（海洋生物学专业论文）裙带菜sams基因的克隆、分析及原核表达.pdf

学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注 和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本 人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：二札 指导教师签名：盛曼习竺 签名日期：年月日 ：二 ；q t - r 辽宁师范大学硕士学位论文 摘要 本实验采用改良的s d s 提取方法从裙带菜配子体中提取总r n a 。通过设计简并引 物克隆裙带菜s 腺苷甲硫氨酸合成酶基因( u p s a m s ) 。获得的基因e d n a 序列全长为 1 4 9 1 b p ，并编码3 9 7 个氨基酸，预测蛋白分子量为4 3 2k d a ，等电点为5 2 4 4 。起始密 码子为a t g 终止密码子为t a a 。5 非翻译区( u t r ) 长度为9 2b p ，3 u t r 长度为2 0 5 b p ，氨基酸序列中包含4 2 个碱性氨基酸，5 7 个酸性氨基酸，1 3 2 个疏水性氨基酸和9 3 个极性氨基酸。氨基酸序列还包含两个特定基序，第一个特定基序为g a g d q g ，位置 在氨基酸序列的1 2 7 1 3 2 之间，第二个特定基序为g o o a f s g r d ) ，位置在2 7 4 2 8 2 之间。 b l a s t x 比对显示裙带菜s a m s 基因编码的蛋白( u p s a m s ) 序列与已发表的其他物种序 列的相似度在6 8 9 6 。结果表明裙带菜s a m s 基因与藻类的相似度高于高等植物。进 化树结果显示裙带菜s a m s 基因首先和同属褐藻的海带和水云聚在一起，然后再与绿藻， 红藻和硅藻聚合，最后再和十几种高等植物聚类。进化分析表明，裙带菜与其他海藻 s a m s 亲缘关系要近于高等植物。疏水性分析结果显示u p s a m s 亲水性最强是第3 3 9 位 的甘氨酸疏水性最强是第31 4 位赖氨酸。磷酸化分析显示丝氨酸有1 0 处，苏氨酸有4 处，酪氨酸有3 处可能被磷酸化。不同的胁迫条件下，采用实时荧光定量聚合酶链式反 应检测u p s a m s 基因的相对表达量的变化水平，结果表明u p s a m s 基因与抗逆相关。 将u p s a m s 基因转入大肠杆菌表达菌株b l 2 1 中进行原核表达，s d s p a g e 电泳结果显 示u p s a m s 基因已经结合在p g e x 4 t 1 表达载体上，并形成了融合蛋白。 裙带菜s a m s 基因的克隆分析和表达为今后进一步研究该基因的抗性机理奠定了重 要的基础。 关键字：裙带莱；涨分子克隆；实时荧光定量p c r ；原核表达 c l o n i n g ，a n a l y s i sa n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n o fs a m sg e n ei n u n d a r i a p i n n a t i f i d a a b s t r a c t t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mt h eg a r n e t o p h y t e so fu n d a r i ap i n n a t i f i d aw i t hi m p r o v e d s d sm e t h o d s a d e n o s y l m e t h i o n i n es y n t h e t a s eg e n e ( u p s a m s ) h a db e e ni s o l a t e df r o mt h e e c o n o m i cs e a w e e du p i n n a t i f i d ab yu s i n gd e g e n e r a t ep r i m e r s t h ec d n as e q u e n c ew a s 1 , 4 91b pi nl e n g t hw i t ha l lo r fo f1 ，19 4n u c l e o t i d e s ，e n c o d i n gad e d u c e d3 9 7a m i n oa c i d r e s i d u e s ，a n dh a dap r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h to f4 3 2k d aa n dw a si s o e l e