（微生物学专业论文）乳链菌肽前体基因克隆及在乳酸乳球菌中的表达研究.pdf

摘要( n i s i n 是某些乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 产生的小肽，是目前唯一用于食品工业的生物活性抗菌肽，已被广泛应用在多种食品的防腐保鲜上，它能有效地抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性细菌及厌氧菌，特别是对产生孢予的细菌有很强的抑制作用。因此，开展对n i s i n 的研究，具有巨大的经济效益和社会效益弘厂乳酸乳球菌是一类长期应用于食品发酵业的有益微生物，以乳酸菌为受体的表达系统具有安全、表达产物便于分离，使用方便等优点。本实验提取乳酸乳球菌n i z or 5 的基因组d n a 为模板，用p c r 方法得到乳链菌肽前体基因( n is h ) ，克隆到乳酸乳球菌表达载体p m g 3 6 e ，构建了表达载体p m g 3 6 e n i s a 。以l a c t o c o c c u sl a c t i sn z 9 8 0 c l 为受体菌，研究了表达载体的表达情况。( 圭要实验结果如下：1 培养乳酸乳球菌n i z or 5 ，收集菌体，用t r i p u r ei s o l a t i o nr e a g e n t 提取其基因组d n a ，琼脂糖凝胶电泳，紫外显示仪下可见在点样孔附近有一条整齐均一的d n a 带。2 根据已发表的乳链菌肽前体基因的d n a 序列，设计两条引物并引入酶切位点。以l a c t o c o c c u sl a c t i sr 5 基因组d n a 为模板，p c r 反应条件：9 4 。c 变性3 0 s ，4 5 退火6 0 s ，7 2 c 延 申9 0 s ，反应进行3 0 个循环。成功扩出一条约4 6 0 b p 的d n a片段。3 培养大肠杆菌，提取寄于其中的质粒p m g 3 6 e ，双酶切后回收大片段。将酶切并纯化后的p c r 扩增产物与大片段连接并转化e c o l ij m l 0 9 ，在含红霉素的l b平板上筛选到含有重组质粒的转化子。4 抽提e c o li3 m 1 0 9 中的重组质粒，转化l 1 a c t i sn z 9 8 0 0 ，在含红霉素的g m l 7平板上筛选转化子。对提取转化予进行鉴定后，接入g m l 7 液体培养基中培养，聚丙、烯酰胺凝胶电泳检测结果，无表达产物。广t 歹一关键词：乳链菌肽前体基因：克隆；乳酸乳球菌；表达p r o n i s i ns t r u c t u r eg e n e ：c l o n i n ga n de x p r e s s i o ni nl a c t o c o c c u sl a c f i sn z 9 8 0 0h o uh o n g x i a o( c o l l e g eo f f o o d s c i e n c e , s o u t h w e s t a g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y ,c h o n g q i n g , 4 0 0 7 1 6 , c h i n a )a b s t r a c tn i s i ni sah i g h l ym o d i f i e dp e p t i d ea n t i b i o t i cp r o d u c e db yc e r t a i ns t r a i n so fl a c t o c o c c u sl a c t i s i ti so fg r e a ti n t e r e s tt ot h ef o o di n d u s t r yb e c a u s eo fi t se f f i c i e n ta n t i m i c r o b i a la c t i v i t ya g i n s taw i d er a n g eo fg r a m p o s i t i v eo r g a n i s m s ，i n c l u i n gm a n ys p o i l a g eb a c t e r i aa n df o o dp a t h o g e n ss u c ha sl i s t e r i a c l o s t r i d i u m ，a n db a c i l l u ss p e c i e s l a c t o c o c c u sl a c t i su n d e r g o e sal o n gh i s t o r yo fs a f eu s ei nav a r i e t yo fd a i r ya n do t h e rf o o df e r m e n t a t i o n s i nt h er e c e n ty e a r s ，t h eg e n e t i c so f 工1 a c t i sh a sb e e ng r e a t l ya d v a n c e d t h i sh a sr e s u l t e di nt h ea v a i l a b i l i t yo fg