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白氏文昌鱼b a c 测序与比较基因组学分析 摘要 文昌鱼是现存与脊椎动物最接近的活化石，其形态和发育过程与脊椎 动物的共祖十分接近。为了进一步了解文昌鱼基因组序列信息，我们从一 个白氏文昌鱼的细菌人工染色体( b a c ) 克隆开始，使用鸟枪法测序策略 成功构建了白氏文昌鱼一个b a c 的亚克隆文库。经检验合格后对该亚克隆 文库进行了大规模测序。共测得1 9 8 4 条r e a d s ，其中亚克隆r e a d s 有1 8 8 5 条，f i n i s hr e a d s9 9 条，平均达到该b a c 的8 1 5 倍覆盖。最终得到了拼接 精度为9 9 5 3 ，长度为1 1 8 k b 的b a c 序列( 未公开) 。 在此基础上对此b a c 序列进行了比较基因组学分析，其基因组组成中 有腺嘌呤2 9 9 1 ，胞嘧啶2 0 5 6 ，胸腺嘧啶2 9 3 2 和鸟嘌呤2 0 2 0 ，总 的嘌呤碱含量为5 0 1 1 ，g c 含量为4 0 7 6 。序列中含有1 3 5 的重复序 列，未发现有短散布核元件。同时还发现了一个6 3 1 b p 的回文序列。经同 源比对，在核酸水平上未发现有与此b a c 序列高度同源的大片段，但发现 多处小的同源序列。在此b a c 中发现可能存在1 8 个基因，其中1 3 个可以 通过同源比对确定其所属类群。这些基因平均有6 9 4 个外显子，5 9 4 个内 含子。本研究测序完成的长度超过1 1 0 k b 的白氏文昌鱼基因组连续序列约 占白氏文昌鱼基因组0 0 2 ，这将为人们进一步了解文昌鱼的基因结构提供 了一些信息，为认识基因组进化历程奠定了基础。 关键词：白氏文昌鱼鸟枪法测序比较基因组学分析 b r a n c h i o s t o m a b e l c h e r lb a cs e q u e n c i n ga n d c o m b 刘耻钢【1 v eg e n o m i c sa n a iy s i s t h ec e p h a l o e h o r d a t ea m p h i o x u s ( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) i st h ee l o s e s t l i v i n g i n v e r t e b r a t er e l a t i v eo f t h e v e r t e b r a t e s m o r p h o l o g i c a l l y a n d d e v e l o p m e n t a l l yi tc l o s e l yr e s e m b l e st h el a s tc o m m o na n c e s t o ro fa l lv e r t e b r a t e s i no r d e rt og e tm o r ei n f o r m a t i o nf r o ma m p h i o x u sg e n o m e ，ab a c t e r i a la r t i f i c i a l c h r o m o s o m e ( b a c ) o fb r a n c h i o s t o m ab e c h l id n a w a si s o l a t e d t h e l l ，a s h o t g u nl i b r a r yw a sc o n s t r u c t e d a f t e rv e r i f i e dt h ei n s e r t i o np e r c e n t a g ea n d c o n t a i n s ，t h el i b r a r yw a su s e df o rl a r g es c a l es e q u e n c i n g t o t a lo f1 9 8 4r e a d s w a ss e q u e n c e d ，i n c l u d i n g1 8 8 5s u b d o n er e a d sa n d9 9 f i n i s hr e a d s a n a v e r a g e 8 1 5f o l dr e a d sa s s e m b l i e d1 1 8 k bl e n g t ho fb a cs e q u e n c e ( u n p u b l i s h e d ) w i t h9 9 5 4 a c c u r a t ew a sg o t t e na f t e rf i n i s h w ea n a l y z e dt h ec o m p o s i t i o no fs e q u e