c t r o n i cp o i n to f 5 2 4 4 t h es e q u e n c eb e g a nw i t ht h ep r e s u m e di n i t i a la t gc o d o na n ds t o pt a ac o d o n ，w i t h t h e5q j t ra n d3 ，u t r9 2b pa n d2 0 5b pi nl e n g t h ，r e s p e c t i v e l y u p s a m sc o m p r i s e d4 2 s t r o n g l yb a s i c ，5 7s t r o n g l ya c i d i c ，1 3 2h y d r o p h o b i c ，a n d9 3p o l a ra t l i n oa c i d s t h ea m i n o a c i d s e q u e n c ei n c l u d e d t w o t y p i c a lm o t i f s ，n a m e l y ，s i g n a t u r e m o t i f - 1g a g d q g ( a t p o s i t i o n 12 7 - 13 2 )a n d s i g n a t u r e m o t i f - 2 g g g a f s g k d ( a tp o s i t i o n2 7 4 - 2 8 2 ) b l a s t xr e s u l tr e v e a l e dt h es a r n ss e q u e n c eo fup i n n a t i f i d a ( u p s a m s ) s h a r e d6 8 一9 6 i d e n t i t yw i t ht h ep r e v i o u s l yp u b l i s h e ds a m ss e q u e n c e so fo t h e rs p e c i e s up i n n a t i f i d aw a s c l u s t e r e dw i t hld i g i t a t aa n de s i l i c u l o s u so fb r o w na l g a e ；w i t hg r e e na n dr e da l g a e ；w i t h d i a t o m sa n dd i n o f l a g e l l a t e ；a n dw i t ht e r r e s t r i a lp l a n t s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h e p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po fu p s a m sw i t ho t h e rs e a w e e d sw a sc l o s e rt h a nt h o s ef r o mh i g h e r p l a n t s h y d r o p h o b i c i t ya n a l y s i ss h o w e dt h a tt h es t r o n g e s th y d r o p h i l i ca m i n oa c i dw a sg l y c i n e a n dt h em o s th y d r o p h o b i ca m i n oa c i dw a sl y s i n e p h o s p h o r y l a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e r e w e r e10s e r i n e ，4t h r e o n i n ea n d3p o s s i b l et y r o s i n e u n d e rd i f f e r e n ts t r e s sc o n d i t i o n s ，r e l a t i v e m r n ae x p r e s s i o nl e v e l so fu p s a m sw e r em e a s u r e db yr e a l t i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v e p c ra n dt h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h eu p s a 旌w a sr e l