 3 ) 中浸出镍。试验 采用两种浸出方式，一是直接浸出，在有微生物存在的条件下直接浸出；另外一 种是化学浸出，在3 0 下培养微生物，然后将发酵代谢物在9 5 下进行化学浸出。 浸出5 0 d ，第一种方式下镍的浸出率达到5 5 6 0 ；第二种方式下浸出率达到 7 0 - 7 2 。 还可以利用曲霉菌、青霉菌等的真菌直接吸附铜、金等贵金属，目前仍还有 大量研究者致力于生物浸矿的研究，这个方向的研究也是很有研究价值的。 1 4 影响生物浸出的因素 生物浸出过程与微生物生理及生长环境相关，生物浸出速度也直接与这些因 素相关，对于浸出的影响参数例如：矿浆密度( 矿石浓度) ，矿石粒度( 颗粒尺 寸) ，培养液起始p h ，初始接种量( 接种浓度) 等删。 1 4 1 营养因子 d i b b l e l 4 1 j 等人的研究表明，当c ：n 比为6 0 ：l ，c ：p 比为8 0 0 ：l ，c ：k 比 为4 0 0 1 时微生物的降解率最高。m a r t i ng a l l m e t z e ra n dw 0 l f g a n gb u r g s t a l l e r 认为 浸出液中磷酸盐浓度是浸出速率的限制因烈2 6 , 3 2 1 ；而氮源浓度为总浸出率的限制 因素 4 2 j 。对于研究利用异养真菌代谢产物有机酸进行浸矿，那么我们就要考 虑添加有利于其提高其代谢产物的营养因子。m a r t i ng a l l m e t z e ra n dw o l f g a n g b u r g s t a l l e r 对真菌产生有机酸系统进行研究表明，三羧酸循环中间产物的分泌发 生在每一个生长在高碳氮比培养基的真菌菌丝体菌落 2 2 。2 6 】。p e n i c i l l i u m s i m p l i c i s s i m u m 是一株能分泌柠檬酸盐已经被用在从工业废水和矿石中浸出重金 属【3 5 1 ，对其研究还表明增加碳源浓度和能量源能够增加中间体的分泌。 保持较高的微生物生长速度，对提高生物浸出率十分有利，因此，要保持微 生物较高的生物生长量要应该适当的提供微生物生长所必需的足够营养，同时 还要适量添加微生物生长所需的氮源及磷酸盐等营养物质1 4 3 , 4 4 】。 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 1 4 2 氧 目前对于金属以氧化物形式存在的矿石，应用的大部分为好氧微生物进行生 物浸出有价金属【4 5 1 ，那么保持提供充足的0 2 和c 0 2 ，则是保证和提高浸出率的 前提条件m 4 7 1 。 1 4 3 矿浆密度 在采用连续摇浸浸出时矿浆密度对浸出速率有一定地影响。提高矿浆密度虽 可增大装料量提高一次浸出率，缩短浸出时间，但超过一定限度时，当浸出溶液 中某些金属离子的不断积累可能超过微生物的极限耐受浓度，会影响微生物的生 长及活性，反而影响浸出率。另外，增大矿浆密度会使得吸附于单位矿粒表面上 的微生物数目减少，一方面，在机械搅拌时，虽然矿粒间的相互摩擦及碰撞的加 剧有利于矿料反应表面的不断更新，但是也使吸附于矿粒表面的微生物损伤或脱 落，这样反而会降低生物浸出速度。因此矿浆密度常控制在1 0 2 0 。在个别情 况下最多含3 0 固体【4 7 , 4 8 。另一方面，根据反应动力学，矿石粒度愈细反应速度 愈快，还可以起到机械活化的作用【8 l 。 1 4 4 矿石粒度 虽然根据矿物表面的暴露程度及其氧化反应动力学，理论上矿石粒度细小有 利于浸出速度，还可以使浸出程度更加完全，但实际上过细的矿石会产生两个不 利的影响，一是经济上，增大磨矿费用；二是浸出过程中，产生细泥。后者细泥 将粘附矿石和微生物，阻碍矿石和微生物直接接触也即影响微生物对矿石的直接 作用，从而使浸出速度下降【4 7 4 8 1 。