（植物学专业论文）云芝与赤芝原生质体融合的研究.pdf

摘要 随着人们健康意识的提高和科学的发展，蕈菌作为一类既美味可口又具有医 疗保健功能的食品受到了人们的广泛欢迎。云芝和赤芝都是我国传统的名贵中药 真菌，其营养物质全面且药用价值高，具有抗癌、降血糖、有效提高免疫力等功 效，因此价格十分昂贵。 原生质体融合技术已成为蕈菌遗传育种中的重要手段之一。它扩大了物种之 间的杂交范围，使得远缘杂交成为可能，扩大了蕈菌的记忆库容。试验采用原生 质体融合技术，将云芝与赤芝的原生质体融合，并进行融合子的筛选和鉴定，以 期获得兼具云芝和赤芝优点的融合子。 试验研究了影响云芝和赤芝原生质体制备与再生几个主要因素，运用正交试 验，确定以培养5 d 的云芝菌丝体，用2 的溶壁酶，以o 6 m o l l 的m g s 0 4 为渗 稳剂，3 3 下酶解3 h 作为云芝原生质体的制备条件；以培养7 d 处于的赤芝菌丝 体，用1 5 的溶壁酶，以0 6 m o l l 的m g s 0 4 为渗稳剂，3 0 下酶解2 h 作为赤 芝原生质体的制备条件，获得数量最多、活性最高的原生质体，并且确定采用麦 芽糖1 0 9 、葡萄糖4 9 、酵母粉4 9 、琼脂5 5 9 ，以0 6 m 蔗糖作渗稳剂的再生培养 基其再生效果最好。 利用云芝和赤芝对潮霉素天然抗药性的差异，结合原生质体灭活作为融合子 筛选的依据，并在p e g 诱导下使两蕈菌原生质体融合下，得到了6 株生长良好 的融合株，融合率较低仅为1 7 6 x 1 0 。 通过对随机抽取的融合株f 5 与两亲本进行菌丝生长速度，液体生物量积累， 菌丝显微特征，菌落表型，d n a 含量的比较以及三者的拮抗试验，我们可以初 步确定该融合株确为云芝与赤芝原生质体融合的产物，且融合子f 5 更接近云芝。 关键词：云芝赤芝原生质体制各再生融合 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) i i i a b s t r a c t w i t ht h ei n c r e a s eo fp e o p l e sh e a l t h yc o n s c i o u s n e s sa n dt h ed e v e l o p m e n to f s c i e n c e ，m u s h r o o mi sp o p u l a r l yw e l c o m e da st h ed e l i c i o u sf o o do ff u n g iw i t ht h e f u n c t i o no fh e a l t hc a r e p o l y s t i c t u sv e r s i c o l o ra n dg a n o d e r m al u c i d u ma r eb o t ht h e t r a d i t i o n a lf o o dt r e a s u r eo fl a n dw i t ho v e r a l ln u t r i t i v em a t e r i a l sa n dh i g hm e d i c a l v a l u e ，w i t he f f i c a c yo fr e s i s t i n gc a n c e r ，l o w i n gd o w nt h eb l o o ds u g a ra n de n h a n c i n g n a t u r a li m m u n i t ye f f e c t i v e l y ，s ot h e ya r ev e r ye x p e n s i v e p r o t o p l a s tf u s i o nt e c h n o l o g yh a sb e e no n eo ft h eh e r e d i t ya n db r e e dm e a n s i t e n l a r g e dh y b r i d i z er a n g eb e t w e e ns p e c i e s ，m a d ef a rc o n d i t i o n i n gc a u s eh y b r i d i z e b e c o m ep o s s i b l e ，e n l a r g e dt h em e m o r yr e s e r v a t i o no fm u s h r o o m t h er e s e a r c hu s e d p r o t o p l a s tf u s i o nt e c h n o l o g ym a k ep o l y s t i c t u sv e r s i c o l o ra n dg a n o d e r m al u c i d u m p r o t o p l a s tc o m et o g e t h e r ，a n dc a r r i e dt h ef u s a n to nf i l t r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n t h e a i mw a st og e tt