a t e dt os t r e s st o l e r a n c e u p s a m s w a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 u p s a m se x p r e s s i o ni nt h eo r i g i n a l ，s d s p a g es h o w e d u p s a m sh a db e e nc o m b i n e di np g e x 4 t - 1e x p r e s s i o nv e c t o r ，a n dw a st h ef o r m a t i o no ft h e f u s i o np r o t e i n g e n ec l o n i n g ，a n a l y s i sa n de x p r e s s i o no fu p s a m sh a dl a i da ni m p o r t a n tf o u n d a t i o nf o r f u f t h e rs t u d yt ot h er e s i s t a n tm e c h a n i s m k e y w o r d ：u n d a r i ap i n n a t i f i d a ；s a m s ；m o l e c u l a rc l o n i n g ；r e a l t i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v e p c r ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n i i i 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 弓i言1 1 文献综述2 1 1 s 腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因2 1 2s 腺苷甲硫氨酸合成酶的结构及催化机理2 1 3 s 腺苷甲硫氨酸参与多胺合成的途径。3 1 4s 腺苷甲硫氨酸的生物学意义4 1 4 1 转甲基：4 1 4 2 转硫基5 1 4 3 转氨丙基5 1 5 本实验研究内容及意义5 2 裙带菜s 腺苷甲硫氨酸合成酶基因豳4 m s ) 的克隆、分析6 2 1 材料培养o 6 2 2 仪器设备及药品：6 2 2 1 仪器设备6 2 2 2 试剂及耗材6 2 3 实验方法7 2 3 1 裙带菜配子体r n a 的提取与纯化7 2 3 2 反转录8 2 3 3 裙带菜s a m s 基因的克隆8 2 3 43 - f u l lr a c e 1 0 2 3 55 f u l lr a c e 1 2 2 3 6p c r 产物的纯化，亚克隆及测序1 5 2 3 7 实时荧光定量p c r 1 8 2 4 结果与分析19 2 4 1 裙带菜r n a 电泳检测19 2 4 2 裙带菜s a m $ 基因的克隆1 9 2 4 3 菌落p c r 检测2 0 2 4 4 序列分析。2 0 2 4 5 实时荧光定量p c r 2 3 v 裙带菜s a m s 基因的克隆、分析及原核表达 2 5 讨论2 5 3 裙带菜s a m s 基因的原核表达2 7 3 1 试剂配置二2 7 3 2 操作步骤2 7 3 2 1 获得目的基因2 7 3 2 2 构建重组表达载体2 8 3 2 3 检测重组表达菌株。2 8 3 2 4 诱导表达2 8 3 2 5s d s p a g e 电泳检测( 采用垂直式电泳槽装置) 2 9 3 3 实验结果3 0 3 3 1 裙带菜翩 舔基因开放阅读框的克隆及重组质粒的构建3 0 3 3 2s d s p a g e 电泳检测31 3 4 实验讨论3l 4 结论3 3 参考文献：3 4 附录a 附录内容名称3 7 攻读硕士学位期间发表学术论文情况3 8 致谢3 9 v i 辽宁师范大学硕士学位论文 引言 裙带菜( u n d a r i ap i n n a t i f i d a ) 隶属于褐藻f ( p h a e o p h y t a ) 褐子纲( p h a e o s p o r e a e ) 海带目 ( l a m i n a r i a l e s ) 翅昆布科( a l a r i a c e a e ) 裙带菜属( u n d a r i a ) ，是一年生大型褐藻。裙带菜是 暖温带性海藻，能够在水温较高的海域生长繁殖。裙带菜营养价值较高，深受消费者的 喜爱，作为我国三大主要经济海藻( 海带、紫菜、裙带菜) 之一，是重要的出口创汇水产 品，其养殖范围主要分布在大连和山东沿海海域。