还有c h o n gn 等研究也表明矿石越细其间会 增加矿石间摩擦力会对生物浸出过程产生影响。矿石越细其还会消耗矿石氧化还 原的能量，从而不利于浸出。 另对黄铜矿、黄铁矿浸出试验指出，在这些参数中，矿石粒度影响最大，当 粒度小于1 1 9 m m 时，随着粒度增大，矿物表面微生物吸附数量增加，浸出率会 明显提高，认为是细菌吸附点变化所致【1 0 矧。 浸出一般都是在矿石颗粒表面进行，那么参与反应表面积直接影响生物浸出 1 2 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 的速率。矿石的料度细小，使表面积增加，导致了表面能的增加，并且颗粒间的 引力也随之增加，容易集结成块【5 l 】，使得矿物表面微生物吸附数量减少，影响到 微生物对矿石的浸出。 1 4 5 培养液起始p h 研究表b 刃 5 2 , 5 3 】，金属浸出过程无论什么类型的矿石，培养液起始p h 对其浸 出有一定的影响，但是对于其研究的氧化硫硫杆菌培养液起始p h 不用进行调节。 但是对于利用真菌如黑曲霉和根霉进行生物浸矿其培养液起始p h 对菌分泌 产生的有机酸的积累有很大影响。有机酸的积累相应地也对金属浸出有影响 瞰，5 5 1 。要选择最适宜的培养液起始p h 能有效提高浸出率。 反映浸出过程的两个重要参数是酸耗与浸出率。酸耗反映的是浸出过程中为 维持微生物的最佳生长条件及浸出金属而消耗的酸量，浸出率则是反映浸出过程 的回收率。对于各种硫杆菌都有其最适合的p h 范围，氧化亚铁硫杆菌最适合的 p h 值为l 3 ，p h 值不仅影响微生物生长繁殖及活性，而且p h 值过高时，f e 3 + 会 以不同形式沉淀，这就使f e 2 + 将减少，不利于微生物的生长 5 1 , 5 6 。此外，f e 3 + 形 成的沉淀附着在矿石表面，也将妨碍微生物与矿石接触，降低浸出速度，故要控 制溶液p h 5 7 】。而就异养真菌类微生物应用其进行浸矿主要是应用其代谢产生的 有机酸对矿物作用，所以对于培养p h 也要进行控制，要利于其生长过程中产生 有机酸【5 8 , 5 9 】。 1 4 6 初始接种量 生物浸出速度与微生物浓度及其活性直接相关。为了保证生物浸出有效进 行，要在浸出过程中创造有利于微生物生长繁殖和保持活性的条件【5 9 】。单位体积 内细菌数量的多少直接影响浸出过程进行的速率，特别表现在浸出的初始阶段 删。但是相差l 2 倍的接种量并不会导致矿浆中微生物浓度产生数量级别的差 别，所以对浸出的影响小。而且单位体积溶液中的生物量是有极限的，因此接种 量的差距会在微生物适应环境后逐渐消失。因此接种量对于浸出率的影响是不显 著的【5 1 1 。 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌茵株g x c r 的生物浸矿可行性研究 1 5 生物浸矿方式 1 5 1 摇浸 摇浸又称为( 摇瓶发酵) ，一般在实验室研究生物浸出时大多采用恒温连续培 养，因为在恒温连续培养技术中生长率可以在一个依靠其他参数可控制的条件下 被改变【6 1 , 6 2 1 。氧气与生长关系密切。在实验室则通过摇床振动，使空气中的氧气 不断溶入培养液为其生长提供氧气，摇床转速越大，液体中氧气交换频率越耐删。 因此，在一定程度上采用摇浸为我们研究生物浸矿提供了方便。工业上，还没有 适合的反应器皿能采取此种浸出方式。所以在生物浸出反应器皿上也有许多相关 研究。但是工业上采用此种方式进行生物浸出要消耗大量电能，并不是经济的浸 出方式，只能应用于实验室进行相关研究。 1 5 2 堆浸 中国是世界上最早采用生物冶金技术的国家，而且堆浸在当时就是生产铜的 普遍做法。出于环保因素，实际应用中多采用堆浸的方式，但是堆浸中各种因素 将大大影响到微生物的浸出。最好采用的菌种是针对相应的矿进行相应的驯化。 