h ef u s a n ti np o s s e s s i o no f p a r e n t s m e r i t s s o m em a i nf a c t o r si nt h ec o u r s eo fp o l y s t i c t u sv e r s i c o l o ra n dg a n o d e r m a l u c i d u mp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r t h r o u g h o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，w ed e f i n e dt h a tu s i n g5 dc u l t i v a t e dm y c e l i ao fi nl i q u i ds t a t i c s t a t e ，w h i c hw a st a k e na sp r o p e rs t r a i na g e ，d i g e s t e di n t o2 l y w a l l z y m ea t3 0 cf o r 3 h ，w i t ho s m o t i cp r e s s u r e s t a b i l i z e ro f0 6 m o l lm g s 0 4a so p t i m a lp r e p a r a t i o n c o n d i t i o n ；u s i n g7 dc u l t i v a t e dm y c e l i ao fi nl i q u i ds t a t i cs t a t e ，w h i c hw a st a k e n 硒 p r o p e rs t r a i na g e d i g e s t e di n t o1 5 l y w a l l z y m ea t 3 3 cf o r2 h , w i t ho s m o t i c p r e s s u r es t a b i l i z e ro f0 6 m o l lm g s 0 4a so p t i m a lp r e p a r a t i o n c o n d i t i o n i nt h i s c o n d i t i o n ，t h eq u a n t i t ya n dq u a l i t yi st h eb e s t b o t hk i n d so fp r o t o p l a s tr e g e n e r a t i o n e f f e c t sw i l lb eh i g h e r ，a d d i n glo gm a l t o s e ，4 9g l u c o s e ，4 9y e a s te x t r a c t i o nt ot h e c u l t u r em e d i a , 5 5 9a g a rw i t h0 6 m o l ls u c r o s eu s e da ss t a b i l i z i n go s m o t i cp r e s s u r e u s i n gd i f f e r e n ta p p e a r a n c eb e t w e e np o l y s t i c t u sv e r s i c o l o r a n dg a n o d e r m a l u c i d u mo nh y g r o m y c i nba n dh e a ti n a c t i v a t e dt e c h n i q u e ，w ed i df u s i o ne x p e r i m e n t b e t w e e nt h ea b o v et w os t r a i n su n d e rp e g , c a 2 + s y s t e m t h i r t e e nf u s i o ns t r a i n sw e r e s e l e c t e d t h ef r e q u e n c yo ff u s i o nw a sa b o u t1 7 6 10 一 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编g - 0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) i v c o m p a r e dt h ep h e n o m e n at h a tm y c e l i ag r o w t hs p e e d ，b i o m a s so fm y c e l i u mi n l i q u i dc u l t u r em e d i a ，c o l o n ya n dm y c e l i am i c r o c o s m i cf e a t u r e ，c o n t e n t so fd n a a n d a n t a g o n i s t i cr e a c t i o nb e t