n c ef i n i s h e d t h e r ei s2 9 9 1 a d e n i n e ， 2 0 5 6 c y t o s i n e ，2 9 3 2 t h y m i n ea n d2 0 2 0 g u a n i n e ，t h ep u r i n ei so v e r a u 5 0 1 1 a n dg + cc o n t e n ti s4 0 7 6 1 1 l et o t a lr e p e a ts e q u e n c ep e r c e n t a g ei s 1 3 5 a n dn os h o r ti n t e r s p e r s e dn u c l e a re l e m e n tw a gf o u n d o n e6 3 1 b p p a l i n d r o m i cs e q u e n c ef r a g m e n tw a gi d e n t i f i e d w ec o u l dn o tf o u n dh i ：g h l e v e l h o m o l o g u es e q u e n c ea tn o n er e d u n d a n c yn u c l e o t i d ed a t a b a s e w h i l em a n ys h o r t f r a g m e n tc o u l db ei d e n t i f i e d a tb r a n c h i o s t o m af l o r i d e a a s s e m b l y e i g h t e e n g e n e sm a yb ee n v e l o p e di nt h i sb a c t h e s eg e n e sc o n t a i n e da v e r a g eo f6 9 4 e x t r o n sa n d5 9 4i n t r o n s at o t a lo f1 1 8 k bg e n o m ed a t ah a sb e e ng o t t e nf r o mt h i sb a c , w h i c h r e p r e s e n t s0 0 2 o ft h ew h o l eg e n o m es i z e w ec o u l df i n do u tn e wf e a t u r e s f r o mt h ed a t a t h ew o r kh a st o u c h e dt h ep r e l u d eo fs e q u e n c eo fb r a n c h i o s t o m a 6 p 缸 p 一 k e yw o r d s ：b r a n c h i o s t o m a b e l c h e r i ；s h o t g u n s e q u e n c i n g ； c o m p a r a t i v eg e n o m i c sa n a l y s i s 1 1 1 广西人学硕士学位论文白氏文吕鱼b a c 测序与比较基冈纽学分析 第一部分文昌鱼基因组学研究进展 一、白氏文昌鱼形态与分类 ( 一) 分类研究 文昌鱼属脊索动物门头索动物亚门，是全世界现存动物中与脊椎动物关系最近的一 类非脊椎动物，已知这一亚门动物现存2 9 种左右i l j 。白氏文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a b e l c h e d ) 这一物种最初由g r a y 于1 8 4 7 年根据采自b o r n e o 的标本，认为它是一个新物种【1 一。此 后的动物分类学家研究认为分布于厦门、青岛、台湾、日本等地的文昌鱼均为b b e l c h e r i ， 中文译名为白氏文昌鱼或白氏鳃口鱼，最早由当时在厦门大学生物系担任动物学教授的 美国学者u g h t 在1 9 2 3 年首次发表1 3 1 ，b o r i n g 等在1 9 3 2 年1 4 1 6 ) 1 = 究厦门的文昌鱼分类学 特征后，正式鉴定为种名，至今一直在沿用i s 。据文献记载1 6 1 ，该物种分布海域十分广 阔，在自印度洋非洲东岸，印度尼西亚，日本和菲律宾海海域均有分布，我国主要产于 台湾海峡、东海和黄海。 虽然文昌鱼在动物进化中的地位极为重要，但由于它们是一类营钻沙生活的小型动 物，除中国厦门历史上曾形成过渔场，有一定的产量外，一般认为经济价值较小，关于 文昌鱼的分类学研究相对较少t c h a n g 在1 9 3 6 年1 7 比较了采自胶州湾的文昌鱼标本和 b b e l c h e r i 的肌节、鳍条数等形态学特征后，认为产自该海域的文昌鱼为一新亚种，将 其定名为白氏文昌鱼青岛亚种b b e l c h e r i t s i n g t a u e n s e ，习惯上称为青岛文昌鱼。