e n e t i c a l l ym o d i f i e d 1 a c t i sw i t hp r o s p e c t sf o ra p p l i c a t i o ni nf o o di n d u s t r y i nt h i ss t u d a y ，g e n o m i cd n ae x t r a c t e df r o ml a c t o c o c c u sl a c t i sn i z or 5w a su s e dd i r e c t l ya st h et e m p l a t ef o rp c ri nt h i sp a p e r t h eo l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r si n t r o d u c e di n t ot w or e s t r i c t i o ns i t eh i n d l i ia n de c o r lw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e da c c o r d i n gt ot h en i s as e q u e n c er e p o r t e db yo e n b a n k ad n af r a g m e n tw a sa m p l i f i e df r o ml a c t o c o c c u sl a c t i sn i z or 5g e n o m eb ym e a n so fp c ra n dc l o n e di n t op m g 36 ep l a s m i d t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m di n t oe c o l i j m10 9a n di d e n t i f i e db yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sa n a l y z i n g t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a si n t r o d u c e di n t ol a c t o c o e c u sl a c t i sn z 9 8 0 0 s d s - p a g ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tl a c t o c o c c u sl a c t i sn z 9 8 0 0h a r b o u r i n gp m g 3 6 e n i s ar e s t o r e dl i t t l ea b i l i t yo fn i s i np r o d u c t i o n r e s u l t ss u g g e s t e da sf o l l o w i n g ：1 t h eh i g hp u r i t yo fg e n o m i cd n ae x t r a c t e db yt r i p u mi s o l a t i o nr e a g e n tw a so b s e r v e d d n aa g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w e dt h a tt h eg e n o m eh a da2，h i g hi n t e g r i t yw i t h o u td e g r a d a t i o n a n da l s o ，s p e c t r o p h o t o m e t r i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h eg e n o m i cd n ah a dn op o l l u t i o nb yp r o t e i na n dr n a 2 aa p p r o x i m a t e l y4 6 0 b pd n af r a g m e n tw a sa m p l i f i e db yp c rf r o ml a c t o c o c c u sl a c t i sn i z or 5g e n o m e t h ep r i m e r su s e di nt h i ss t u d yc o m p r i s e dt h ef o l l o w i n gn u c l e o t i d es e q u e n c e s ：5 c g c g a a t t c g a t a t a g g t r r a t t g a g t 3 a n d5 a t g a a g c t t a t c c a t g t c a g a a c t a a 一3 c o n d i t i o n su s e df o rt h ep c rc o n s i s t e do f 3 0c y c l e so f 9 4 。