大连是我国裙带菜养殖的重要基地， 产量占全国的9 0 左右，年产值达4 0 亿元，已成为大连水产行业的支柱产业之一，产 品远销日本和韩国等地区。对于植物来说，干旱、盐碱、低温是最严重的逆境胁迫，对 植物产生诸多不利影响。随着海洋生态环境的恶化，这些环境压力可能阻碍经济藻类生 长和发育，甚至会导致很多大型海藻的死亡。因此培育抗逆新品种，是经济海藻持续稳 定供应的保证，也是持续发展海藻养殖业的必要条件。 s 腺苷甲硫氨酸合成酶催化a t p 和l 甲硫氨酸合成s 腺苷甲硫氨酸( s a m ) l l l 。 s a m 不仅是蛋白质、核酸、多糖和脂肪酸转甲基生化过程中的主要甲基供体【2 1 ，而且它 还与多胺和乙烯等生物合成途径直接相关【3 卅。许多研究表明，s 腺苷甲硫氨酸合成酶基 因( s a m s ) 表达量的变化受环境【5 ，、激素【7 1 和生长发育【眄】等多种因素的影响。一 近年来在海洋藻类分子生物学研究中，对s a m s 基因也进行了初步探讨。例如在莱 茵衣藻( c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ) 【1 0 1 、三角褐指藻( p h a e o d a c t y l u mt r i c o r n u t u m ) 1 1 j 、 掌状海带( l a m i n a r i a 啦妇肠) 1 2 】、条斑紫菜( p o r p h y r ay e z o e n s 西) 【1 3 】、细柱藻 ( c y l i n d r o t h e c a c l o s t e r i u m ) 、布氏双尾藻( d i t y l u mb r i g h t w e l l i i ) 、冰川星杆藻( a s t e r i o n e l l a g ，口c i a l i s ) 1 4 】、团藻( v o l v o xn a g a r i e n s i s ) 1 5 】和水云( e c t o c a r p u ss i l i c u l o s u s ) 【1 6 】等藻类 中陆续克隆得到了该基因。然而，至今没有关于裙带菜s a m s 基因( u p s a m s ) 的克隆 和分析的报道。 裙带菜s a m s 基因的克隆、分析及原核表达 1 文献综述 s 腺苷甲硫氨酸合成酶能够催化l 甲硫氨酸与a t p 反应合成s 腺苷甲硫氨酸 ( s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ，s a m ) ，该酶广泛存在于植物【1 7 j 、动物【1 8 】和微生物中，参与 多种生化反应，是生物体内重要的中间酶。 s 一腺苷甲硫氨酸于1 9 5 2 年由意大利科学家c a n t o n i 最先发现【l 】，是能够改善细胞 生理代谢的活性物质，s a m 参与植物体内乙烯和多胺的生成，参与磷脂、脂肪酸、蛋 白质、核酸及多糖物质的合成，与抗氧化性和生物解毒直接相关，是维持细胞膜正常生 理代谢功能的必要生命物质。研究认为，s a m 是生物转甲基、转硫基【1 9 1 、转氨丙基【2 0 】 过程中的甲基供体，在临床上主要用于关节炎【2 l 】，肝病【2 2 】和精神病等严重威胁人类生命 的相关疾病的治疗。 1 1s 一腺苷甲硫氨酸合成酶的编码基因 s 腺苷甲硫氨酸合成酶基因( 跚脸) 由多基因家族编码，已经在原核和真核生物 中陆续被克隆得到，在多种生物物种中具有较高的同源性o 大肠杆菌s a m s 基因由m e t k 基因编码，m a r k h a m 等【2 3 】最先克隆到m e t k 的c d n a 序列，m e t k 基因全长为1 1 5 2b p ， 共编码3 8 3 个氨基酸，蛋白分子量为4 1 9 k d a 。h a f n e r 等【2 4 】从m e t k 突变菌株里分析测 定了大肠杆菌中可能有编码s 腺苷甲硫氨酸合成酶的其他基因序列，接着s a t i s c h a n d r a n 等【2 5 】利用m e t k 作为探针进行s o u t h e r n 杂交，实验证明除m e t k 外仍然存在同源基因 m e t x 该基因序列长度为11 5 2b p ，顺序为m e t k - s p e a - s p e b m e t x , m e t k 和m e t x 之间仅 有2 4 个碱基的差别，研究表明m e t k 只在基本培养基中表达，m e t x 只在丰富培养基中 表达，这两种基因的表达具有明显的特异性。 酿酒酵母中含有两种s 腺苷甲硫氨酸合成酶基因( s a m s i ，黝m $ i i ) ，分别以二聚体和 四聚体的形式存在，并且证明这两个基因并不是由同一个m r n a 所编码，而是分别由 两个不同的基因( s a m l ，s a m s 2 ) 编码。