（动物学专业论文）海带硫酸多糖的提取及抗肿瘤研究.pdf

摘要 摘要 海带( l a m i n a r i a j a p o n i c aa r e s c h ) 是褐藻f ( p h a e o p h y t a ) 的一种大型海 藻，它作为一种重要的海生资源，其食用与药用价值很早就为世人所知。现 有研究发现从海带中提取的海带硫酸多糖( l a m i n a r i aj a p o n i c ap o l y s a c c h a r i d e s ) 是一种特有的含有硫酸酯的天然活性多糖，具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、 抗血栓、提高免疫力等活性，有很好的医药应用价值。本论文以海带为原料， 进行海带硫酸多糖的提取及其对恶性脑胶质瘤的抑制研究，并从凋亡相关基 因表达的角度探讨其可能机制。 研究目的：从海带中提取海带硫酸多糖，以探讨海带硫酸多糖对大鼠胶 质瘤的体外增殖、细胞凋亡及细胞周期的影响。 研究方法：乙醇沉淀法提取海带硫酸多糖，用a b 8 0 大孔吸附树脂柱去 除色素；采用相差显微法观察c 6 细胞形态的变化，细胞计数法检测细胞抑 制率；用h o e c h s t 3 3 2 5 8 染色法，在荧光显微镜下观察细胞核的形态变化和 凋亡小体：比色法测定谷胱甘肽转移酶的活性；免疫荧光结合激光共聚焦扫 描显微技术测定细胞中p 5 3 的表达变化；流式细胞术测定体外培养的c 6 细 胞在药物处理之后细胞周期的变化。 研究结果： 1 、经乙醇沉淀并结合a b 一8 0 大孔吸附树脂提取得到较纯的海带硫酸多 糖，经苯酚一硫酸法测定粗多糖的含量为2 9 2 。 2 、相差显微镜观察显示：对照组的c 6 细胞生长旺盛，形态正常。而实 验组细胞生长缓慢，细胞形态较小且变化较大，细胞空泡大量增多， 多呈圆形。细胞数量随着药物浓度的增加和时间的延长而减少，培养 液中出现较多的漂浮的死细胞。 3 、细胞计数法显示：随着药物浓度的增加和时间的延长，细胞数明显减 少，加药7 2 h 后多糖对细胞的抑制率高达9 8 9 ( p o 0 1 ) 。 4 、用荧光显微镜观察：对照组细胞的细胞核染色均匀，形态正常：实验 组细胞的细胞核呈现典型的凋亡细胞形态学特征，染色质浓缩靠近核 膜呈新月体形，细胞表面出现泡状突起，细胞核固缩，有凋亡小体出 摘要 现。 5 、g s t s 的活性检测显示：随药物浓度增加及时闻延长，g s t s 的活性降 低，具有明显差异( p o 0 1 ) 。 6 、p 5 3 的免疫荧光染色表明：实验组中p 5 3 表达量比对照组中高，且具 有明显差异( p ( o 0 5 ) 。 7 、流式细胞仪检测细胞周期显示：海带硫酸多糖可引起细胞周期阻抑在 g l ，s 期。 结论： 海带硫酸多糖可明显抑制大鼠胶质瘤c 6 细胞株的生长，并通过影响p 5 3 的表达及阻抑细胞周期促进c 6 细胞凋亡；海带硫酸多糖还可抑制谷胱 甘肽s 转移酶的活性。 关键词：海带硫酸多糖；提取；大鼠胶质瘤c 6 细胞：细胞周期； 细胞凋亡； p 5 3 ；谷胱甘肽一s 转移酶 n a b s t r a c t a b s t r a c t t h ek e l p ( l a m i n a r i aj a p o n i c aa r e s c h ) i sak i n do fl a r g e - s c a l ea l g ao f p h a e o p h y t a ，a so n ek i n do f i m p o r t a n ts e al - 鹳o n r c e ，i t sf - 0 0 da n dm e d i c a l v a l u ei s k n o w nf o rl o n gt i m e n o ws c i e n c es t u d y i n gf i n d st h a tl p se x t r a c t e df r o mk e l pi s o n ek i n do f n a t u r ea c t i v i t yp o l y s a c c h a r i d e sc o n t a i n i n gs u l f u r i ca c i de s t e r ，w h i c h h a sv e r yg o o dm e d i c a lv a l u ef o r “h a sa n t i c o a g u l a t i o n ，a n t i - t u m o u r ，a n t i v i l a l ， a