cf o ro 5 m i n 4 5 f o rl m i na n d7 2 cf o r1 5 m i n ，p l u so n ea d d i t i o n a lc y c l eo f 7 2 cf o r1 0 m i n 3 t h ea m p l i f i e dd n af r a g m e n tw a st h e nl i g a t e di n t ot h eh i n d l i la n de c o r ls i t e so fp m g 3 6 e t h el i g a t i o nm i x t u r ew a st r a n s f o r m e di n t oj m l 0 9f o rt h ei n i t i a lc l o n i n g t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m g 3 6 e n i s ai s o l a t e df r o mj m l 0 9t r a n s f o r m a n t sw e r ea n a l y z e db yr e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o n 4 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m g 3 6 e n i s aw a si n t r o d u c e di n t ol a c t o c o c c u sl a c t i sn z 9 8 0 0 s d s p a g ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tl a c t o c o c c u sl a c t i sn z 9 8 0 0h a r b o u r i n gp m g 3 6 e n i s ar e s t o r e dn oa b i l i t yo f n i s i np r o d u c t i o n k e yw o r d s ：n i s ag e n e ；g e n ec l o n i n g ；l a c t o c o c c u s ，口c f f s ；e x p r e s s i o n文献综述乳链菌肽研究进展乳链菌肽( n i s i n ) 是目前研究最多的一种细菌素，它由某些乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 所产生，含有3 4 个氨基酸残基及5 个硫醚桥。由于这种肽是由n 组s t r e p t o c o c c i 产生的，从n 组抑制物质( g r o u pni n h i b i t o r ys u b s t a n c e ) 英文的第一个字母组合起来( n i s ) 形成n i s i n 一词。n i s i n 对g r a m阳性菌呈广谱抗菌作用，尤其是抗热性芽胞菌，对g r a m 阴性菌、酵母或霉菌有很少或没有活性。由l 1 a c t i s 产生可能性抗菌肽的第一个报告1 9 2 8 年发表于美国，他们主要进行了n i s i n 对其它乳酸菌的抑制作用研究。1 9 3 3 年在新西兰和1 9 4 4 年在英格兰发表相似的报道，1 9 4 7 年英格兰的研究者确认n i s i n 的应用评估早期主要集中在医用和兽用临床抗菌剂的应用。n i s i n 用作食品防腐剂研究的最早始人之一是h i r s c h ，1 9 5 1 年h i r s c h 等研究n i s i n 应用于干酪中产气菌c 1 0 s t r i d i u ms s p 的控制，第一次将n i s i n 应用于食品防腐领域，获得令人鼓舞的结果。1 9 5 2 年m c c l i n t o c k 等应用类似的方法进行加工干酪的c 1 0 s t r i d i u m 控制实验，在英格兰西南部c l o s t r i d i u m 引起加工干酪的损失在总量的3 0 以上，通过在产品混合物中加入含n i s i n 的乳发酵剂，3 个月内该类问题很快减少，几乎完全消失。a p li na n db a r r e t tl t d1 9 5 9 年生产出名为n i s a p l i n “的n i s i n产品，n i s if i 含量为2 5 m g g ”，现今为止仍是世界范围内广泛应用的食品防腐剂。最近c g r h a n s e n ( 丹麦) 名称为c h r i s i n ”有类似效果的产品也推向市场。1 9 6 8 年联合国粮食及农业组织，世界卫生组织f a o w h o 对n i s i n 的安全性进行了认定，1 9 6 9 确认n i s i n 为安全、高效、可靠的食品防腐剂，并在法律上规定可作为食品添加剂使用。1 9 8 3 年，n i s i n 被美国食品和药物管理局( f d a ) 确定为无毒产品( g i l a s ) ，并批准使用。中国卫生部食品监督检验厅签发的证明指出：“可以科学地认为乳酸链球菌素( n i s i n ) 作为食品防腐剂是安全的。”并将其列为中国允许使用的防腐剂行y u ( g b 2 7 6 0 - 8 6 ) n i s i n 是目前唯一用於食品工业的生物活性抗菌肽一乳酸菌素。