w e e nr a n d o m l ys e l e c t e dt h ef u s a n tf 5a n dt h ep a r e n t so n b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，w eo b s e r v e dt h a tt h ef u s a n to r i g i n a t e df r o mt h et w op a r e n t s f u s i o na n dt h ef u s a n ti sc l o s et op o l y s t i c t u sv e r s i c o l o r k e yw o r d s ：p o l y s t i c t u sv e r s i c o l o r ；g a n o d e r m al u c i d u m ；p r o t o p l a s t ；p r e p a r a t i o n ； r e g e n e r a t i o n ；f u s i o n 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) v 独创性2 声明 本人卢明所甲交的论文是我个人在导师指导下进行的研究j ：作及取得的研究成果。尽我 所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含为获得墨鲞! 至蕉盘堂或其它教育机构的学位或证二怙而使川过的材料。 与我一同j ：作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：墨逸篷 日期：a 塑心9 学位论文版权使用授权书 本人完全了解大泮师范人学有关保留、使川学位论文的规定，即：学校有权将学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采川影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编以供夯阅和借阅。同意学校向国家有关部j j 或机构送交论文的复印1 j ，| ：和磁盘。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：墨速窭l 导师签名： 日期：翟誓彩! ，星口 第一章前言弟一早刖西 1原生质体及其融合技术的发展概况 原生质体这一术语来自于细胞生物学，把它应用到微生物上，是由1 9 5 2 年s a l t o n 用溶菌酶酶解微球菌细胞壁开始的。w e i b u l l 1 】等在1 9 5 3 年首先提出 了原生质体定义，即原生质体由细胞核、细胞质、质膜几部分组成。各部分彼 此密切联系、相互影响而构成一个有机整体，担负着细胞的所有生命活动。去 壁后的原生质体依然具有原生质膜和整体基因组，是一个具有生理功能的单 位。其最大优点之一就是全能性比较容易体现，从而为以其为媒介的生物技术 提供了极大的可能性。 原生质体融合技术( p r o t o p l a s tf u s i o np r o c e s s ) 主要就是将通过物理或化学方 法去除细胞壁后的不同遗传类型的原生质体，在融合剂或其它条件介导下进行融 合，使包括核基因、线粒体基因等在内的整套基因组进行交换与重组，从而产生 新的遗传类型品种的基因工程育种技术。 原生质体融合技术起源于2 0 世纪6 0 年代，1 9 3 8 年m u l l e r 观察到了肿瘤 细胞多核细胞融合现象。1 9 5 0 年，法国学者b a r s k i 研究观察到两种细胞混合培 养自发产生细胞融合现象。1 9 5 8 年，法国学者b a r s k i 研究小组在两种不同类型 的动物细胞混合培养中观察到细胞自发融合现象。同年，日本的o k a d a 2 】发现 并证明了紫外灭活仙台病毒可诱发体内艾氏腹水癌细胞彼此融合1 9 5 3 年， w e i b u l l 等首次用溶菌酶制备得到巨大芽孢杆菌的原生质体，并提出了原生体的 概念【3 1 。1 9 5 7 年，e d d y 等首次用蜗牛消化液制备得到酵母菌原生质体【4 1 。1 9 5 8 年，e m m e r s o n 等用蜗牛酶加半纤维素酶制备得到丝状真菌的原生质体。19 6 0 年，英国c o c k i n g 教授领导的小组用真菌纤维素酶制备出了番茄幼根细胞的原 生质体【5 】，酶法制备原生质体的成功为植物和微生物的细胞融合开辟了道路。 1 9 6 0 年法国的k a r s k i 研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了 自发融合现象，从而开始了原生质体融合的探讨。1 9 7 4 年，加拿大籍华人高国 楠【6 】发现聚乙二醇( p e g ) 在c a 2 + 参与下能促进植物细胞原生质体融合。这一发现 极大的促进了细胞融合技术的发展。1 9 7 7 年，s i p i c z k i 与f e r e n c z y 首次实现了 酵母原生质体的融合f 7 1 。1 9 8 1 年，z i m m e r m a n n 等报道了电场诱导原生质体融 合法。1 9 8 8 年，张闻迪报道了激光诱导融合法【8 】。