s a m s l 序列长度为11 4 9 b p ，共编码3 8 2 个氨基 酸，分子量为4 2 3 k d a ；s a m 2 序列长为11 5 2 b p ，共编码3 8 4 个氨基酸，分子量为4 1 8 k d a 。 在高等植物s a m s 基因的研究结果表明，拟南芥【2 6 】中含有4 种s a m s 基因，其中2 个在茎、枝、叶、根等所有组织中都有很强的表达量，长春花f 2 7 】中也克隆到3 种s a m s 基因。海藻类群中的许多微藻，如硅藻及许多大型藻类如红藻、绿藻、褐藻中的s a m s 基因也都已经获得【l m 川。 1 2s 一腺苷甲硫氨酸合成酶的结构及催化机理 2 在大肠杆菌中s a m s 基因编码的蛋白质为六方体结构，是同一亚基的四聚体【2 引。形 成的过程为：首先由2 个亚基紧密相连形成球形二聚体，再由二聚体相互结合成花生状 的四聚体。每两个亚基之间有两个活性中心，每个亚基有9 个螺旋和1 1 个折叠组成， 分为n 端结构域、c 端结构域和中间结构域三个结构域。n 端和中间结构域都有相同的 二级结构( 4 个折叠，2 个螺旋) ；c 端结构域的最后的螺旋变成了折叠，且中间的一 个螺旋分成两个小螺旋。各亚基之间通过结构域间的折叠片疏水作用、q 螺旋与核心环 之间的极性相互作用紧密结合。例如，a ，b 两亚基( b 亚基的氨基酸残基标有) ， a r 9 2 4 4 、g l u 4 2 和t h r 2 4 2 形成盐桥；l y 2 4 3 、g l y 2 4 3 * 和钾离子结合，紧密结合亚基的 中心结构域之间的极性相互作用形成了活性中心的骨架，亚基之间的稳定结合主要靠氢 键来维持。如果亚基c y s 9 0 或c y s 2 4 0 突变，酶的结构就会由活性的四聚体变为不可逆 转的无活性的二聚体【2 孙，由此可以证明这两个亚基是四聚体形成的关键位点。 大肠杆菌s a m s 基因的催化属于双分子亲核取代反应。第一，a t p 与l 甲硫氨酸 在s 。腺苷甲硫氨酸合成酶( s a m s ) 催化作用下生成s a m 和m g - p p p i 中间复合体，然后 m g - p p p i 水解形成m g p p i 和p i 。晶体学研究结果显示【2 s 】，s a m s 的每两个结合紧密结构 域间存在两个活性中心：4 个赖氨酸( l y s ) ( 1 6 5 ，2 4 5 ，2 6 5 ，2 6 9 ) 和一个组氨酸( h i s ) ( 1 4 宰) 组成一个活性中心，h i s l 4 + 是a t p 上5 o 的质子供体，l y s 2 6 9 与a t p 作用于侧 链，使之旋转接近5 - 0 ，从而有利于5 - c 5 o 断开生成s a m 。另一活性中心为4 个天 冬氨酸残基( a s p ) ( 1 6 、2 7 1 、1 1 8 、2 3 8 * ) 中的2 7 1 和1 6 两个残基分别与二价m g + 和c 0 2 + 配位形成的三角结构，磷原子上的氧原子能与金属离子结合。1 1 8 和2 3 8 f l 邕与l 甲硫氨酸结合经酶催化生成s a m 。l y s l 6 5 + 与b p 上的氧原子结合有利于p p p i 的水解， a s p 2 4 4 是酶中的保守氨基酸，它与p p p i 在b p 和y p 之间的断裂有关，存在于q p 和 y p 之间的l y s 2 6 5 则参与整个反应过程。一个磷原子分别与l y s1 6 5 、l y s 2 6 5 和l y s 2 4 5 * 通过氢键互相作用，这是因为都带有正电荷的a s p 、l y s 和a t p 与带负电荷的p p p i 中 的o 原子发生中和反应，能够形成稳定的结构。 1 3s 一腺苷甲硫氨酸参与多胺合成的途径 s a m 在体内通过一系列生化反应生成的终产物有两种：乙烯和多胺( 图1 1 ) 。它 们在植物遭受各种生物胁迫时都有不同量的合成。s a m s 是乙烯和多胺生成过程中的第 一个催化酶，催化生成的产物s a m 是最一种重要的中间物。s a m 一方面参与乙烯的生 物合成；另一方面参与多胺的生物合成，为多胺的生物合成提供前体。植物体内的多 胺常以游离态和结合态的形式存在，例如二胺( p u t 、c a d ) 、三胺( s p d ) 、四胺( s p m ) 及其它胺类物质。p u t 是合成多胺途径的中心产物，主要由精氨酸途径或鸟氨酸途径合 成，分别经精氨酸脱羧酶( a d c ) 和鸟氨酸脱羧酶( o d c ) 催化( 图1 1 ) 。两条合成途径 3 裙带菜s a m s 基因的克隆、分析及原核表达 具有不同的意义，鸟氨酸途径主要参与细胞的生长和增殖，精氨酸途径与生物胁迫应答 有关。