堆浸的过程是：堆于不透水的坡地( 便于溶液自动流入集液池，将开采的矿 石或破碎至一定粒度的矿石堆成堆，一般堆成具有自然休止角的截头锥形。) ； 再生浸出液喷洒到矿堆顶部；溶液流经矿堆而发生生物浸出反应；经堆底斜坡流 至集液池：浸出后溶液被送往金属回收系统；提取后的废液在再生池中充气和补 加原料中不足的氮、磷、钾盐( 以便f e 2 + 氧化为f e 3 + 及细菌生长繁殖) ；然后返 回浸出作业，形成闭路循环【6 】。此法可用于处理未破碎或粗碎的含铜废矿、尾矿 及贫矿，每堆矿量达1 0 4 t 1 0 8 t 。 堆浸还可用于低铜表外矿、废矿石的浸出。目前采用这种浸出方式的大型湿 法炼铜厂约十几个，大多集中在北美和南美。我国己投产的德兴铜矿湿法炼铜厂 也是一个典型的细菌堆浸一萃取一电积厂【6 3 】。 1 6 生物浸矿的特点 生物浸矿工艺具有如下特点： 1 4 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 1 6 1 优点 首先，应用于预处理难浸金矿具有以下优点： ( 1 ) 操作简单； ( 2 ) 设备建造时间短，费用及生产成本低，它只需对矿石进行部分氧化即 可以保证较高的氰化提金率，这主要是微生物对富金的砷黄铁矿的选择性氧化， 例如y o u a n m i 矿只需氧化8 2 的a s 和1 4 的s 就可达9 5 以上的金氰化浸出率： ( 3 ) 可直接回收贱金属，金回收率较高，一般大于9 0 ： ( 4 ) 难浸矿石在生物氧化过程中，不污染环境。 由于以上优点，生物氧化就由一种被认为只能从低品位矿石或废矿坑中回收 铜的一般技术一跃成为激动人心的生产工艺。 其次，应用微生物浸矿，其反应温和，环境友好，能耗低，流程短，这些优 势在矿石日益贫杂及环境问题日益突出的今天，微生物浸矿技术将是有效的金属 元素提取、环境保护及废物利用的手段。近年来，国外对该技术的研究已成为冶 矿领域热点，并在铜、金等金属的提取上也获得工业应用。 总的来说：低成本，低能耗，低药剂消耗和劳动力需求；工艺流程短，设 备简单，易于建筑，资金消耗小：资源利用范围广，能使更多不同种类及低品 位矿物( 特别是那些传统选矿方法无法处理或经济上不合算的矿产资源，还有那 些特贫，特细或有用成分被包裹的矿石) 得到有效、经济的利用；无废气，一定 程度上可认为无废物、无废水排放，同时不污染环境，增加生产安全性，这在现 今对环保要求日益重视的情况下，是常规方法无法比拟的【硎。 1 6 2 缺点 目前大多对硫化矿、氧化矿物的异养菌生物浸矿研究还只处于实验室研究阶 段，主要是因为：一是浸出时间过长，一般在1 0 天以上；二是异养真菌的生长 条件温和，不耐高温，且很容易受到杂菌的污染，影响浸出效果；三是由于如硅 酸盐细菌等微生物生长培育需要葡萄糖、蔗糖等有机养分，在工业生产中会造成 成本过高，还难以形成实用规模的处理工程；四是微生物的处理能力受环境影响 大，菌种的一些优良特性难以长久保持，容易退化，必须不定期更换菌种或是驯 化菌种再使用才能保持高的生产率；五是实验室条件下的微生物，在实际处理时 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌茵株g x c r 的生物浸矿可行性研究 生存和繁殖难以稳定。因此必须筛选出具有工业应用价值的更高效菌株，优化设 计最佳浸出工艺，缩短浸出时间，减少杂菌污染，提高浸矿效果【6 1 。 1 7 本研究工作的目的、意义 综上所述，从微生物浸矿机制的角度，除氧化亚铁硫杆菌等硫化细菌能浸出 金属硫化矿外，能产生有机酸的真菌，这种微生物在自然界中广泛存在，且易于 培养，在以有机碳( 葡萄糖、蔗糖等) 为能源的培养基中生长时，能产生大量的有 机酸( 主要是柠檬酸和草酸) ，这些有机酸在浸矿过程中具有双重功效：一方面提 供酸解矿物的旷，另一方面由于具有较强的鳌合作用而与金属形成络合物，加 速矿物的溶解。因此可被用来浸出矿物。