由于一系列方法的提出和不 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) 1 通过猕猴桃属种间原生质体融合，获得了中华猕猴桃( a c h i n e n s i s ) 与狗枣猕猴桃 ( a k o l o m i k t a ) 的4 个体细胞杂种无性系再生植株辛化伟【1 3 】通过非对称杂交，获 得水稻与大黍( p 疵c l l mm a ) 【i m u m ) 的体细胞杂种及后代据不完全统计，通过体 细胞杂交，至少己获得4 4 个种内、1 0 3 个同属异种，4 8 个属问、5 个科间的杂种 植物，其中非对称融合的体细胞杂种在9 0 以上。 1 3 微生物原生质体融合的进展 微生物原生质体融合起源于2 0 世纪5 0 年代，2 0 世纪7 0 年代在研究植物原 生质体融合时，发现了高效促融剂聚乙二醇( p e g ) ，随后，f e r e n z y 首先证明p e g 对真菌细胞的促融作用，这一发现极大促进微生物原生质体融合技术的发展。此 后，相继开展了其他多种微生物的原生质体融合，使酵母菌、霉菌、细菌、放线 菌等多种微生物原生质体融合技术逐渐形成了一个新的实验体系。据b e r d yc ( 1 9 7 4 ) 报道，目前己知的微生物来源的抗菌素6 5 0 0 余种，6 0 左右是链霉菌产生 的。自s e n i l o n t i ( 1 9 5 5 ) 将天蓝色链霉菌杂交试验取得成功后，近3 0 年，许多产 抗生素链霉菌杂交重组相继获得成功。利用链霉菌原生质体融合不仅克服了种、 属间杂交的“不育性”，大大提高了基因间重组的频率，促进了放线菌的遗传学研 究，而且也为农用抗生素的育种提供了有效的手段，提高了农用抗生素的产量， 并能产生新的抗生素类型。微生物原生质体的研究近几年发展迅速【1 4 1 5 ，1 们，特别 是近3 0 年来，由于研究方法和手段的不断改进与更新，微生物原生质体的研究 已经形成了一整套的原生质体技术，进入了一个崭新的阶段。 1 4 大型真菌原生质体融合的进展 原生质体技术在食用菌中的应用最早见于d 耐e s 和w 色s s e l s 对双孢蘑菇 似g 口，肠a6 如p o ，姗) 和草菇( 场m 椴p f f 口阳 位c 阳) 的原生质体制备和分离【1 7 】。s n u 1 1 l 【 是研究食用菌原生质体的先驱之一。自1 9 6 5 年他首次成功地制备了采绒革盖菌 ( c o r i o l u s v e r s i c o l o r ) 的原生质体并观察到其自发融合。 近几十年来，已从6 0 余种食用菌中成功制备出原生质体，并且跨目、跨属、 跨种的食用菌原生质体融合也取得了成功，详见表1 2 。中国的食用菌原生质体 研究起源于8 0 年代中期，主要成果见表1 3 。 表1 1 食用菌原生质体融合的某些报道 t a b l e1 - 1s o m er 印o r t so fe d i b l em n 百p r o t o p l a s t6 j s i o n 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) 菌株 亲本问 文献 关系 c o p r i n u sc i n e r e u s c o p r i n u sc i n e r e u s o u d e m a n s i e l l nm u c i d a s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p a r i u m c o p r m u sm a c r o r h i z u s p l e u r o i u so s t r e a i u s p o l y s 眈u sv e r i c o l o r t r i c h o l o m am e t s u t a k e p l e u r o t u ss p p l e u r o i u so s t r e a i u sx p c o l u m b i n u s p o s t r e a t u s 即u l m o n a r i u p o s t r e a t u sx ps a j o r - c a j u p c o l u m b i n u sx p p u l m o n a r i u p c o l u m b i n u sx ps a j o r - c a j u p p u l m o n a r i ux ps a j o r - c a j u p l e u r o i u so s t r e t u sx p f l o r i d a p c o r n u c o p i a ex p f l o r i d a p s a l m o n e o s t r a m i n e u sx p f l o d a p o s t r e a i u s xp s 由o r - c 国u a u h c u ，口r i aa u r i c u l ax a p o l y t r i c h a a u r i c u l a r i aa u r i c u l a a p o l y t