周才武 于1 9 5 8 年研究了产白海南、厦门、青岛和烟台的文昌鱼标本后，认为青岛和烟台两地 产的文昌鱼与厦门和海南产的文昌鱼有较显著的差异，前二者同属白氏文昌鱼青岛亚 种，此后，学术界将产自胶州湾及其邻近海域的文昌鱼作为青岛亚种，其他产区的文昌 鱼仍被称为且6 砌e r f 【8 】。n i s h i k a w a 在比较了大量的文昌鱼标本后认为，产自日本的文 昌鱼主要是b b e l c h e r i t s i n g t a u e n s e 而产自日本a r i a k e 和a m a k u s a l s l a n d s 的文昌鱼则是介 于b b e l c h e r i t s i n g t a u e n s e 和b b e l c h e r i 之间的一个中间类型1 9 。2 0 0 1 年，曹玉萍等详细 地比较了产自厦门、青岛和秦皇岛的文昌鱼体形、肌节数、背腹鳍条和生殖腺数，三地 所产的文昌鱼在形态上虽有定差异，但各地标本的数量性状特征又互有交错，初步认 为它们均为白氏文昌鱼b b e l c h e r i ，其中秦皇岛文昌鱼与青岛的文昌鱼亲缘关系较近， 但准确的分类地位尚待进一步研刭。y a m a g u c h i 在2 0 0 3 年的研究也认为日本a r i a k e 产的文昌鱼属于二者间的一个中间类型【1 1 ，1 2 1 。 全世界文昌鱼的种类虽然并不多，却广泛分布于大西洋、太平洋、印度洋的热带和 温带海岸，这类体形不大的动物都有着相似的生活方式，均生活在浅海沙滩，成体潜入 海底沙中，营滤食生活，进化的趋同性致使这类动物在外部形态特征上也十分相似。常 用的分类学特征如口等触须数目、肌节数、鳍条数等由于变异范围大，不同产地标本的 间晃线模糊，给分类学研究带来困难。目前大家普遍接受的分类地位如下：白氏文昌鱼 广西大学顾上学位论文白氏文吕鱼b a c 测序与比较基阑组学分析 属于脊索动物门( c h o r d a t a ) 头索动物亚门( c e p h a l o c h o r d a t a ) 文昌鱼纲( a p p c n d i c u l a r i a ) 文昌鱼目( a m p h i o x i f o r m e s ) 文吕鱼科( b r a n c h i o s t o m a t i d a c ) 文昌鱼属( b r a n c h i o s t o m a ) 6 1 ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v t a x o n o m y ) 。 ( 二) 形态与生活特性 文昌鱼状似小鱼，身体无色透明，它通常生活于浅海沙砾中，形体结构和胚胎发生 与无脊椎动物如棘皮动物有许多相似之处：表皮为单层上皮，其外有角质层：结缔组织 不发达；许多器官有分节；胚胎有纤毛，能在水中游泳等。同时，文昌鱼和脊椎动物有 更多的共同特征：两者都有脊索；都有位于脊索背部的神经管；成体和胚胎均有鳃裂和 肌节；胚胎发生时期还有神经管和消化道相通的神经肠管等特点。这些相似性证明脊椎 动物和文昌鱼在早期形态发生的过程中有共同的发育机制。文昌鱼不仅在形体结构上与 脊椎动物相似，其基因组的组成形式也与之非常类似，只是要简单得多文昌鱼代表着 从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中一个重要的过渡阶段，被认为是现存的与脊椎动物 最接近的无脊椎动物，文昌鱼可能是脊椎动物始祖的现存代表。因此，文昌鱼是揭示脊 椎动物起源从而进一步了解人类自身的宝贵材料，是研究动物进化和胚胎发育的活化石 与目前脊椎动物最为接近的无脊椎动物i 协堋。 二、文昌鱼基因组学研究进展 ( 一) 文昌鱼功能基因研究。 文昌鱼的功能基因研究工作近年来迅速开展，最初由单个功能基因的探索逐渐扩展 到对信号通路中各基因相互作用，同源基因家族的成员的分型与进化等多个领域。 1 单个功能基因研究 一些脊椎动物的b r a c h y u r y 基因被成功克隆后研究表明b r 吣h v u r v 基因是脊索形成的 关键基因，h o l l a n d 等分离得到了两个与b r a c h y u r y 高度同源的文昌鱼c d n a 克隆，进一步 发现两个独立的基因位座形成与基因复制，并推测文昌鱼具有了脊椎动物原型的基因组 结构。文昌鱼的b r a n c h y u r y 基因的在文昌鱼发育过程中表达时空特异性与脊椎动物十分 类似。进一步猜测文昌鱼的b r a c h y u r y 基因可能有更古老的祖先基因1 1 6 1 。h o l l a n d 在接下 来的两年内，完成了文昌鱼a m p h i d l l 基因的测序与发育阶段表达，文昌鱼a m p h i e n 基因 测序与胚胎期表达和文昌鱼a m p h i t o b 基因测序与表达分析工作1 1 7 _ 1 9 1 。 