因而，异养真菌也具有一定的浸矿能力， 其在微生物浸矿方面的应用研究还是很有价值的。异养真菌生长过程中产生的大 量有机酸能有效的浸出矿物中的有价金属，生物浸矿过程一定程度上认为是无废 物、无废水排放，同时不污染环境，增加生产安全性等优点，本研究的目的是用 本实验室从矿山排水沟污泥中分离得到的微紫青霉菌( p e n i c i l l i u m j a n t h i n e l l u m ) g x c r ( 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号： c g m c c1 0 2 7 ) 进行生物浸矿的可行性研究( 主要针对铜矿) ，该菌是一株高抗 c u s 0 4 的菌株并表现出高水平( 2 0 0 m m c u s 0 4 ) 的耐受性的，同时兼具对多种有 毒重金属盐的高水平的抗耐受性。该菌具有很强的在多种有毒重金属盐环境中的 适应和生存能力【6 5 1 。其还具有生物浸矿能力。研究该菌的浸矿发酵条件；研究该 菌对铜矿石铜的浸出率效果；以及对该菌的浸矿机理进行初步研究和分析。这个 方向的研究是很有研究价值的。虽然到目前研究为止其浸出率还比不上细菌对矿 石有价金属的浸出，但是如果对有生物浸矿能力有机酸产量较大的菌种发酵条件 进行进一步的研究优化，提高其有机酸产量，不久也能应用于工业上。我国同时 又有大量的低品位矿产资源急需开发利用，所以在我国不仅仅要加强细菌浸矿的 研究，还要不断开发出能应用于这方面的菌种，要多样化。这对于我国低品位矿 产资源如铜矿等的综合利用有重要的现实意义。 1 6 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 2 1 材料 2 1 1 样品 第二章材料与方法 本实验所使用的铜矿石样品来自广西德保铜矿山。 2 1 2 菌株 本研究所使用的菌株： 菌种来自本实验室筛选出的一株可在含2 0 0 m m c u s 0 4 的p d a 培养基上生长 的微紫青霉菌( p e n i c i l l i u m j a n t h i n e l l u m ) g x c r ( 中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏号：c g m c c1 0 2 7 ) 。 微紫青霉菌( p e h f c 嬲“m j 绷f j f l f 玎p z ，“坍) g x c r 孢子液制备： 制备含c u 2 的p d a 平板，接入微紫青霉菌g x c r 茵丝体或孢子液，置 于3 2 c 培养箱中静置培养7 天。用2 0 m l 的4 0 甘油从平板上洗涤孢子，转入 装有玻璃珠的三角瓶剧烈震荡5 分钟，用少量灭菌脱脂棉过滤孢子液，将菌丝体 除去，用微生物显微镜直接计数法 6 6 1 计算孢子液浓度，再将其浓度稀释至3 0 x10 7 个m l ，分装入1 5 m l e p 管中，4 冰箱保存备用。 2 1 3 培养液 p d l 培养液的配制( 1 0 0 0 m l ) ： 葡萄糖l o g t 马铃薯汁1 0 0 0 m l ( 马铃薯汁制备方法：将马铃薯去皮洗净， 切成小片，放在水中煮沸2 0 m i n ，用四层纱布过滤，滤液加水至原来的体积， 自然p h ) 注：( 煮时马铃薯：水- l ：5 ) 1 7 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌茵株g x c r 的生物浸矿可行性研究 p d a 培养基的配制： p d l 中加入1 5 琼脂粉( w n ) t r a c ee l e m e n ts o l u t i o n 配制： h 3 8 0 33 0 m g ：m n c l 2 4 h 2 02 0 m g ：z n c l 22 0 0 m g ( 若为z n s 0 4 。