r i c h a g a n o d e r m aa p p ，口n a m mx g 1 u c i d u m p l e u r o t u sa s t r e a t u sx p c o r n u c o p i a e p l e u r o t u sa s t r e a t u sx p s a j o r c a j u 户ps a l m o n e o s t r a m i n e u s g a n o d e r m aa p p l a n a t u mx g l u c i d u m l e n 砌l 岱e d o d e sx l s u b n u d u s e l f v i n g i aa p p l a n a t ax g a n o d e r m aa p p l a n a t u m p l e u s o t u so s t r e a t u sx f l a m m u l i n av e l u t i p e s 种内o h b a e t a l ( 1 9 8 8 年) 种内 y a n a g ie t a l ( 1 9 8 8 年) 种内h o m o l k a ( 1 9 8 8 年) s o n n e n b e r g & w e s s e l s ( 19 8 7 种内年) 【1 7 】 种内p a n e t a l ( 1 9 9 1 年) 种内 g o l de t a l ( 1 9 8 9 年) 种内k i g u c h i i & y a m a d a ( 1 9 8 5 年) 种内o h a m a s a ( 1 9 8 6 年) 种内s t r u n k ( 1 9 6 7 年) 种内 a b e e t a l ( 1 9 8 2 年) 种内 g o e t a l ( 1 9 8 9 年) 种间t o y o m a s u & m o r i ( 19 8 9 年) 种问t o y o m a s u & m o r i ( 19 8 9 年) 种间t o y o m a s u & m o i l ( 19 8 9 年1 种间t o y o m a s u & m o i l ( 19 8 9 年) 种间t o y o m a s u & m o r i ( 19 8 9 年) 种间t o y o m a s u & m o r i ( 19 8 9 年) 种问 y o oe t a l ( 1 9 8 4 年) 种间 y o o ( 1 9 9 2 年) 种间y o o e t a l ( 1 9 8 4 年) 种间y o o e t a l ( 1 9 8 4 年) 种间l u o e t a l ( 1 9 9 1 年) 种间 y a n g e t a l ( 1 9 9 1 年) 种间p a r ke t a l ( 1 9 8 8 年) 种间 o g a w a ( 1 9 9 2 年) 种间 z h a o & l i u ( 1 9 9 1 年) 种间t o y o m a s u e ta l ( 1 9 8 6 年) 种间 u m e t a l ( 1 9 8 8 年) 种间p e n g & l u ( 1 9 8 8 年) 种间p a r ke t a l ( 1 9 8 8 年) 属间 z h a o & l i u ( 1 9 9 1 年) 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) 4 型燮型咝坐奎 引自刘祖同，罗信昌食用蕈菌生物技术及应用 表1 3 国内的食用菌原生质体研究情况 t a b 1 - 3r e c e n ts t u d i e so nf u n g u sp r o t o p l a s ti nc h i n a 1 9 8 6 黑木耳 1 9 8 6金针菇 1 9 8 7光木耳、毛木耳 1 9 8 7 草菇 1 9 8 9 凤尾菇 罂 1 9 8 9 糙皮侧耳、佛罗里达侧耳 霍 1 9 8 9 ，1 9 9 0 ，1 9 9 2 食用菌的原生质体再生无性系出菇 犁 能力强、产量高，早熟。 备 能力强、产量高，早熟。 及 再 生 1 9 9 9 1 9 9 9 2 0 0 0 2 0 0 l 2 0 0 l 灵芝 羊肚菌 香菇 鲍鱼菇 大球盖菇 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) 阢一俊( 1 9 8 6 ) 徐天惠( 1 9 8 6 ) 【1 8 1 罗信昌( 1 9 8 7 ) 廖汉泉( 1 9 8 7 1 廖汉泉( 1 9 8 9 ) 【1 9 】 石国昌( 1 9 8 9 ) 【2 0 】 肖在勤( 1 9 8 9 ) 【2 1 1 、潘迎捷 ( 1 9 9 0 ) 2 2 1 、刘振岳 ( 1 9 9 2 ) 2 3 】 李刚( 1 9 9 9 ) 【2 4 】 刘士旺( 1 9 9 9 ) 2 5 1 朱朝辉( 2 0 0 0 ) 2 6 1 何强泰( 2 0 0 1 ) n 培生( 2 0 0 1 ) 【2 7 】 5 2 原生质体融合技术一般路线及方法 原生质体融合技术是现代生物工程中重要的遗传操作技术之一，一般来说整 个过程主要包括原生质体的制备、原生质体融合和原生质体融合子再生三个部分 ( m u r a l i d h a r ，2 0 0 0 年) 。