脱去羧基的s a m ( d s a m ) 经亚精胺合成酶和精胺合成酶催化参与三胺和四胺的 生成，最终生成s p d 和s p i n 。多胺的合成途径能被a d c 抑制剂二氟甲基精氨酸( d f m a ) 和o d c 抑制剂二氟甲基鸟氨酸( d f m o ) 阻断。多胺能抑制和清除h 2 0 2 等氧自由基， 由图中可以看出多胺与乙烯的生物合之间存在相互制约的关系。由于s a m 是终产物乙 烯和多胺的前体，而乙烯是加速植物老化和果实成熟的物质，所以多胺的大量形成能够 抑制乙烯合成的含量，起到延缓细胞衰老的作用。氧自由基能够影响植物细胞壁，使植 物生长代谢发生不可修复的损伤，多胺的生成能保护植物细胞壁免受这种伤害，但对其 保护作用的机制报道较少。因此，探索多胺参与生物与非生物胁迫的生理与分子机制， 能够为提高植物应对逆境环境的能力、提高植物利用多胺的效率提供理论基础，最终达 到调节植物生长发育和增加作物产量的目的。 m r e一。乓o 盹 加a 斗g m a t i n e a i髓m o i 1 斗mgbg迤鲥嚣?t舄lilihl|all豫lgs a d e n o s y l m e t h i o n i n e d s a m 卜、s p d s y n t h a 豫 1。 s p e r m i d i n e l a c cs y n t h a s e 鼢油c n s p m s y n t h a s ei、 a v g 下 i a c c s p e r m i n e l a c co x i d a 姥 图1 1多胺和乙烯生物合成途径 f i g 1 1 t h eb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fp o l y a m i n e sa n de t h y l e n e 1 4 s 一腺苷甲硫氨酸的生物学意义 s a m 是由s a m s 催化生成的一种高能还原剂，作为甲基供体参与多种生物学反应，是 动植物和原核生物普遍存在的中间代谢产物，同时是生物体内1 碳( c ) 、3 c 、5 c 的前 体，参与转甲基、转硫基、转氨丙基等多种代谢过程。 1 4 1 转甲基 4 辽宁师范大学硕士学位论文 s a m 通过将甲基转移到d n a 、蛋白质和磷脂等生物大分子中，从而影响生物体的生 命活动。失去甲基的s a m 被称为s 一腺苷高半胱氨酸( s a h ) ，s a i l 是甲基化过程中的竞 争抑制剂，能够对核酸和氨基酸进行甲基化修饰，并且在基因靶位点提供标记作用。其 中，对核酸的修饰在于对核糖上氨基的甲基化，对氨基酸的修饰主要是蛋白质合成后的 甲基修饰。 1 4 2 转硫基 s a m 甲基化生成的s a i l 能迅速分解为高半胱氨酸，高半胱氨酸通过转移硫基生成 还原型谷胱甘肽( g s h ) 。g s h 是生物体内非酶促的抗氧化物质，能够抵抗植物体内氧化 性损伤从而起到解毒作用，保护植物细胞壁免受氧自由基的伤害，在植物生长代谢中起 重要作用， 1 4 3 转氨丙基 在多胺的合成过程中，s a m 经脱羧生成5 腺苷甲基硫丙胺，然后将氨丙基转移到 二胺结构中。甲基硫丙胺脱去氨丙基后生成5 甲硫腺苷，进而生成l 一甲硫氨酸。 1 5 本实验研究内容及意义 目的：克隆裙带菜配子体鲥墙删唧基因全长序列并进行分析。利用实时荧定 量p c r 技术，研究u p s a m s 基因在不同的胁迫处理下相对表达量变化情况。将该基因 转入b l 2 1 原核表达菌中实现异源表达。 意义：低温、干旱、高盐等逆境是限制裙带菜养殖产业快速发展的主要因素，使其 年产量极不稳定，克隆裙带菜抗逆相关基因并进行功能研究，对揭示抗逆机理、培育抗 逆新品种具有一定的理论和实际意义。 5 裙带菜s a m s 基因的克隆、分析及原核表达 2 裙带菜s 一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆、分析 2 1 材料培养 1 成熟的裙带菜孢子体于1 9 9 6 年采集自大连河口海藻养殖场，切取孢子叶，实验室内 放散游孢子并分离配子体，弱光低温保存。扩大培养条件为：光照强度2 0p m o l p h o t o n sm - 2 s 山温度2 0 - a ：l 。c ，光周期为1 4 ：1 0h ( l ：d ) 。配子体于p e s t 2 9 - 3 明加富海水培养 液扩繁至所需用量。 2 实验采用4 种非生物胁迫条件( 低温、高盐、干旱和激素) 处理裙带菜配子体。