n t i - t h r o m b i n , a n di m p r o v ei m m u n i t ya c t i v i t y t h ep a p e rt a k e sk e l pa sl a w m a t e r i a la n de x t r a c t sl p s t h ee x t r a c t i o nl p so nm a l i g n a n tb r a i ng a l o t i n o u s ( u m o u ri ss t u d i e d , a n dd i s c u s s e st h e p o s s i b i l i t ym e c h a n i s mf r o mt h em g i e w i t h e r i n gr e l e v a n c eg e n ee x p r e s s i o m o b j e e t i v e s ：t oe x t r a c tt h ec r u d ep o l y s a e e h a r i d ef r o ml a m i n a r ij a p o n i c a a n di n v e s t i g a t et h ee f f e c to f l p so np r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i si nc 6c e l l s m e t h o d s ： t h eo r n d ep o l y s a e c h a r i d ew a se x t r a c t e df r o ml a m i n a r ij a p o n i c ab ye t h y l a l c o h o lp r e c i p i t a t i o nm e t h o d , a n dt h e ni tw a st r e a t e dw i t ha b - 8 0m a c r o p o r o u s a b s o r p t i v er e s i n m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o nu n d e rt h ep h 蹴 c o n t r a s tm i c r o s c o p e ， c e l l c o u n t i n ga s s a yw a su s e dt oa n a l y z et h ec e l lp r o l i f e r a t i o no f c 6 c h a n g e si nc e l ln u c l e u sa n da p o p t o t i cb o d i e sw e r eo b s e r v e du s i n gh 3 3 2 5 8 s t a t 血gu n d e rt h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e c o l o r i m e t r i ea s s a yw a su s e dt od e t c c tt h ec o n t e n to f g s t s t h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fp 5 3w a sd e t e r m i n e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c e a s s a yu s i n gl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e f l o we y t o m e t r yw a su s e dt od e t e c tt h ec h a n g e sa b o u tt h ec e l lc y c l eo fc 6 a f t e r 口e m e dw i t hl p si nv i t r o r e s u i t s ： 1 l p se x t r a c t e df r o mk e l pi sp u r e rb ye t h y la l c o h o lp r e c i p i t a t i o na n d t r e a t e d 谢t ha b 一8 0m a e r o p o r o u sa b s o r p t i v er e s i