7 h 2 04 2 2 8 5 m g ) ) n a 2 m 0 0 4 2 h 2 02 0 m g ；f e c l 2 5 h 2 02 0 0 m g ( 若为f e s 0 4 7 h 2 02 8 0 r a g ) ； c u s 0 4 5 h 2 02 0 0 m g ；定容至5 0 0 m l 产酸真菌( 查氏) 培养液( 10 0 0 m l ) - 产酸真菌( 查氏) 培养液( 1 ) ：n a n 0 31 5 9 ：k 2 h p 0 40 5 9 ：m g s 0 40 2 5 9 ：f e s 0 4 o o lg ；k c l0 0 2 5 9 ：t r a c ee l e m e n t 产酸真菌( 查氏) 培养液( 2 ) ：k 2 h p 0 40 5 9 ；m g s 0 40 2 5 9 ；f e s 0 4o o l g ； k c l0 0 2 5 9 ；蔗糖1 0 0 0 9 ；t r a c ee l e m e n t 产酸真菌( 查氏) 培养液( 3 ) ：n a n 0 31 5 9 ；k 2 h p 0 40 5 9 ：m g s 0 40 2 5 9 ：f e s 0 4 o o l g ；k c l0 0 2 5 9 ；蔗糖1 0 0 0 9 ：t r a c ee l e m e n t 本实验所用培养液1 0 k g c m 2 磅湿热灭菌3 0 分钟。 2 4 溶液与缓冲液 ( 1 + 1 ) 氨水( 5 0 0 m l ) - 准确量取2 5 0 m l 2 5 氨水及2 5 0 m l 蒸馏水，将两者倒入5 0 0 m l 容量瓶混匀。 ( 1 + 1 ) h a c ( 5 0 0 m l ) ： 准确量取2 5 0 m l 冰醋酸及2 5 0 m l 蒸馏水，将两者倒入5 0 0 m l 容量瓶混匀。 2 0 0g l 以k i 溶液： 准确称取1 0 0 9 固体k i ，用蒸馏水定容至5 0 0 m l 。 5 9 l d 淀粉指示剂： 准确称取0 5 9 固体k i ，用蒸馏水定容至1 0 0 m l 。 5 的盐酸羟胺： 准确称取1 o g 固体盐酸羟胺，加入约l m l 无水乙醇溶解，再用蒸馏水定容 至2 0 m l 。 注：每周新配制使用 1 8 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 5 0 醋酸钠： 准确称取1 3 6 0 8 9 三水醋酸钠，用蒸馏水定容至1 0 0 m l 。 0 1 m o l l 1 n a 2 s 2 0 3 标准溶液： 准确称取1 3 9 固体n a 2 $ 2 0 3 5 h 2 0 ，放入2 0 m l 新煮沸并冷至室温的蒸馏水中 溶解，加入0 1 9 固体n a 2 c 0 3 ，转入5 0 0 m l 容量瓶中用新煮沸并冷至室温的蒸馏 水定容至5 0 0 m l ，混匀后倒入洁净的棕色瓶中保存。 0 1 m 磷酸缓冲液： 3 6 m la 液+ 1 4 m lb 液+ 5 0 m l 蒸馏水( 用h 3 p 0 4 调p h 至7 2 ) ( a 液、b 液 配制如下) ； a 液配制( 1 0 0 0 m l ) ： n a 2 h p 0 4 2h 2 03 5 6 1 9 ( 或n a 2 h p 0 4 7h 2 05 3 6 5 9 ；或n a 2 h p 0 4 1 2h 2 0 7 1 6 4 9 ) b 液配制( 1 0 0 0 m l ) ： n a h 2 p 0 4 。h 2 02 7 6 0 9 ( 或n a h 2 p 0 4 。2 h 2 03 1 2 1 9 ) 2 5 戊二醛溶液： 9 0 m l 0 1 m 磷酸缓冲液+ 1 0 m l 2 5 戊二醛。 