首 先将配子体放在p e s 培养液中培养，4 0 c 低温处理；高盐、干旱和激素处理方法采用将 培养液里加入2 0 0m mn a c l 、1 5 p o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g ) 6 0 0 0 和o 0 3 g i b b e r e l l i n s ( g a s ) ，每一种处理的时间段都设为0 、6 、1 2 、2 4 和4 8h ，且每个时间段设3 个平行 实验，用液氮研磨材料，并且保存在8 0 0 c 。 2 2 仪器设备及药品 2 2 1 仪器设备 ( 1 ) e p p e n d o r f 5 4 1c e n t r i f u g e 5 4 1 7 r ( g e r m a n y ) ( 2 ) 漩涡震荡仪 ( 3 ) 8 0 0 c 低温冰箱 ( 4 ) t a k a r a p c r 仪 ( 5 ) t h e r m a ld i c er e a lt i m es y s t e m ( t a k a r a ) ( 6 ) c i m og e x 3 0 0 b s i i i 光照培养箱( 上海新苗医疗器械制造有限公司) ( 7 ) d g g 9 1 2 3a d 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海森信实验仪器有限公司) ( 8 ) b c n 1 3 6 0 b 型生物洁净工作台( 北京东联哈市仪器制造有限公司) ( 9 ) p i n e t r e e 净水器 ( 1 0 ) d k - 8 d 型电热恒温水槽( 上海跃进医疗器械厂) ( 1 1 ) d y y 6 c 型电泳仪 ( 1 2 ) z f 型紫外透射反射分析仪( 上海嘉鹏科技有限公司) ( 1 3 ) d r p 9 0 8 2 型电热恒温培养箱( 上海森信实验仪器有限公司) ( 1 4 ) 8 z q c 空气浴振荡仪( 哈尔滨东联电子科技开发有限公司) ( 1 5 ) 凝胶成像系统d n a 数据检测仪 ( 1 6 ) t s 一1 0 0o r b i t a ls h a k e r ( q i l l n b e i e r ) 2 2 2 试剂及耗材 6 所需耗材： 2m l 和2 0 0 此e p p e n d o r f t u b e 浸泡在1 d e p c 水中过夜处理，高压灭菌3 5r a i n ，烘干 备用。研磨材料所需研钵、药匙、镊子均需1 8 0 。c 烘烤3h 以上备用。 2 3 实验方法 2 3 1 裙带菜配子体r n a 的提取与纯化 ( 1 ) r n a 提取过程如下： 称取新鲜配子体( 0 1g ) 在研钵中，加入液氮研磨成粉末，装入2i n le p p e n d o f f t u b e 中备用 加入s d s 提取液1m l 和1 0 肛lp 巯基乙醇，在漩涡震荡仪剧烈震荡。 冰上静止5m i n ，4 0 c ，1 2 ，0 0 0r p m ，离心1 0m i n 。 吸取上清液于一新的e p p e n d o r f t u b e 中，加入3 3 01 t l 醋酸钾，混匀。 冰上静止5m i n ，4 0 c ，1 2 ，0 0 0r p m ，离心1 0m i n 。 吸取上清液于一新的e p p e n d o r f t u b e 中，加入2 5 0i l l 三氯甲烷，剧烈混匀1 0 r a i n 。 冰上静止5m i n ，4 0 c ，1 2 ，0 0 0r p m ，离心1 5m i n 。 第和步重复一次。 上清液中加入6 0 0 此预冷的异丙醇，混匀后，一2 0 0 c 静止3 0 m i n 。 4 0 c ，1 2 ，0 0 0r p m ，离心1 0m i n 。 o 弃上清，加入7 5 乙醇漂洗，4 0 c 条件下8 , 0 0 0r p m ，离心5 m i n 。 o 弃上清，室温晾干5m i n ，加2 0 此r n a s e f r e eh 2 0 溶解。 ( 2 ) r n a 纯化过程如下： 按下列组分配置消化反应液 7 裙带菜s a m s 基因的克隆、分析及原核表达 所需试剂所需体积( p l ) r n a 2 0 1 0 x d n a s eib u f f e r 5 r n a s ei n h i b i t o r 0 5 d n a s ei 2 r n a s e f r c ch 。o 2 2 5 反应混合液3 7 0 c 孵化3 0m i n 。 加入等体积氯仿，剧烈混匀5r a i n 。 冰上静止5m i n ，4 0 c ，1 2 ，0 0 0r p m ，离心1 5r a i n 吸取上清液于新的e p p e n d o r ft u b e 中，加入等体积无水乙醇和1 0i x l3 m 醋酸钠， 8 0 0 c 过夜沉淀。 