n p h e n o l - s u l f u r i ca c i dm e t h o d a b s t r a c t s h o w e dt h ec f l k l ep o l y s a c c h a r i d eh a sa c a r b o h y d r a t ec o n t e n to f 2 9 2 2 t h er e s u l t so ft r y p a nb l u ed y e i n ga s s a ys h o w ：t r y p a nb l u ed y e i n ga s s a y w a su s e dt oa n a l y z et h ec e l lp r o l i f e r a t i o no fc 6 , t h ei n h i b i t i o nr a t ei s9 8 9 a f t o r 7 2h o u r st r e a t e dw i t hl p s ( p o 0 1 ) 一 3 o b s e r v e db yt h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ：1 1 瞎p h e n o m e n o no fa p o p t o s i s i so b v i o u sw h e nt r e a t e dw i t hl p s t h ec h r o m a t i ni na p o p t o t i cc e l ln u c l e u s a s s e m b l e sa n dt u r n st ot h ee d g e a n da p o p t o t i cb o d i e sc a nb es 嘲u n d e rt h e f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e 4 砧er e s u l to f t h ea c t i v i t yg s l ：t h ea c t i v i t yo f g s l si sl o w e ri nl p st h a n i nc o n t r o la n dt h e r ei so b v i o u sd i f f e r e n c e 5 1 1 蝣i m m u l l ef l u o r e s c e n c ed y i n gt e s to fp 5 3r e v e a l s ：n 玲e x p r e s s i o no f p 5 3i so b v i o u sh i g h e rc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l ( p o 0 5 ) 6 t h ec e l lc y c l eo f c 6u n d e rd i f f e r e n tc i r c u m s t a n c ew a se x a m i n e db yf a c s ： 1 1 坞c o l lc y c l eo f c 6u e a t e dw i t hl p si sa r r e s t e d i nt h eg 1 sp h a s e c o n c l u s i o n ：l p sc a ni n h i b i t 也ep r o l i f e r a t i o no fc 6c e l l sa n di n d u c et h e a p o p t o s i sb ya r r e s t i n gt h ec e l lc y c l ea n di n c r e a s i n gt h ee x p r e s s i o no fp 5 3 a n d l p sc a ni n h i b i tt h ea c t i v i t yo f g s i s k e yw o r d s ：p o l y s a c c h a r i d e so fl a m i n a r i a ( l p s ) ：e x t r a c t i o n ； a p o p t o s i s ：p 5 3 ：c e l lc y c l e ；g s t s 曲阜师范大学硕士毕业论文 简写说明 l p s ：p o l y s a c c h a r i d e so f l a m i n a r i a 海带硫酸多糖 1 3 6 ： r a t 毋i a lt u l t i o rc e