到目前为止n i s i n 已在全世界5 0 多个国家和地区广泛应用。在基础理论研究方面，早在1 9 5 2 年，g o w a n sj l 就发现乳链菌肽不易在4血液p h 值下溶解，并指出胰凝乳蛋白酶对其活性具有破坏作用。1 9 7 1 年g r o s s和m o r e ll 报道了n i s i n 的化学结构式，确定了它的一级结构。3 。1 9 8 3 年和1 9 8 6年w a k a m i y a 先后用化学方法合成了n i s i n 的a 环和b 环，1 9 8 8 年更进一步得到了全合成，但成本昂贵，仅有理论研究价值。进入9 0 年代以来，随着分子生物学及其相关技术的发展，国内外学者将目光投向了生物技术领域。有关n i s i n 的生物合成、基因调控及表达载体构建等方面的研究报道层出不穷。世界上许多实验室正致力于揭示乳链菌肽的特殊结构与其所发挥的功能，这一领域的研究成果对于构建热稳定性酶，设计新的抗菌药物具有重要指导意义。本文将对乳链菌肽的结构、理化特性、构效关系、作用机制、生化遗传特性及其研究前景和存在问题进行综述。一、乳链菌肽的理化性质和生物学特性l 、化学结构1 9 7 1 年g r o s s 等测定了n i s i n 的化学结构式，证明n is i n 臼3 4 个氨基酸残基组成，分子量为35 1 0 d a ，分子中含有氨基和羧基末端及硫醚键形成的五个内环。乳链菌肽的分子活性部位含有羊毛硫氨酸( l a n ) 和8 一甲基羊毛硫氨酸( 8 一m l a n ) 等稀有氨基酸，属羊毛硫抗生素( 1 a n t i b i o t i c s ) 。有实验证明n i s i n 分子中会出现二聚体和四聚体，分子量分别为70 0 0 和1 40 0 0 。乳链菌肽存在几种类型的分子，1 9 5 2 年8 a v i n 等指出乳链茵肽有两种不同类型的分子。同期b e r r i d g e 等认为乳链菌肽可能有4 种类型，并定义为a 、b 、c 和d ，其中a类和b 类的生物活性最高，c 类和d 类的生物活性只有h 和b 的1 5 。1 9 6 7 年j a v i s又报道了第5 种类型e 。1 9 9 1 年m u l d e r s 等嘲在乳酸链球菌n i z o2 2 1 8 6 中发现一个n i s i n 天然变异体( n i s i nz ) ，其结构与n i s i nh 只有微小的差异，即氨基酸序列第2 7 位上的组氨酸( h i s ) 被天冬酰胺( h s n ) 取代。目前研究最多的就是活性最高的n is i n a 和n i s i n z 。n i s ir l 的分子结构如图l 所示。2 、溶解性乳链菌肽的溶解性依赖于溶液的p h 值。p b 2 5 时溶解度为1 2 ，o h 5 0 时下降为4 ，在中性和碱性条件下几乎不溶解，乳链菌肽的最佳溶剂是0 0 2 m o l l 盐酸。因为在食品保藏中n i s i n 的应用水平很少 o 0 2 5 m g m t ，故溶解性不是其食品中应用的问题。商业制各物含有来自发酵的不溶性残留固体，它会产生云状，水合悬浮物，但它们对n i s i n 的效率没有不良影响。53 4田l 乳链耻z 的一曩绪构踟为脱氧丙氨酸；d h h 为母甲基脱氯丙氨藏；j l t s - 越- 为羊张氯瞳；a i 抛- s - 凡- 为分甲基羊毛碓氯馥3 、稳定性商业制备物在2 年的贮存期内没有活性损失，它一般存放于干燥、黑暗、低于2 5 的地方。n i s i n 分子在性质上呈酸性，随着p h 增加，热处理稳定性下降，p h 2 时的n i s i n 溶液在1 1 5 ( 2 、1 2 1 灭菌时呈稳定性，p h 5 时损失活性的4 5 ，p h 7 时活性损失 9 0 ，杀菌对n i s i n 的活性基本无影响，大蛋白分子的存在有助于改善食品中n i s i n 对热的稳定性”1 。在食品贮存过程中也发生n i s i n 活性损失的情况，损失的程度依赖于贮存的p h 和温度，如在p h 5 6 5 8的杀菌加工干酪中，热处理( 8 5 1 0 5 5 l o m i n ) 的n i s i n 活性损失1 5 2 0 ，经贮存后若2 0 时贮存活性保留8 0 ，2 5 时为6 0 ，3 0 时仅有4 0 。因为n i s i n 对芽孢的作用主要是抑制芽孢而不是杀死芽孢，故在食品中必须有足够量的残留n i s i n ，以在整个贮存期内对任何残留菌芽胞的抑制保持活性。如果食品贮存的温度愈高，则在食品中添加的n i s i n 量需愈高。4 影响n i s i n 活性的因素食品中的许多因素可抵消或部分抵消n i s i n 的作用，在未经加热或较小热加工食品中，来自微生物、植物或动物的蛋白酶在食品贮存过程中会分解n i s i n ，使其失活。1 。由于n i s i n 呈疏水性，食品中的脂肪类物质会干扰其在食品中的均匀分布，使其无法发挥抑菌作用：许多食品添加剂对n is i n 也有抵消作用，n i s i n 在硫代硫酸钠存在的情况下和t i o 。存在情况下将被分解。5 n i s i n 的毒性研究n i s ir l 是由原料乳中天然存在的l a c t o c o c c u s 菌产生的，故认为它是无害的，因为人和动物摄入数个世纪也没有引起任何副作用。