2 1 5 使用仪器 ( 1 ) 超净净台( 苏净集团安泰公司生产) ( 2 ) 培养箱( 上海市跃进医疗器械一厂生产) ( 3 ) 立式压力蒸汽灭菌锅 ( 4 ) 干热灭菌电热烘箱 ( 5 ) 高速冷冻离心机( 最大转速2 0 0 0 0 r p m ，b e c k m a n ) ( 6 ) 恒温摇床( e x c e l l ae 2 4 ) ( 7 ) 台式离心机( e p p e n d o f f 生产) ( 8 ) 4 冰箱( 海尔) ( 9 ) - 2 0 冰柜( 奥柯玛) ( 1 0 ) 显微镜( o l y m p n s ) ( 1 1 ) 7 2 1 型分光光度计 ( 1 2 ) 原子吸收分光光度仪( 惠普上海分析仪器厂，3 5 1 0 ) 1 9 ( 13 ) 3 - 3 4 0 0 n 型扫描电镜( h i t a c h ie d a x s - 3 4 0 0 ns c a n n i n ge l e c t i o n m i c r o s c o p e ) ( 14 ) 5 3 0 1 型真空干燥机( e p p e n d o r f 生产) 2 2 方法 2 2 1 样品采集 铜矿石：从德保铜矿山采矿区各点分别采集样品装袋取回实验室。 2 2 1 1 矿石样品处理 将铜矿石分别经过敲碎和辗压后，分别用5 0 目、1 5 0 目、2 0 0 目、 2 0 0 目 的筛网筛矿，分别得到相应目数的矿粉，分别装入瓶子备用。 2 2 1 2 矿石样品成分含量的测定 2 2 1 2 1 铜矿石中的铜含量 a 原理 铜矿石中的铜含量测定依据间接碘量法测定i 明。 在弱酸溶液中，c u 与过量的k i 作用，生成c u i 沉淀，同时析出h ，反应 式如下： 2 c u 2 + “r 2 c u i 上+ 1 2 或2 c u 2 + + 5 1 + 2 c u l 【+ i s 。 析出的1 2 以淀粉为指示剂( 临近终点时加入，以防止淀粉吸附太多的1 2 ，使 终点变色困难) 。终点时溶液蓝色消失，变为米黄色或乳白色悬浊液。用n a 2 8 2 0 3 标准溶液滴定： 1 2 + 2 s 2 0 3 2 2 i - t - 8 4 0 6 2 。 c u 2 + 和r 的反应是可逆的。 注：n a 2 s 2 0 3 标准溶液用间接法配制，哒基准物质k 2 c r 2 0 7 标定： c r 2 0 7 2 + 6 i + 1 4 h + = 2 c ? + + 3 1 2 + 7 h 2 0 ； 1 2 + i = 1 3 ； 2 8 2 0 3 弘+ 1 3 。= s 4 0 6 。+ 3 1 。 同样用淀粉作指示荆，终点时溶液由蓝色变为亮绿色 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物浸矿可行性研究 b 铜矿石的溶解 铜矿石的溶解方法参刚6 引。 按1 1 ：l ：l 的比例分别准确称取铜矿石样品5 0 目、1 5 0 目、2 0 0 目、 2 0 0 目的共0 5 9 置于2 5 0 m l 锥形瓶中，依次分别加入1 0 m l ( 1 + 1 ) h 2 s 0 4 ，1 5 m l 浓h n 0 3 后，加热并不断晃动锥形瓶使矿石慢慢溶解完全，再加入5 m l 浓h c i 使矿石溶解更完全。溶解完全后定容至l o o m l 。 c 间接碘量法测定铜矿石中的铜含量 取5 m l 上述制备好的铜矿石溶解液，滴j j l ( 1 + 1 ) 氨水直到溶液中刚刚有稳定 的沉淀出现，然后加入8 m l ( i + i ) h a c ，1 0 m l n h 4 h f 2 缓冲液，i o m l k i 溶液，用 0 1 t o o l l 。1 n a 2 s 2 0 3 标准溶液滴定至浅黄色。再加入3 m l ( 5 9 l 。1 ) 淀粉指示剂， 滴定到浅蓝色，最后加入1 0 m l n h 4 s c n 溶液，继续滴定至蓝色消失。 