l l 大鼠胶质瘤细胞 g s t s ：g l u t a t h i o n e $ - t r a n s f e r a s e s 谷胱甘肽s 转移酶 d m e m ：d u l b e c c e sm o d i f l e de a g l e sm e d i u m 低限量基础培养基 p b s ：p h o s p h a t es a l i n eb u f f e r 磷酸缓冲液 b s a ：b o v i n es 舢a l b u m i n 牛血清白蛋白 f b s ：f e t a lb o v i n es 唧m 胎牛血清 f i t c ：f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e 异硫氰酸荧光素 p i ：p r o p i d i u mi o d i d e 碘化丙啶 m d r ： m u l t i d r u gr e s i s t a n c e 多药耐药性 曲阜师范大学硕士毕业论文 海带硫酸多糖的提取及抗肿瘤研究 第一部分引言 l 研究背景 近几年，随着城市工业化程度的提高，环境污染日益严重。生存环境的 日益恶化，使得人类患各种肿瘤疾病的机率大大增加。据世界卫生组织 ( w l a o ) 1 9 9 8 年统计，目前全世界有肿瘤患者1 4 0 0 万人，每年新发病人数9 0 0 万，死亡近7 0 0 万。肿瘤已经成为严重威胁人类身体健康的“第一杀手 【”。 目前肿瘤疾病的治疗主要有：手术治疗( s u r g e r y t h e r s p y ) 、放射疗法 ( r a d i o t h w e a p y ) 、化学疗法( c h e m o t h e r a p y ) 等。这些方法对于一些肿瘤疾病确 实起到了较好的治疗作用，但也不可避免的带有一定的局限性。恶性脑胶质 瘤是颅内肿瘤中最常见的原发性肿瘤，约占颅内肿瘤的4 0 左右其治疗一 直是神经外科医生感到棘手的难题，虽然经手术切除、放疗及化疗，但预后 较差，存活期在一年左右。用于临床的放化疗药物对肿瘤细胞选择性较差， 在杀死肿瘤细胞同时也杀死正常细胞，且其毒副作用大。因此从天然产物中 寻找高效低毒的抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物研究的重要组成部分之一。大 量研究证明，从天然动植物中筛选抗肿瘤药物的命中率要比合成药高的多， 且其毒副作用更小。 多糖具有多种生理活性，已成为“糖生物学”时代生命科学的重点研究内 容。多糖应用于临床抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗氧化等方面都取得了良好 疗效。尤其是抗肿瘤方面，多糖作为一种免疫增强剂，不仅能有效激活免疫 细胞，提高机体免疫能力，而且对宿主正常细胞没有直接的毒副作用，因此 在辅助化疗放疗方面已成为肿瘤治疗的重要组成成分。 海带( l a m i n a r i a j a p o n i c a a r e s c h ) 又名昆布，是褐藻门( p h a e o p h y t a ) 海 带目( l a m i n a r i a l e s ) 海带科( l a m i n a r i a c e a e ) 海带属( l a m i n a r i a j 的一种 大型海藻。它作为一种重要的海生资源，其食用与药用价值，很早就为世人 所知。早在1 5 0 0 年前，我国人民就有食用海带和利用其治疗预防瘿瘤的记 2 曲阜师范大学硕士毕业论文 载，其药用价值在本草纲目、神农本草经和食物本草等传统医书 中都已有记载。海带多糖除具有降血脂、降血糖、抗血栓、抗菌抗病毒、抗 辐射等生物活性外，近来多项研究证明，海带多糖还具有明显抗肿瘤作用 2 1 海带的这些生物学功能在很大程度上都与海带中的生理活性多糖有关。细胞 毒性试验表明，海带多糖对机体没有毒副作用【3 】。 我国是世界上海带养殖量最大的国家，2 0 0 0 年我国海带的产量为8 3 万 吨，占海藻总产量的6 8 ，成为我国最丰富的海藻资源。因此，我们以海带 为研究对象，研究海带多糖的提取及海带多糖的抗肿瘤活性。 2 海带多糖成分及其结构 近年来，有关海带多糖的化学结构、生物活性及其在医学和药用价值等 方面的研究都取得了很大进展。海带作为一种重要的褐藻，目前己发现含有 三种褐藻多糖：褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉【4 】。 