产n i s i n 的l 1 a c t i s 天然大量存在，a p l i n 和b a r r e tl t d 进行的2 5 1 个原料乳样舌品的检测中发现，1 0 9 个样品中含有产n i s i n 的l 1 a c t i s 鳓。对远超过食品应用量的n i s i n 的毒往研究表明，n i s i n 是无毒的，n i s i n 在肠道可被演化酶迅速失活，在食用会n i s i n 的液体l o m i n 后就无法在人豹唾液中测定到n i s i n 的存在，现也没有发现对n i s i n 过敏的情况，大量的微生物学研究表明：n i s i n 帮治疗的抗生素阔无任何交叉性的互相抵消作用。二、乳链菌肽的结构与功能的关系k u i p e r s 和g r a e f f e 等分舅对乳链菌肽的天然变异体n i s i n z 和n i s i n 的溶解度及生长抑制谱进行了比较随。终果表明甄者仅鸯微小灼差别，路搴n i s i n分子中第2 7 位氨基酸的改变对其功能不发生大的影晌。c h a n 等人( 1 9 8 9 ) 对n i s i n静两个降解物进行了分离和鉴定。他们发现新制备的乳链菌肢结构只有一种，菪用盐酸或醋酸处理，其结构将发生变化，形成活馋大小不同的几种分予，其中骞两种分子是主要的：乳镳菌肽( 卜3 2 ) 和( d e s a a l a 5 ) 乳链蕊肽( 1 - 3 2 ) 。孚0 链藩肽( 1 - 3 2 ) 有3 2 个氨基酸，缺失了3 3 位点和3 4 位点的脱氢丙氨酸( d h a ) 和l y s ，而3 2 位点的v a l ( v a l n h 2 ) 增鸯舀了一个氨基。在( d e s a a l a 5 ) 乳链菌肢( 1 ，3 2 ) 中，5位点的d h a 被降解，由一a a l a 5 一l e u 6 一变成- p h y 5 - l e u 6 - 。对蹲者的抗菌活性硬究表明，乳链菌肽( 1 - 3 2 ) 与乳链菌败( 1 - 3 4 ) 的活性基本栩嗣，两( d e s a l a 5 ) 乳链菌肽( 1 - 3 2 ) 的活性减小5 0 0 多倍。这发现证明c 一末端3 3 、3 4 位点的d h a 、l y s对乳链萤肽活性不是必需的，起关键作用的是5 位点的d h a 。1 9 9 2 年d o d d 等采用位点专一诱变造成特定氨基酸改变的策赂，进一步考囊了n i s i n 分予结构与功能之间的关系o ”。他 】月谷氨酰黢替代n i s i n 分子2 7 伎点上灼组氨酸褥剿个工程n i s i n 分子( n i s a h 2 7 q ) ，发现其活性与n i s i n z 揍避。紧接着他们叉蹋异亮氨酸代替3 2 位点上的缬氨酸，得到n i s a h 2 7 q ，v 3 2i ，用丝氨酸替代2 3 位点上的苏氨酸。得到n i s a h 2 7 q ，t 2 3 s ，续果发现n i s ah 2 7 q ，v 3 2 1 仍具有活性。这与c h a n 等人的擐遵是一致的。两n i s a h 2 7 q ，t 2 3 s ，用平板扩数法未见任侮活性，用蘸落覆羞法仪检测剿很 氐盼活性。表弱2 3 位点上苏氨酸对n i s i n 活性超重要作用。他们还将n i s i n 分予的2 1 - 3 4 位点氨基酸造成缺失褥掰n is a 2 卜3 4 ，结采无论用平板扩散法还是菌落覆盖法均检测不到活性。这一现象与w a k a m i y a 等人3 的报道并不一致，蕨纛认为n i s i n 活性所具备的最基本结孝匀是l 1 9 馒氨基酸残基。造成上述不同结果的擐因尚不清楚。7三、乳链菌肽的抑菌机制目前关于乳链菌肽的杀菌机制有两种不同的假说。一种观点基于乳链菌肽具有相对疏水性的特点，认为乳链菌肽作为一种阳离子去污剂发挥作用“”。乳链菌肽以及其他的羊毛硫抗生素与细胞膜发生作用，使其产生传导性，进而破坏膜内外的电位差、p h 梯度及离子梯度。5 目前关于乳链菌肽三维结构的研究支持这种观点“”，认为乳链菌肽具有潜在的跨膜序列及高的偶极矩能使膜产生孔道或破坏膜的完整性，然后引起膜内物质泄漏，同时膜内外电位差和梯度的丧失将破坏细胞通过电子传递链产生能量的能力。这种机制没有把乳链菌肽中高度保守的脱氢残基和硫醚环的作用考虑进去。事实上，如果这些特殊结构不参与乳链菌肽的杀菌活动，为什么如此保守? 另一种观点认为乳链菌肽中的脱氢残基以m i c h a e l受体的形式与亲核基团如靶细胞中的巯基发生反应。l i u 及h a n s e 等的研究发现，用硫醇处理乳链菌肽，其活性完全丧失，原因是硫醇破坏了脱氯残基。g r o s s 和m o r e ll 研究认为，乳链菌肽的脱氢残基能与靶细胞中在代谢上有重要作用的酶发生作用。并且a 、b 不饱和氨基酸( d h a 、d h b ) 通过乳链菌肽的多环结构还能产生离子结合能力。l i u 及h a n s e n 等”也支持这种观点。研究表明3 膜中未经修饰的巯基对于芽孢的萌发是必需的，而乳链菌肽中的脱氢残基能使敏感细菌芽孢细胞膜中的巯基失活，因此对细菌芽孢亦有毒杀作用总之，乳链菌肽在膜中对膜蛋白的共价修饰会破坏膜结构的完整性，进而破坏它参与能量转递的能力。