在实际生产和科研工作的应用中，原生质体融合大致包 括以下几个步骤： 2 1 亲本标记 原生质体融合后，如何将亲本菌株与发生融合后的杂种细胞有效的分离是原 生质体融合技术的关键和难点之一，需根据实验目的和材料的特殊性加以设计。 当前采用的亲本标记主要为下列几种： 营养缺陷型标记营养缺陷型标记是一种传统有效而直接的方法。将亲本菌 株通过诱变处理后，筛选出对某些营养物质合成途径受阻的突变型，双亲为不同 的营养缺陷型，原生质体融合后于基本培养基上选择融合子，单亲原生质体由于 丧失了合成某种物质的能力，在基本培养基上不能再生，单亲融合的原生质体也 不能再生。双亲原生质体融合后，缺陷的遗传物质得到互补，可以恢复为野生型， 从而在基本培养基上可正常生长。这一方法已广泛地用于杂种细胞的选择性分 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) 6 天津师范人学硕 ：研究生毕业论文 离，获得了许多有价值的杂种菌株。营养缺陷型标记是一种传统有效而直接的方 法。它具有融合子的检出准确可靠，实际操作简单易行，有利于进行遗传分析等 优点。但也存在某些缺陷，比如筛选营养缺陷型菌株费时费力，筛选出的菌株多 数会丧失或降低本身的一些优良性状。另外，有些融合子虽然双亲的遗传物质得 到了重组，但在强大的选择压力下可能有部分不能萌发。因此在选择出发菌株时， 应注意选择发生正突变的营养缺陷型作为菌株。 抗药性标记抗药性是微生物各菌种自身的特性之一，是由遗传物质决定 的。抗药性标记是根据不同菌种对某一种药物的抗性存在差异而进行的，利用这 种差异或与菌种的其它特性结合起来就可以对融合子进行选择。在细菌中抗药性 基因往往是由质粒所携带，在食用菌中抗药性的遗传机制还不清楚，可能与线粒 体上的抗性基因有关。1 9 8 4 年布拉德肖( b r a d s h a w ) 佩贝迪( p e b e r d v ) 首先利 用这种方法在a p e 晒1 1 u sn i d u l a n s 和a r e g u l o s u s 融合中选择出了融合子【3 6 3 7 1 。王 淑珍等2 0 0 3 年利用松茸与香菇分离纯化的再生原生质体对潮霉素自然抗药性的 差异，结合原生质体灭活为融合子筛选提供了依据。这种抗药性在遗传上很稳定， 能够很好的保持，而且利用蕈菌有较强的抗细菌类抗生素的特点，培养基中加入 这类药物还可以在一定程度上减少污染。但这类标记不能在各物种中通用，这就 限制了原生质体融合的亲本选择范围，而且药物的浓度过高会使融合频率降低， 浓度过低则会使亲本生长，影响融合子的检出。 灭活标记该方法利用物理或化学的手段，使亲本细胞的某些成分被破坏， 抑制或阻断某些重要代谢途径，因而细胞不能在培养基上生长。灭活不是彻底杀 死，原生质体的染色体仍然保持复制、重组能力，融合后原生质体的细胞核和线 粒体等仍具有转化和互补功能。潘迎捷等( 1 9 8 8 ) 和戴秉丽等( 1 9 9 5 ) 成功地把灭活 原生质体融合技术应用到香菇育种工作中，梁枝荣则研究了香菇、拟囊体侧耳、 裂褶菌等品种的原生质体处理温度及处理时间对灭活率的影响【3 8 】。灭活原生质 体的机理一般被认为是紫外线使菌株的d n a 发生突变；热的作用可使细胞内有 些功能蛋白、酶蛋白变性失活；化学药剂的作用能不可逆地抑制细胞代谢过程的 关键酶，使之失活。灭活标记方法没有物种特异性，被认为是更有前途的通用标 记方法。贺建超等( 2 0 0 2 年) 通过将黑木耳原生质体热灭活，毛木耳原生质体紫外 线灭活，以p e g 为融合剂诱导二者融合，从再生平板上挑选出了融合子再生菌 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) 7 株；周东坡等0 9 9 9 年) 通过紫外线照射灭活原生质体融合选育了啤酒酵母新菌株 3 9 1 o 荧光染色标记以酶解法制备原生质体时，向酶解液中加入荧光色素，使双 亲原生质体分别携带不同的荧光色素。在荧光显微镜下将不同色原生质体成对吸 出后培养，得融合子。成亚利等( 1 9 9 7 年) 用异硫氰酸荧光素( f i t c ) 荧光标记原生 质体融合技术对金针菇原生质体进行了融合研究，得到了融合菌株【矧。同时， 该组人员也对紫孢侧耳和糙皮侧耳通过荧光标记法进行了融合研究，也得到并验 证了融合子，证明该方法简便、直接、无需亲株带有选择性遗传标记，因而具有 较大的优越性。如果能找到对细胞无毒性的荧光色素，这种标记法在各物种上都 能使用，不需要标记菌株。 自然生态标记食用菌的不同种、属之间，甚至种内，由于来源的地理区域 和生态环境不同，长期的进化选择，许多品种形成了其独特的对生态和生理环境 的适应性。如耐高温菌株，常见大型高等真菌的最适栽培温度为2 5 左右，高 于3 0 便不能生产，而某些特殊种类的耐高温菌株最适生长温度在3 5 以上， 因而可以作为标记。潘迎捷等( 1 9 8 9 年) 以中高温大叶型和中温中叶型的香菇单核 菌丝为亲本，以双核菌丝形成锁状联合为筛选的自然标记，在国内首次获得两株 香菇种内融合子，融合子在木屑培养基上发育形成子实体，并提出可采用以单核 菌丝作亲本，以双核菌丝是否形成锁状联合作为自然标记的筛选方法。 