褐藻胶 a a 蕾no ra z g i n i ca c i d ) ，亦称海藻酸，由苏格兰化学家s a m f o r d 于1 8 8 1 年最先发现。现已基本证实，褐藻胶是褐藻共有的一种细胞问多糖， 由争l ，4 - d 甘露糖醛酸和叶l ，4 l 古罗糖醛酸组成的线性高聚物，包括水 不溶性的褐藻酸及各种水溶性和水不溶性的褐藻酸盐类，如褐藻酸钠，褐藻 酸铵，褐藻酸钙等。 褐藻糖胶( f u c o i d a n 简称f p s ) 又称岩藻聚糖或岩藻多糖硫酸酯，由 k y i i n 于1 9 1 3 年提取的一种存在于褐藻植物体细胞问的水溶性多糖物质，其 主要成分岩藻多糖，主要是以c l ，3 和c 1 ，4 及a l 岩藻糖4 硫酸酯聚合 物为天然的褐藻多糖硫酸酯，同时还含有不同比例的半乳糖、甘露糖、木塘 及葡萄糖醛酸。 褐藻淀粉( l a m i n a r a n ) 又称昆布多糖，由s c h r n i e d e b e r g 从褐藻中分离 出。它是一种水溶性d 葡聚糖，分子量较低，其结构为b - l ，3 - d 葡聚糖， 长链上有b 1 ，6 结合的分枝1 5 1 。 3 海带多糖的生物活性 3 1 抗肿瘤 多项研究证明，海带多糖具有抗肿瘤作用【2 】。海带多糖的抗肿瘤活性可 通过调动或增强免疫细胞的活性面达到抑制或杀死肿瘤细胞。它不仅能激活 曲阜师范大学硕士毕业论文 t 细胞、b 细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤性t 细胞、淋巴因予激活的 杀伤细胞( l a k ) 等免疫细胞还能促进白细胞介素2 1 ( i l2 1 ) 、自细胞介 素2 2 ( i l 2 2 ) 、肿瘤坏死因子( t n f ) 和干扰素( i f n ) 等细胞因子的生成，调 节抗体和补体。从多个方面抑制肿瘤。实验证明海带硫酸多糖激活小鼠腹腔 巨噬细胞，提高小鼠腹腔巨噬细胞的过氧化物酶活性及其吞噬功能，从而达 到抑制小鼠肉瘤s 1 8 0 的作用【6 】。另外，海带多糖还能直接抑制肿瘤细胞的生 长。将从海带等褐藻中提取的高纯度u 2 岩藻多糖类物质注入人工培养的骨髓 性白血病细胞和胃癌细胞后，其细胞内的染色体就会被胞内酶所分解，而正 常细胞不受影响1 7 。施志仪等 s l 研究发现海带褐糖胶可抑制人肝癌细胞进入 对数生长期，从而抑制肿瘤的生长。国外研究报道，海带多糖经肠道内细菌 发酵后能够抑制氨水、吲哚、石炭酸等复合物以及其他有害物质的形成，从 而减少结肠癌的产生唧。 3 2 抑菌、抗病毒 海带多糖具有抗逆转录酶病毒的作用，对胞疹病毒( h s v - i ，h s v 2 ， h c m v ) 、外衣病毒( s i n d b i sv i r u s ，s e n f l i k if o r e s tv i r u s ) 、副粘病毒( r s v ) 、 棒状病毒( v s v ) 等均有明显的抑制作用i 埘。辛现良等研究了海洋硫酸多糖 9 1 1 体外对h i v i 复制及体内对s i v 增殖的影响，结果发现9 1 1 日- - j 明显抑制h i v i x f f m t 细胞的急性感染和h 9 细胞的慢性感染，其半数有效浓度分别为 4 4 4m g 见和0 3 2m g l 1 1 】。尽管海带硫酸多糖在临床上还没有成功地用来抗 病毒感染，但他抗病毒的作用，使其成为有潜力的抗病毒药。 另外不同浓度的海带多糖对色毛癣菌、狗小孢子菌、石膏样毛癣菌、孢 子丝菌、絮状表皮癣菌等也有一定的抑制作用【i2 1 。实验证明，海带多糖能明 显增强宿主噬菌细胞的活性，进一步研究发现，注射海带多糖能明显增强鱼 类抵抗气单胞菌的能力【1 3 l 。 3 3 抗凝血、抗血栓 大量的研究表明，海带多糖具有抗血栓形成和溶解血栓的双重作用，在 溶栓的同时能防止新的血栓的形成。从海带中提取的褐藻糖胶，从结构上分 析，由于在其大分子链上含有羟基、羧基和硫酸基团，具有肝素的活性，因 此可以成为肝素的替代品之一。褐藻糖胶抑制凝血酶是利用其带有的硫酸基 4 曲阜师范大学硕士毕业论文 等负电荷基团与h c l l 结合，而褐藻糖胶2 h c i i 复合物又与凝血酶结合，从而 在空间结构上阻碍了凝血酶的活性。同时褐藻糖胶也结合在纤维蛋白原的碱 性氨基酸残基如精氨酸或赖氨酸上，使凝血酶无法接近并作用于纤维蛋白 原，因此，褐藻糖胶的抗凝血主要是增强h ci i 对凝血酶的灭活，抑制纤维 蛋白原的凝结，在预防血管再闭塞方面比其他抗凝血剂更有效【1 4 1 实验中采 用部分凝血活酶时间( a p l 叮) 、凝血酶原时间( p t ) 和凝血酶时间( t t ) 对其体外抗凝血活性作了初步的评价，结果表明褐藻糖胶具有一定的抗凝血 性1 1 5 1 。 