还有人把上述两种机制作为两个过程结合起来，认为乳链菌肽的阳离子去污剂特征首先引导它到达靶细胞的细胞膜，然后与膜中起关键作用的疏基发生反应，既破坏膜蛋白参与能量转递的能力，又使膜发生泄露，丧失电位及p h 梯度，最终导致细胞死亡m 。四、乳链菌肽的生物合成研究l 、乳链菌肽的生物合成机制早在1 9 6 6 年，h u r s t 就用放射性示踪物追踪细胞的生化活性，发现乳链菌肽的合成机制与蛋白质合成相类似。同一时期，i n g r a i n 用 3 h 苏氨酸和 3 5 s 半胱氨酸培养n i s i n 产生菌放射自显影显示放射性掺入到羊毛硫氨酸( l a n ) 和b -甲基羊毛硫氨酸中( b m l a n ) 中，并证明l a n 和6 - m l a n 分别由半胱氨酸和苏氨酸形成。n i s i n 分子的另个稀有氨基酸脱氢丙氨酸则由丝氨酸脱水作用得到。随s着研究工作的深入，人们逐渐了解乳链菌肽生物合成十分复杂，涉及11 个基因，以n i s a z 、n i s b 、n i s t 、1 3 i s c 、n i s i 、n i s p 、n i s r 、n i s k 、n i s f 、n i s e 和n i s g的顺序成簇排列在约1 4 k b 的d n a 片段上。其中n i s a z 编码乳链菌肽前体的结构基因，n i s i 、n i s f ，n i s e 和n i s g 与菌体自身免疫有关，n i s r 和n i s k 是双组分调节基因，其余是与乳链菌肽成熟有关的基因”。f 忘忘蔫# 焉感熹涛勰。gn i s i n 基因簇的组成现已查明，乳链菌肽在生物合成过程中，首先以前体形式在核糖体上合成，这种前体物( 前乳链菌肽) 共含有5 7 个氨基酸残基，其中先导区有2 3 个残基，结构区有3 4 个残基心”。随后通过翻译后酶修饰作用切除先导区，结构区的s e r 和t h r 在特定位点脱水形成脱氢丙氨酸( d h a ) 和脱氢丁氨酸( d h b ) 。d h a 、d h b 和l y s之间形成硫醚桥，并最终导致羊毛硫氨酸( l a n ) 和b 一甲基羊毛硫氨酸( p - m l a n ) 等稀有氨基酸的合成。最后，切除前导肽，赋予成熟的乳链菌肽分子以杀菌活性和热稳定性。2 、乳链菌肽基因的克隆与表达1 9 8 8 年，马里兰大学的b u c h m a n 等“首先克隆了编码n i s i n 的基因。随后，k a l e t t a 和e n t i a n ”、d o d d 等及中科院微生物所”1 也先后获得了该基因的克隆。m u l d e r s 等“”于1 9 9 1 年从乳酸链球菌n i z 0 2 2 8 6 中克隆到n i s i n z 的结构基因。他们发现n i s i n z 和n i s i n a 仅有一个核苷酸的差异( c a ) ，结果导致氨基酸序列上2 7 位的组氨酸( h i s ) 被天冬酰胺( a s n ) 取代。陈秀珠等研究了2 种乳链菌肽天然变异体n i s i n h 和n i s i n z 的抑菌活性，n i s i n a 和n i s i n z 对被试的2 株李斯特氏菌及蜡状芽孢杆菌1 1 8 9 具有相同的抑菌效果1 。而对另一株蜡状芽孢杆菌1 3 5 0 ，n i s i n z 比n i s i n k 显示较强的抑菌活性。对编码n i s i n 的开放性阅读框( o r f ) 的研究表明，在起始密码子a u g 之前存在一个典型的核糖体结合位点( r b s ) 5 一a a g g a g g 一3 。在终止密码子u a a 后不远处有一反向重复序列。但在r b s序列前未发现典型的启动子。k u i p e r s 研究了n i s i n 在n i s a 缺失或完整存在下的转录分析，先导区序列以及n i s a 的转录起始位点已经探明，n i s a 的转录依赖于其本身的完整性，l f a c t is n z 9 8 0 0 基因组中去掉了4 b p ，则失去了转录能力，如果加入少量的n i s i n a 在培养基里面，则n i s a 的转录重又开始，且转录的量依赖于加入n i s i n 的量，其他几种相关的肽如：n i s i n z 、m 1 7 w n i s i n z 、s 3 t n i s i n z 、s l n i s i n z 也能诱导转录，并且l a n t i b i o t i c 的修饰部分在诱导过程中起着重要的作用”“。n i s a 基因的d n a 序列及其所编码的氨基酸如图2 所示。e c o r i1g a a l t c g a 睛t a g g 下兀1 a t t g a g t c t l a g a c a r a c t t g a a t g a c c l a4 8g t c t l 盯a a c l a t a c t g a c a a t g a a a c a 丌aa c a a ，蛆t a a a a c a g一3 5- 1 09 4c r r a a l 盯c b 盯c 蛩囤丛a a g t a t t g g t a a t a a t a t t a t t g t c g a t a一3 51 4 2a c g c g a t c a t a a t a a a c g g c 至i q 鱼避a a a t t c t g a a g t t t g m g a1 0r b s18 91 ! 