以上是原生质体融合出发菌株的选择和标记中常用的一些方法和手段，在实 际应用中，常常是各种方法相互结合使用。另外，在出发菌株的选择上需注意菌 丝的特性，最好用单核菌丝，因为多核菌丝不利于融合性状的表达，且融合子不 够稳定。 2 2 原生质体的制备与再生 原生质体的制备与再生常受菌丝培养方式、菌丝体处理、菌龄、酶的选择、 酶解条件、渗透压稳定剂等方面的影响。 菌丝培养方式菌丝体经过斜面培养基活化后，接入液体摇瓶培养基，待生 长至对数期时使用。由于菌丝体在液体摇床培养时常形成菌丝球，减少内部菌丝 与酶解液的接触机会，影响原生质体的制备。所以，常采用液体静置培养法。 菌丝体处理用于预处理的材料一般是还原剂，包括二硫苏糖醇( d t t ) 和巯 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) 基乙醇。如吴坤陆等( 2 0 0 1 年) 【4 l 】的实验表明，酶解前添加3 m l0 1 的e d t a 巯基乙醇p b 液预处理4 0 r a i n ，克鲁维酵母的原生质体形成率从8 0 提高到9 4 ， 但预处理使原生质体的再生率略有下降。另外，林红雨等( 1 9 9 9 年) ，采用在对数 生长前期加青霉素和甘氨酸的预处理方法，使棒杆菌菌体表面的肽聚糖单位之间 的交联程度降低，整个肽聚糖层变疏松，因而增加了对溶菌酶的敏感性，提高了 棒杆菌原生质体的制备率；同时通过酶解1 0 m i n 后补加e d t a 的方法，改变酶 解环境中的离子强度和渗透压，提高了欧文氏茵原生质体的制备掣4 2 1 。c o s t e r o n j w 等( 1 9 6 7 年) 报道，在高渗t r i s 溶液中添加1 5 聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 等原生 质体扩张剂，有助于制备原生质体，添加0 0 2 m o l l 镁离子，有利于原生质体的 稳定。 菌龄由于菌龄的长短与细胞壁的组成和构造直接相关，对原生质体的形成 及再生有着很大的影响，而且不同食用菌的最适菌龄各不相同，因此进行菌龄试 验十分必要。一般认为，菌龄过长或过短均不利于原生质体的形成及再生。过短 的菌龄由于其细胞壁发育不完全，较易被脱壁酶脱去细胞壁而形成原生质体，而 其再生则由于其造壁功能不完善而难以再生。过长的菌龄则相反，对原生质体的 形成不利却有利于再生。许多文献资料表明：考虑到原生质体形成及再生的综合 因素，用于食用菌原生质体制备最适菌龄往往在对数生长期之间。 酶的选择大型高等真菌细胞壁的主要成分为纤维素、几丁质( s 葡聚糖) 等， 因而制备大型高等真菌原生质体应采用适当的纤维素酶类。对于不同种属的蕈 菌，由于其细胞壁的化学组成不同，制备原生质体时所需的酶类也有差异。有研 究表明使用单一酶类效果往往不理想，通常使用多种混合酶类。目前，酶解细胞 壁常用的酶有：纤维素酶、蜗牛酶、溶壁酶、几丁质酶、p 葡糖苷酸酶等。使用 最多的两种真菌脱壁酶是：美国s i g m a 公司的n o v o z y m e 2 3 4 和广东微生物所生 产的溶壁酶。 在酶液的浓度方面，过低或过高的酶浓度都不利于原生质体的制备。酶液浓 度过低，菌丝体的细胞壁不易被酶解，从而影响原生质体的释放数量；酶液浓度 过高，脱壁作用过于强烈，会对原生质体的膜系统造成伤害，甚至引起原生质体 的破裂【4 3 1 。另外过高的酶浓度，往往对原生质体的再生不利。现在一般采用的 酶浓度般在1 5 - 3 o ( w ) 之间。 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) 9 渗透压稳定剂渗稳剂分为无机和有机两大类。其浓度一般在0 5 o 7 m 。 无机类渗稳剂一般有m g s 0 4 、n a c l 、k c l 等；有机类渗稳剂一般有甘露醇、蔗 糖和葡萄糖等。不同的渗稳剂对原生质体得率影响很大。一方面在于，失去细胞 壁的原生质体对外界压力十分敏感，需要渗稳剂来稳定膜内外压力差。另一方面 在于，某些特殊的脱壁酶需要相匹配的渗稳剂才能充分发挥其脱壁作用。很多文 献表明，无机类的渗稳剂对原生质体的制备更为有利，而有机类的渗稳剂对原生 质体的再生更为有利。另外，渗稳剂的种类和脱壁酶还具有相关性，这可能是渗 稳剂中的某些离子能够提高或抑制脱壁酶的活性。 酶解条件适宜的酶解时间、温度、酶液p h 值等条件能使脱壁酶类处于最 佳活力状态，反之则会影响原生质体制备及再生。酶解时间与原生质体得率呈现 正态相关性，但是需要注意的是，获得最高得率的酶解时间不一定是能够得到最 高再生率的酶解时间。这是因为原生质体细胞壁再生需要一些残留胞壁的引导， 而酶解太彻底会使之失去细胞酶解残余物【删。一般的酶解时间在2 4 h 。酶液 的p h 在5 6 左右，过酸过碱均会使酶的蛋白构象变异甚至酶失活。温度偏低时， 原生质体形成慢。但温度偏高时，原生质体极易破裂，得率反而下降。据推测， 过高的酶解温度、酸度、过长的酶解时间均易破坏原生质体的膜结构，导致原生 质体变形、破裂【4 5 1 。 2 3 原生质体融合方法 促进原生质体融合的方法主要有生物学法、化学融合剂法、电处理融合法等 三类，而且各有其特点。 ( 1 ) 生物学法，采用病毒促进融合，如仙苔病毒、天花病毒、副流感病毒等 能诱导融合。仙苔病毒最早用于动物细胞融合。 ( 2 ) 化学融合剂法，采用的化学融合剂包括聚乙二醇( p e g ) 、甘油醋酸酯等化 合物，其中聚乙二醇( p e g ) 应用最为广泛，c a 2 + 的存在可促进原生质体融合。p e g 应用最广泛，应用最多的是p e g 4 0 0 0 和p e g 6 0 0 0 两种。 ( 3 ) 物理融合法，其原理是基于双向电泳和膜的电降解，己成功的应用于植 物、酵母哺乳动物细胞，此方面具有操作简单等优点。 融合剂诱导法融合剂的种类很多，一般分为生物融合剂和化学融合剂，生 物融合剂主要是一些病毒类，但由于存在安全性及融合效率低等原因未在大型高 基金项目：天津市科学技术委员会项目( 编号：0 6 z h c x n c 0 5 9 0 0 ) l o 等真菌原生质体融合方面使用。化学融合剂有n a c l 、k c l 和c a ( n 0 3 ) 2 等，但 融合频率都很低。最成功最有效并且仍为人们经常使用的化学融合剂是聚乙二醇 ( p e g ) ，聚乙二醇法是1 9 7 4 年由量乙a o 和h i c h a y l u l ( 创立的，其主要过程为细胞凝 聚和膜融合，这一融合剂的使用使原生质体技术跃上了新的台阶，大大提高了融 合频率。1 9 8 9 年，l c o y o z u l ( a 【删用p e g 法在水稻上获得了胞质雄性不育系。1 9 9 5 年，夏光敏等【4 7 】首先利用小麦与高冰草的对称融合获得了杂种植株。1 9 9 6 年周 爱芬等4 8 1 的小麦与毛麦、夏光敏【4 9 铷l 的小麦与羊草新麦草以及高冰草的不对称 融合也相继成功。至1 9 9 9 年，夏光敏、向风宁等【5 1 】亦用p e g 法诱导普通小麦 与紫外线照射的高冰草原生质体融合，产生具有优良性状的f 2 代穗系。陈曦、 工丽莉等也用p f g 处理烟草n c 8 9 和香料烟b a s m a 种间原生质体，融合得到具 有双亲特征的烟草苗。肖在勤等( 1 9 9 8 年) 以金针菇和风尾菇的双核异核菌株为亲 本，将热灭活的凤尾菇原生质体以p e g 为融合剂，在高钙、高p h 值条件下与 金针菇原生质体融合，得到了融合子菌株。 尽管p e g 融合存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较低及经验性大 等缺陷，但其仍不失为一种简单便捷的高效融合法。 电融合法电融合技术的原理是在短时间强电场作用下，细胞膜发生可逆性 电击穿，瞬时失去其高电阻和低通透性，然后在数分钟后恢复原状，当可逆电击 穿发生在两个相邻细胞接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融 合。该法操作简单、融合率高，而且对细胞不会产生毒性，缺点是融合子的存活 率低。1 9 7 8 年至1 9 8 0 年，z i m m e m a i l i l 等人【5 2 - 5 3 】报道了电融合( c e ue l e c t i 嘶o n f u s i o n ) 技术。以后的几年里人们把这项新的融合手段从动物、植物扩展到微生 物的原生质体融合中【肄5 6 1 ，使原生质体的融合技术产生了新的突破。其原理是 原生质体在低强度交变电场作用下，通过电介质电泳首先形成细胞间的紧密接 触，然后在瞬间高压电脉冲作用下，使紧密接触区范围的细胞膜发生可逆性电击 穿，从而诱导细胞间相互融刽5 7 6 2 1 。电融合技术操作简单、电参数如脉冲强弱、 长短等容易精确地调节、无化学毒性、对细胞损伤小【6 3 】、可以免去细胞融合后 的洗涤程序、融合率高，可应 x 年) 应用原生质体电融合法得到了虎皮香菇野生种和金针菇栽培种的融合子，并 通过形态学和酯酶同功酶酶谱分析和r a p d 技术对融合子进行了鉴定。 细胞电融合根据其诱导细胞接触性质可分为：非特异性和特异性融合。非特 异性融合在融合时无法排除亲本的细胞自体融合而只进行双亲间的杂交融合，这 主要是因为细胞间的相互接触是无选择性的。实现细胞间的接触可分为物理聚集 ( 如磁场力、超声或机械方法) 和化学聚集( 如低浓度的p e g 、植物聚集素p h a ) 。 特异性融合在融合时可以控制自体融合从而可以得到更多的异源融合体。由于融 合所需的条件：建立胞间接触；接受区膜结构受扰动而紊乱，导致融合，然后恢 复。所以使其中的任意一步有特异性即可实现特异性融合，又因为击穿一般不具 有特异性，因而往往在细胞接触时实现其特异性。 激光诱导法激光融合诱导法所使用的设备昂贵、对操作技术要求高，是一 种有待于进一步完善的融合技术。1 9 8 4 年，s c l l i e r e n b e r g 首次报道利用微束激光 成功地进行了细胞融合实验。1 9 8 7 年始，该技术迅速发展起来，并很快被应用 在动物细胞及植物原生质体的融合中【6 9 。7 0 】。然而当激光微束技术应用于微生物 原生质体融合时，却丧失了高度选择性的优点。 2 4 原生质体的再生 在添加了渗稳剂的培养基中，原生质体再形成有生活能力的菌丝细胞的过程 称为再生，它受原生质体的来源部位、生理状态以及酶解时间、渗稳剂种类和浓 度以及再生培养条件的影响。原生质体再生过