3 4 抗辐射 通常，机体受照射后会引起食欲减退以及免疫缺陷。国内外研究表明多 糖能不同程度恢复受照射大鼠的细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫功能， 具有一定的辐射防护作用。经研究发现，经x 一光照射后，实验组( 多糖) 小鼠的白细胞、血小板及红细胞数目迅速恢复，并且多糖明显升高脾脏指数、 自然杀伤性细胞活性及脾脏淋巴细胞转换反应【1 6 1 。罗琼等表明海带多糖能够 显著地抑制受照射大鼠脾淋巴细胞凋亡率，降低细胞的凋亡反应，从而对辐 射引起的免疫功能的损伤起到保护作用。进一步研究发现海带多糖抗辐射作 用的可能机制之一是使凋亡抑制基因b e l - 2 表达上调、促凋亡基因b a x 蛋白表 达下调，b e l 2 b a x 比值明显增大防止脾淋巴细胞凋亡，从而促进免疫功能恢 复【l - 瑚。 3 5 抗氧化、防衰老 自由基是细胞正常代谢的产物，但过多的活性氧自由基通过脂质过氧化 反应破坏d n a 、抑制蛋白质合成。对各种生物大分子具有潜在的危险并导致 许多疾病的产生，如心血管疾病、动脉硬化、再灌注损伤、肝损伤和癌症等。 海带多糖的抗氧化活性包括它对自然氧化和超氧化的作用【1 9 1 。它不仅具有清 除活性氧的作用。还能够显著降低脂质过氧化物( l p o ) 的含量，提高过氧 化物酶( c a t ) 和超氧化物歧化酶( s o d ) 的活性，具有清除过多自由基与 抗脂质过氧化的作用。张全斌等【2 0 1 发现，海带褐藻多糖硫酸酯样品具有显著 的体外抗氧化活性，对超氧阴离子具有良好的清除作用，其对羟自由基和有 机自由基d p p h 的清除作用较弱。褐藻多糖硫酸酯能够抑制h 2 0 2 诱导的红 曲阜师范大学硕士毕业论文 细胞氧化溶血，对f e s 0 4 - - 抗坏血酸体系造成的脂质过氧化也具有良好的保 护作用。体内自由基能引起生物大分子及生物膜的严重损伤，从而加速衰老。 海带硫酸多糖因为其具有抗氧化作用而能够延缓衰老。 3 6 降血脂，防止动脉硬化 在降血脂研究方面，海带多糖通过改善血脂代谢，能有效防治动脉粥样 硬化及其它心脑血管疾病的发生。血浆中甘油三酯( t g ) 、胆固醇( t c ) 及 低密度脂蛋白( l d l ) 是动脉粥样硬化形成的促进因子【2 1 1 。l d l 升高是心肌 梗死的危险因子，而离密度脂蛋白( 玎) l ) 能将外周血中多余的胆固醇带回 肝脏代谢生成胆汁酸，因此m ) l 升高是抗心肌梗死的安全因子。 c h a n 9 2 m o k p 2 】的实验表明，海带多糖可使血浆中胆固醇含量减少1 3 1 7 ，低密度脂蛋白降低2 0 2 5 ，高密度脂蛋白含量增加1 6 ，使动脉 粥样硬化指数减少，血浆中脂质过氧化物浓度降低。另外，海带多糖是一种 类唾液酸样的活性物质，它能使细胞表面的负电荷增加，从而影响血中胆固 醇的沉积嘲。因此，海带多糖可以成为预防心脑血管疾病的潜在药物渊。 3 7 降血糖 海带多糖不仅能够降低糖尿病小鼠的血糖参与糖代谢，而且能调节糖尿 病小鼠的蛋白质代谢，缓解糖尿病病情。王庭欣等实验证明海带多糖在降血 糖的同时促进了胰岛细胞分泌胰岛素，说明海带多糖对糖尿病小鼠糖代谢的 影响与胰岛素的作用相同。胰腺病理切片同时显示海带多糖能明显地恢复四 氧嘧啶所致的胰岛损伤，对胰岛细胞具有保护作用( 2 爿。而且海带多糖不仅能 够降低糖尿痛小鼠的血糖、参与糖代谢，且能调节糖尿病小鼠的蛋白质代谢， 在降糖的同时促进胰岛细胞分泌胰岛素1 2 6j 3 。8 对重金属及其他毒素的阻吸作用 大量研究表明褐藻胶是一种优质的膳食纤维，在人体内具有较重要的生 理功能，如促进胃肠蠕动，吸附有毒物质并加速排出，尤其是它能够吸附多 种有毒重金属，如p b 、s n 、c d 等，减轻这些物质对人体的毒害，从而在胃肠 道内担任着“清道夫”的角色 2 ”。进一步的实验证明用缺乏f c 饲料喂养的小鼠 对f e 和c o 的吸收同样受到海带多糖的抑制。海带多糖的这一作用效果可能是 由于海带多糖能与某些金属离子结合形成牢固的复合物，从而阻碍肠腔对这 6 曲阜师范大学硕士毕业论文 些元素的吸收田】。 3 9 保护环境 生活污水及工业废水中的大部分有机化合物都是聚合体，他们含有缩氨 酸或磷酸酯。自有机氯杀虫剂被禁止后，有机磷酸酯作为杀虫剂被广泛应用 于农业和工业中。由于农业及工业的大量使用，导致食物及环境中有机磷酸 酯的含量明显升高。科学研究发现，土壤中稀有元素c 比其他金属离子清 除缩氨酸及磷酸酯的能力强，但在中性液中c e 4 + 很容易形成金属氢氧化物的 聚合体。