垒虹g a t t t c g t t c g a a g g a a c l a c a a aa _ r 从a r i q q 鱼鱼2 3 5c t c a a a p 汀g a g l a c a a a a g a r r n a a c t t g g a t t t g g l a t c t g t tmstkdfnldlvs2 8 2c a a g a a a g a r r c a g g t g c a t c a c c a c g c 久兀a c a a g t a t t t c g cvskkdsgaspritsi3 2 9t g l a c a c c c g g t t g l a a a a c a g g a g c t c t g a t g g g t t g t a a c a tslctpgcktgalmgc3 7 5g a a a a c a g c a a c t t g t a a t t g l a g t a l l a c g l ：a a g c a a a t a a c cnmktatc ncsihvsk4 2 0a a a t c a 从g g a l 认g t a 玎订g r r a g t t c a g a c a l b g a t 丛鱼珏h i n d i i in i s a 的d n a 序列及其编码的氨基酸序列s t e e n 等人的研究认为n is i n 结构基因是一个多顺反子操纵子的一部分。该操纵子至少有8 5 k b ，启动子在n i s i n 基因上游至少4 k b 处。n i s i n 基因两端各有一个0 r f 。d o d d 等”7 3 将上游的o r f 称为i s 9 0 4 ，有1 2 4 1 b p 长，末端有3 9 b p 不完全反向重复序列。该o r f 编码一个2 5 3 氨基酸的蛋白质，与大肠杆菌i s 2 插入因子的转座酶基因有较多的同源性。这与h o r n 等的报道是一致的。后者认为l on i s i n 结构基因存在于一个称为t n 5 3 0 1 的转座子中。s t e e n 等“”详细研究了下游o r f 。发现该阅读框编码一个8 5 1 氨基酸的蛋白质，与牛痘病毒中一个未知功能的“p 2 4 非必需基因”具有很好的同源性。该o r f 的5 端有一个核糖体结合位点，没有发现典型的启动子，它可能与n i s i n 基因共同转录。3 端有一个串联的终止密码子和一个不依赖p 的转录终止子，这可能是操纵子的末端。乳链菌肽基因工程研究方面，国外已有的工作只是克隆了于乳链菌肽有关的部分基因，相比较，中国科学院微生物研究所还连栋为首的研究小组不但正在做的克隆于表达，而且已经得到了含有完整的乳链菌肽生物合成基因簇的重组噬菌体。3 、乳链菌肽基因表达翻译后的修饰已经证明，成熟的n i s i n 分子是经翻译后修饰作用形成的。有人”将含有n i s i n 基因的质粒p f i l 7 2 引入乳酸乳球菌m g l 6 1 4 中，可是转化子f 1 6 0 1 6 并不产生有活性的n i s i n 。他们推测可能是所得克隆是不完整的，缺乏n i s i n 成熟加工所需要的基因。该基因所编码的酶可修饰n i s i n 前体分子使其成为有活性的n i s i n 。那么，是否确实存在翻译后修饰所需要的某种产物( 可是一种或几种蛋白质或酶) 呢? 如果有这样的产物，编码该产物的基因位于染色体( 或者质粒) 的什么位置呢? 这些问题自然成了人们关注的焦点。s t e e n 等“3 1 分析了n i s i n 基因下游的o r f 编码产物的二级结构特征。在c 一端发现一个1 4 氨基酸的螺旋区，1 8 个n一螺旋分布于o r f 的不同部分，螺旋大小为l o 一4 5 个氨基酸残基不等，该产物与某些膜相联系的蛋白质具有同源性，表明它可能是个附着或锚定在质膜位点上的蛋白质。e n g e l k e 等“”分析了n i s i n 基因( n i s a ) 下游的三个o r f ( n i s b 、n i s t和n i s c ) 。距n i s a 下游1 l o b p 处的o r f 编码一个9 9 3 氨基酸的n i s b 蛋白质。w e s t e r nb l o t 分析该蛋白质分子量是1 1 5 k d ，与s p a b ( 2 6 2 ) 和e p i b ( 2 3 6 ) 同源。而s p a b 和e p i b 分别为枯草菌素( s u b t i l i n ) 和表皮菌素( e p i d e r m i n ) 生物合成所必需。n i s b 与文献“3 1 报道的个含8 5 氨基酸的蛋白质大小略有差异。e n g e l k e等认为可能是测序移码所致。在n i s b 终止密码子后1 4 p b 处有一编码6 0 0 氨基酸的n i s t 蛋白质的o r f ，n i s t 与s p a t 有很强的同源性( 4 3 8 ) 。此外，与大肠杆菌溶血素的输送蛋白，小鼠的多药物抗性蛋白和与人纤维囊泡症有关的蛋白质亦有2 6 同源性，这些蛋白质均与多肽、多糖的分泌有关。n i s c 编码一个4 1 8 氨基酸的蛋白质，与s p a c ( 2 5 4 ) 和e p i c ( 3 2 1 ) 蛋白质具有很高的同源性。