第二天取出e p p e n d o r f t u b e ，4 0 c ，1 2 ，0 0 0r p m ，离心1 0 m i n 。 弃上清，加入1m l 7 5 乙醇漂洗，4 。c ，8 , 0 0 0r p m ，离心5m i n 。 弃上清，室温晾干5m i n ，加2 0 此r n a s e - f r e eh 2 0 溶解。 2 3 2 反转录 ( 1 ) 采用宝生物反转录试剂盒方法配置反应液体系 所需试剂所需体积( 儿) 总r n a 5 o l i g o ( d t ) 1 r n a s e f r e eh 2 0 5 ( 2 ) 上述反应液混合均匀后6 8 0 c 反应1 5m i n 。 ( 3 ) 按下列组分配置反转录延伸反应液 所需试剂所需体积( 肛) 上述反应液 c1 1 5x r e v e r s et r a n s c r i p t a s eb u f f e r 5 r e v e r s et r a n s c r i p t a s em m l v ( r n a s eh ) 2 d n t p ( 1 0m m ) 1 5 r n a s ei n h i b i t o r ( 4 0u l x l ) o 5 t o t a lv o l u m e 2 0 ( 4 ) 2 0p l 反应液混合均匀后4 2 。c ，反应6 0m i n ，然后7 0 。c 反应1 5r a i n ，反应结束后 2 0 0 c 保存备用。 2 3 3 裙带菜副船基因的克隆 8 辽宁师范大学硕士学位论文 ( 1 ) 所有引物列表 引物名称( 1 0 州) u p s a m s f u p s a m s - r q r q o q i 3 o u t e rs p e c i a lp r i m e r 3 i n n e rs p e c i a lp r i m e r 5 o u t e rp r i m e r 5 i n n e rp r i m e r 5 o u t e rs p e c i a lp r i m e r 5 i n n e rs p e c i a lp r i m e r r e a lt i m eu p s a m s f r e a lt i m eu p s a m s r r e a lt i m eu p a c t i n f r e a lt i m eu p a c t i n r 0 i 讧u p s a m s f o r f u p s a m s r ( 2 ) u p s , 4 m s ( e s t ) 片段的克隆 按下列组份配制p c r 反应液 所需试剂 反转录反应液 10 x p l u sp c rb u f f e r ( m 9 2 + p l u s ) d n t pm i x t u r e ( 2 5 州) u p s a m s f ( 1 0 山订) u p s a m s r ( 1 0 州) p l u st a q ( 5u i t l ) d d h 2 0 t o t a lv o l u m e p c r 反应条件如下： 9 4 0 c 9 4 0 c 3m i n 3 0s e c 引物序列( 5 _ 3 ) a a c g a g g g n c a c c c h g a c a a g a aa n g g c c h g a m g g g t t g a g g c c a g t g a g c a g a g t g a c g a g g a c t c g a g c t c a a g c t i v 【 1 _ i 1 t t t r n n _ 1 1 t c c a g t g a g c a g a g t g a c g g a g g a c t c g a g c t c a a g c c t c c c a c g a a c t c g c a a c c c t g a c g g g aa g a c c c a g g t g a c c a t g g c t a c a t g c t g a c a g c c t a c g c g g a t c c a c a g c c t a c t g a t g a t c a g t c g a t g g g g t t g c g a g t t c g t g g g a g c a c g c c g c a a g t g t t g t a g t c c g t a c g c c a c g g a t g a g a c c g a g t c g t c a c c t g g g t c t t c c c g t c a g t t g a a c a a g aaa t g g c a a c t g c