k a j i n d w a 发现，右旋糖苷及其衍生物如甘露醇能够通过氧原子与ce _ i + 形成络合物，并且这种络合物在水中极易溶解。海带多糖的糖链上含有很多 氧原予，这些氧原子可以与c e 4 + 形成糖与c 的络合物。实验结果表明此络 合物能够水解b s a ( 牛血清白蛋白) ，并且在中性p h 条件下能够迅速地把超螺 旋d n a 转换成线性d n a 。另外此络合物能够促进毒死蜱( 一种农药) 的降解， 毒死蜱残留物在中性溶液中用此络合物( 1 1 6 m g 1 ) 处垂j 4 8 h 后，降解率达9 4 2 8 。用此络合物喷洒菠菜l o 天后，毒死蜱残留物只有1 1 4 m g k g ，而对照组为 3 1 0 m g k g 2 9 1 。 4 海带多糖抗肿瘤作用机制 4 1 免疫机制 具有生物活性的多糖大多有免疫调节作用，特别是能够增强免疫活性。 所以早期多糖抗肿瘤研究主要集中于多糖对肿瘤免疫的影响。海带多糖是一 种免疫调节剂，可改善机体免疫机能，它不仅能激活巨噬细胞、t 细胞、b 细 胞、淋巴因子激活的杀伤细胞( l ak ) 等免疫细胞，还能促进白细胞介索 2 1 ( i l 2 1 ) 、自细胞介素2 2 ( i l 2 2 ) 、肿瘤坏死因子( 1 n f ) 和干扰素( 刀f n ) 等细胞因子的生成，调节抗体和补体，从多个方面抑制肿瘤生长扩散。 4 1 1 对巨噬细胞( _ m ) 及细胞因子的影响 巨噬细胞为机体抗肿瘤和杀灭入侵病原微生物的效应细胞，并能分泌一 些细胞毒效应分子。组织巨噬细胞表面表达甘露糖受体，该受体不但识别含 甘露糖末端的分子，而且可介导巨噬细胞识别末端含有岩藻糖或：n 一乙酰氨 基葡萄糖的分子。海带多糖促进巨噬细胞的细胞毒作用机理可能与海带多糖 的分子结构有关。海带多糖为富含岩藻糖、甘露糖和硫酸基的高分子化合物， 7 曲阜师范大学硕士毕业论文 很可能通过与组织巨噬细胞的甘露糖受体结合激活巨噬细胞而达到抗肿瘤 的目的【3 0 l 。海带多糖能提高正常及免疫低下小鼠胸腺、脾重量指数，以及免 疫低下小鼠外周血w b c ( 白细胞) 数；明显促进正常及免疫低下小鼠脾脏t 、 b 淋巴细胞的增殖；促进正常及免疫低下小鼠脾细胞产生i l 2 2 ；表明b s p 具 有增强细胞免疫的功能。同时b s p 还促进正常及免疫低下小鼠血清和脾细胞 溶血素的生成，对体液免疫也有促进作用【3 l 】。海带硫酸多糖能激活小鼠腹腔 巨噬细胞，x 寸s 1 8 0 肿瘤细胞有较好的杀伤作用1 3 z j 。 另外研究表明，肿瘤坏死因子是具有多种功能的细胞因子，也是巨噬细 胞分泌的杀伤因子之一，在有1 0 n g n a 海带多糖的存在下，巨噬细胞能在体外 分泌肿瘤坏死因子，从而抑制肿瘤的生长。 4 1 2 对t 细胞、b 细胞和抗体的影响 淋巴细胞在免疫作用中占有很重要的地位，包括t 细胞( 主要参与细胞 免疫) 和b 细胞( 参与体液免疫) ，淋巴细胞受到抗原刺激后，除了本身被 致敏，转化为具有特异性免疫力的原淋巴细胞外，尚可释放出一系列可溶性 物质，其中主要包括：细胞毒性因子，它能杀伤肿瘤细胞：促分裂因子，使 其他静止的淋巴细胞发生有丝分裂；加强吞噬细胞的因子，如游走抑制因子， 能抑制吞噬细胞的游走，使其聚集在免疫反应的场所。致敏的淋巴细胞又促 迸吞噬细胞对肿瘤的杀伤力【3 3 i 。研究表明，海带多糖经腹腔注射给药后( 1 0 0 m g kg d ) 能显著提高免疫低下小鼠的胸腺、脾指数，促进小鼠脾细胞产生 i l - 2 能力及t 、b 细胞增殖能力【蚓。海带淀粉和海带淀粉硫酸酯可促进淋巴 细胞的转化，促进3 h - t d r 和3 h d r 掺入淋巴细胞，促进免疫低下小鼠脾的 t 、b 细胞的增殖能力。杨氏等报道，褐藻糖胶是小鼠b 细胞的有丝分裂原， 具有多克隆激活b 细胞增殖的作用，对大鼠脾脏淋巴细胞和入外周血液单 个核细胞也有激活作用【3 5 】。 4 1 3 抑制补体激活作用 补体是血液中一组具有酶原活性的蛋白质，能协同抗体或协助吞噬细胞 杀死病原微生物。失控的补体激活，不仅会消耗大量的补体成分，使机体抗 感染的能力下降，而且会导致机体发生过度的炎症反应而引起自身细胞和组 织的损伤。因此，通过新的生理活性物质来控制补体激活具有一定的生物学 8 曲阜师范大学硕士毕业论文 效应。有学者研究褐藻糖胶对补体旁路( a p c ) 的作用，发现2 0 m m l 的褐 藻糖胶可对红细胞溶解产生5 0 的抑制，且褐藻糖胶硫酸化的程度并不影响 其对a p c 的作用p 6 j 。 4 2 非免疫机制 随着研究的不断深入，越来越多的研究证实海带多糖除了增强免疫活性 外，还具有其他抗癌机制。