利用公式2 1 及e x c e l 快速建立求铜含量模块，将得出耗硫代硫酸钠的体 积输入模块，便可快速得出铜矿石的铜含量： ce 代a m x vt 代艘饷6 3 5 5 ( 呦= 百_ 一1 0 0 公式2 1 共取3 次样品，每个样品重复测量2 次。最后结果取所有测量结果的平均值， 结果如表3 - i 。 2 2 1 2 2 铜矿石中的铁含量 a 原理 本研究的铜矿石中的铁含量测定是依据邻二氮菲吸光光度法测定【 一。 在p h 为2 - - - 9 的溶液中，f e 2 + 与邻二氮菲( p h c n ) 生成稳定的橘红色络合 物f e ( p h e n ) 3 2 + ，橘红色络合物f e ( p h c n ) 3 2 + 在波长5 1 0 n m 处有最大吸收峰。 我们可以利用这一特性进行铁含量测定，反应式如下： f e 2 + + 3 p h e n - f e ( p h e n ) 3 2 + 当铁为+ 3 价时，可用盐酸羟胺还原： 2 f e 2 + + 2 n h 2 0 h h c i = 2 f e 2 + + n 2 t “h t 屹h 2 0 + 2 c l 。 b 铜矿矿石的溶解 取2 2 1 2 1 所得溶解液。 2 1 广西大学硕士学位论文微紫青霉菌菌株g x c r 的生物漫矿可行性研究 c 工作标准曲线的绘制 准确称取o 8 6 3 4 9 ( a r 级) n h 4 f e ( s 0 4 ) 2 1 2 h 2 0 于2 0 0m l 烧杯中，加入2 0 m l 6 m o l l 。1 h c i 溶液和少量水，溶解后转移至l l 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。 制备得到lo o p g m l 。1 的铁标准溶液。 分别取o o m l 、0 2 m l 、0 4 m l 、0 6 m l 、0 8 m l 和1 0 m l 的上述浓度为 1 0 0 p g m l 。1 的铁标准溶液于1 0 0 m l 容量瓶中，再分别向其中依次加入2 m l 浓度 为5 的盐酸羟胺，5 m l 醋酸钠( 5 0 ) ，3 m l 邻二氮菲( o 2 ) ，最后定容至1 0 0 m l ， 仔细振摇，使铁显色，放置约1 5 分钟。此时溶液的标准浓度分别为o o p g m l 、 0 2 p g m l 、0 4 p g m l 、0 6 p g m l 、o 8 p 咖l 和1 0 p g m l ，再分别取4 m l 于1 0 m m 石英比色皿，以标准浓度为o o p g m l 的标准溶液为参比测定吸光度( 5 1 0 n m ) ，经 空白校正后，以铁离子浓度( g g m l ) 为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线； 其样本的标准差用公式2 2 求得： s = 0 l x 2 ( x ) 2 n n ( n 1 ) ) u 2 公式2 2 d 铁离子浓度与0 d s l 0n m 吸光值的关系 根据测得的o d 5 i o h m 的吸光值和标准曲线可以计算出对应的铁离子浓度。 e 邻二氮菲吸光光度法测定铜矿石的铁含量 用移液管吸取0 2 m l 上述铜矿矿石溶解液于l o o m l 容量瓶中，加入2 m l 6 m o l l 1 h c l 溶液，再分别向其中依次加入2 m l 浓度为5 的盐酸羟胺，5 m l 醋酸钠( 5 0 坳，3 m l 邻二氮菲( 0 2 ) ，最后定容至1 0 0 m l ，仔细振摇，使铁显色， 放置约1 5 分钟。再分别取4 m l 于1 0 m m 石英比色皿，以标准浓度为o o v g l 的 标准溶液为参比测定吸光度( 5 1 0 r i m ) 。共取3 次样品，每个样品重复测量2