s p a c和e p i c 分别为s u b t i l i n 和e p i d e r m i n 生物合成所必需。上述研究表明，n i s i n翻译后修饰和加工有关的基因与n i s i n 结构基因紧密连锁。确切的翻译后修饰机制有待于遗传学和生物化学的深入研究。五、乳链菌肽研究的展望和目前存在的问题乳链菌肽是多肽，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶分解成氨基酸，不会改变肠道内正常菌群，以及引起常用其他抗菌素所出现的抗药性，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性。对乳酸链球菌素的微生物毒性研究表明。无微生物毒性或致病作用，其安全性很高。能有效抑制引起食品腐败的细菌和孢子，延长食品货架期；降低灭菌温度，缩短灭菌时间，改进食品品质，降低能耗；取代或部分取代化学防腐剂，满足生产健康食品的要求。在乳制品、肉制品、果汁饮料、植物蛋白饮料、啤酒等广泛应用。目前，基因工程的n i s i n 产品还没有问世，市面上所售n i s i n 都是通过乳链菌肽高产菌株发酵而得，n i s i n 的生产属于高新技术，技术门槛较高，虽然n i s i n 的发酵效价已达到了8 0 0 0 i u m l ，生产也比较稳定，但仍显得量少价高，远远不能满足需求。因此，以基因工程得手段去探讨n i s i n 的生物合成是很有意义的。乳链菌肽的特殊结构对蛋白质工程的学术价值。现代生物技术的飞跃发展极大地推动了蛋白质工程。通过蛋白质工程技术，人们可以设计、构建具有新特性的酶或蛋白质分子。在认识乳链菌肽之前，人们一直保守地认为蛋白质只能从基因编码的2 0 种常见的氨基酸中构建，限制了设计新蛋白质使具有不同于以前的物理和化学特征的范围。幸运的是，乳链菌肽的存在表明，以种可控制的方式可以在某些蛋白质中引入不常见的氨基酸因此，如果我们在其他多肽或蛋白质中能够引入这种转译后的修饰系统，我们就能获得具有新的物理和化学特征的蛋白质，这些新的特征是2 0 种常见的氨基酸所不能达到的。同样吸引人的是，在蛋白质中引入硫醚桥以提高蛋白质的热稳定性。目前，在工业中应用的某些酶热稳定性不好，因此，构建在较高温度下仍能保持原有活性的酶对发酵工业是极为有益的可以预期，在工业用酶中引入硫醚桥，使酶的热稳定性提高，能大大缩短许多生物处理过程的时间，从而保证效率更高、能耗更少，以及最大限度地减少对环境的破坏。此外，乳链菌肽的启动子( p n i s a ) 是诱导型启动子，诱导物即为乳链菌肽自身”。在加入诱导物后，其表达量可提高1 0 6 0 倍。最近，d r o u a u l t等入报道精p n i s a 诱等表达猿篱甍球蕊嚣糖酶，并获褥7 蠢表达。珂以预见，用p n i s a 或p n i s z 构建乳酸菌食品级表达载体在食品王韭及医楚方瑟将毒广泛应用前景。现在的研究只是局限在对n i s i n 前俸萋鞫薛克隆与表达，受体菌鼢选择必然受到限制，表达羹也不高。随着n i s i n 分子生物学研究的不断深入，可戮将有关n i s i n 生物含成的整个基因簇进行克隆与表达，构建池真正的n i s i n 基戮工程菌，进预实现工业化生产。当然，娶达到这步，还有许多的研究工作去做。前言同化学防腐剂相比，乳链菌肽有以下优点：( 1 ) 因其结构是短肽，可被人体内的酶降解、消化，对人无毒害；( 2 ) 不影响食品的色、香、味、口感；( 3 ) 在食品加工中使用，可以降低杀菌温度、减少热处理时间，因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状。目前，乳链菌肽已成功地应用于乳制品、罐头、高蛋白食品及乙醇饮料的防腐保鲜，成为越来越受人重视的安全、高效天然食品防腐剂”1 但由于乳链菌肽高产菌株缺乏，导致乳链菌肽产品产量低、价格昂贵，严重限制了其在食品工业中的应用。尽管采用理化诱变、杂交等常规微生物筛选技术选育乳链菌肽高产菌株已取得一定效果，但还未获得真正意义上的高产菌株。近年来，随着分子生物学及其相关技术的发展，国内外学者将目光投向了基因工程技术领域，希望通过构建基因工程菌来获得乳链菌肽的高产。乳酸乳球菌作为一类长期应用于乳品发酵的食品级微生物，最近十多年来其遗传学及分子生物学在国内外引起了广泛关注并获得迅速发展“”。其一，乳酸乳球菌本身具有染色体外因予如质粒和噬菌体，为其载体系统的发展提供了极好的材料。其二，乳酸乳球菌易培养，遗传操作( 如电穿孔法转基因等) 方法成熟简便。其三，乳酸乳球菌本身为食品级，并具有分泌蛋白质的能力，因此可望用以构建新型的食品级基因克隆表达的受体系统。乳酸乳球菌在表达异源多肽或蛋白、研制新型功能食品、药品及防癌保健品等领域具有极好的应用前景。本研究将n i s i n 与乳酸乳球菌结合起来，以乳酸乳球菌n i z or 5 为获取目的基因的原材料，利用p c r 技术，从基因组i ) n a 中扩增出n i s i n 前体基因，克隆入表达质粒p m g 3 6 e ，转入乳酸乳球菌n z 9 8 0 0 ，进行了n i s i n 前体基因在乳酸乳球菌中的表达研究，对一条新的表达路线进行了新的探索，为最终实现n i s i n 基因的表达奠定了基础。为以乳酸乳球菌为宿主菌表达有价值的外源基因奠定了基础。不过，目前所用的载体p m