1 9 9 3 年i t o h 发现。海带多糖也能直接抑制肿瘤细 胞生长。施志仪等对肝癌细胞q g 7 7 0 3 的研究中发现褐藻糖胶抑制了癌细胞 进入对数生长期，也说明它可以直接杀伤肿瘤细胞。将从海带中提取的高纯 度u 岩藻多糖类物质注入人工培养的骨髓性白血病细胞和骨癌细胞后，其细 胞内的染色体就会被胞内酶所分解，而正常细胞不受伤害。 4 2 1 对肿瘤细胞膜的影响 正常组织器官的细胞膜必须维持一定的膜流动性。当某些组织细胞发生 癌变时，膜中胆固醇含量随着变化，膜的流动性或增高或降低。研究表明， s 1 8 0 肉瘤小鼠肿瘤细胞膜流动较正常细胞膜流动性低，而h 2 2 荷瘤小鼠肿 瘤细胞膜流动性较正常细胞膜流动性高。利用高、中剂量组海藻多糖处理均 可使s 1 8 0 肉瘤小鼠肿瘤细胞膜流动性明显升高，而使i - 1 2 2 小鼠肿瘤细胞膜 流动性明显降低，且均具有剂量相关性，也就是说，海带多糖可以使肿瘤细 胞膜流动性趋于正常化1 3 7 j 。 4 2 2 抑制新生血管的形成 新生血管的形成在肿瘤的生长中占有重要的地位，如果没有血管供应营 养，肿瘤细胞将停止生长而死亡。另外，新生血管的形成在肿瘤的增殖、浸 润和转移中也具有重要作用。因此抑制血管生成无疑是肿瘤治疗的一个崭新 而有效的途径之一肿瘤新生血管的形成是由血管形成因子控制。血管形成 因子包括f g f ( 纤维原细胞生长因子) ，p d g f ( 血d , 板生长因子) 和v e g f ( 血管 内皮细胞生长因子1 。v e g f 是一个高度保守的糖蛋白复合体，在正常和异常 新生血管形成中起着关键作用1 3 8 。研究表明，褐藻糖胶可显著抑制小鼠s 1 8 0 肉瘤细胞，l e n i s 肺癌细胞和b 1 6 黑瘤细胞的新血管的形成1 3 9 ，其可能的机理 在于通过抑$ | i v e g f l 6 5 介导的信号转导及促进碱性成纤维细胞生长因子诱 导的p a i l ( 纡溶酶原激活物抑制剂1 ) 释放而抑制新生血管生成1 4 l 】。过硫酸 9 曲阜师范大学硕士毕业论文 化岩藻多糖通过诱导p a i l 抑$ 4 h u v e c ( 人脐静脉内皮细胞) 形成管状结构。 h u v e c 则通过增；b 1 1 b f g f 与细胞表面的硫酸乙酰肝素结合而释放p a i l l 4 2 。 4 2 3 对肿瘤相关基因的影响 影响某些原癌基因的表达最终将会诱导肿瘤细胞凋亡或影响细胞增殖 周期，从而起到抗肿瘤的作用。p 5 3 是一种抑癌基因，其基因产物位于乳腺 癌，胃肠道癌。及呼吸道等各种癌组织中。该基因突变或缺失是导致许多肿 瘤发生的原因。当细胞d n a 受损时，p 5 3 蛋白水平增高，以终止增埴，使 受损细胞获得修复d n a 的时间，如无法修复，则p 5 3 蛋白持续升高，引起 细胞凋亡。且p 5 3 过度表达时还可以通过直接激活b a x 基因或下调b c l - 2 基 因而诱导细胞凋亡。b c l - 2 和b a x 是一对正负凋亡调节的基因。吴晓文等研 究表明褐藻糖胶对照射诱导的大鼠脾淋巴细胞凋亡具有显著的抑制作用。其 机理与调节脾淋巴细胞b d 2 和b a x 蛋白表达有关阳j 。 4 2 4 对细胞周期的影响 细胞的增埴是通过细胞周期来实现的，细胞周期是在严格调控的前提下 进行的。一个标准的细胞周期可以划分为先后连续的4 个时期：g l 、s 、g 2 、 m 期。有些细胞有时会离开细胞周期，停止细胞分裂，被称为静止期细胞或 g o 期细胞。细胞周期中有两个重要的转换点：g l ，s 和g 2 m 。有学者认为， 肿瘤发生的最根本原因是这两个转换点的失控。使得原本应该终止增生的细 胞或生理凋亡的细胞不停的进入细胞周期，从而导致细胞的恶性增生 4 4 1 。 能够作用于细胞周期的药物可以影响其生长分化。e d e s l a n d e s 等通过 对人非小细胞( n s c l c n 6 ) 肺癌的体外实验证明，岩藻多糖能有效抑制 n s c l c - n 6 的增埴，并且通过细胞流失仪观察细胞周期的变化，g 0 g l 期占 细胞周期的比例逐渐增加，s 期占细胞周期的比例逐渐降低。表明岩藻多糖 主要作用于g i s 节点，使细胞停滞于g l 期1 4 。孙冬岩等研究发现海带多 糖可改变宫颈癌细胞的细胞周期，加入药物后s 期细胞百分率增加，g 0 g l 期细胞百分率降低，细胞被阻滞于s 期 4 6 1 。 4 2 5 诱导细胞凋亡 细胞凋亡是一种主动的基因调控的正常生命活动，是维持正常机体发育 和成熟过程中细胞的稳定状态的一种主动死亡形式f 4 7 1 。细胞凋亡同细胞的分 1 0 曲阜师范丈学硕士毕业论