s h i m e l d 等对文昌鱼的h n f - 3 基因的表达情况和功能进行初步研究，发现在文昌鱼中 有两个h n f - 3 基因，分别命名为a m h n f - 3 1 和a m 玎q f - 3 2 ；在胚胎发育早期这两个基因 均被检测到表达1 2 0 。垂体特异转录因子一1 ( p i t u i t a r y s p e c i f i ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，p h 1 ) 是重要的组织特异性转录因子，对生长激素( g h ) 基因表达起重要的调控作用，还与 促乳素基因p r l 的表达及垂体细胞的分化、增殖有关。c a n d i a n i 等通过扫描电镜，免疫 2 广西大学硕士学位论文 白氏文昌鱼b a c 测序与比较基因组学分析 组化和w e s t e r n 杂交等技术手段对文昌鱼的p i t 1 基因进行了定位。在免疫标记上的细胞里 发现两种典型的p i t 1 基因结构，经s d s p a g e 电泳和w e s t e r n 杂交分离得到文昌鱼 3 3 k d a 大小的p i t 1 基因蛋白。并确定在成体文昌鱼中p i t 1 表达于神经细胞和上皮细胞【2 l j 。 l a n g e l a n d 等1 9 9 8 年报道了与果蝇s n a i lg o n e 匾 源的一个文昌鱼的s n a i l 基因，发现该 基因表达于近轴的中胚层和神经板，通过氨基酸序列的系统发生分析，文昌鱼的s n a i l 基 因处于所有已经确认的脊椎动物的外群，并根据胚胎形成过程中的作用推测可能s n a i l 基 因的作用可能保守的存在于所有的脊索动物中1 2 2 j 。p a n o p o u l o u 等研究了文昌鱼骨形成蛋 白( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n ) 基因( a m p h i b m p 2 4 ) ，该基因在文昌鱼中为单基因， 与脊椎动物骨形成蛋白基因b m p 2 和b m p 4 高度同源。在文昌鱼的胚胎发育过程中， a m p h i b m p 2 4 基因参与外胚层背腹轴的发育，同时还有推测该基因参与了体节外翻 ( s o m i t ee v a # n a t i o n ) 、尾芽生长、咽的分化，后肠( h i n d g u t ) 定位等功能l 驯。s c h u b e r t 等对文昌鱼的横纹肌恶性肿瘤基因调控基因( a m p h i o x u sd o w n - r e g u l a t e di n r h a b d o m y o s a r c o m al i m - p r o t e i n , a m p h i d r a l ) 进行了测序和表达的研究，这是此类基因 的共生同源基因第一次无脊椎动物中开展的研究1 2 4 j 。 根据文昌鱼的肌肉和神经的研烈2 5 】认为文昌鱼的尾巴生成与神经，e v x 基因在脊椎 动物的胚胎的三胚层发育、神经管形成和附肢形成过程中起重要作用，f e r r i e 等以文昌 鱼的e v x 基因为材料研究了文昌鱼的两个e v x 基因( a m p h i e v x a , a m p h i e v x b ) 与脊椎动 物的e v x 基因家族的功能比较与保守程度，a m p h e v x a 基因可能在两侧对称动物中就已 经出现同时功能比较保守，在原肠胚形成，背脊神经管生成等过程发挥重要作用；而 a m p h e v x b 贝l j 高度分化1 2 6 。 内柱( e n d o s t v l e ) 是尾索、头索和早期脊椎动物咽的一部分。内柱具有宦集碘和碘 代谢的活性，具此内柱被认为是甲状腺分泌泡的同源元件。在哺乳动物中编码甲状腺转 录因子1 ( t h y r o i dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r - 1 ，t i b l ) 和甲状腺过氧化酶( t h y r o i dp e r o x i d a s e ， t p o ) 的两个基因均在甲状腺中表达，并且t i b l 调控t p o 的表达。o g a s a w a r a 克隆了 白氏文昌鱼的t t f - 1 和t p o 基因，并通过r t - p c r 和s o u t h e r n 杂交技术确定文昌鱼的 1 1 b l 和t p o 基因主要表达于文昌鱼成体的内柱中。通过原位杂交发现文昌鱼1 1 8 1 基因从胚胎形成时期开始表达，一直持续表达于成体内柱中各个区域。文昌鱼t p o 基 因主要表达于成体的内柱带5 和带6 区，其表达受文昌鱼r n 艮l 基因调控。这些时空表 达的证据表明内柱是甲状腺分泌泡的同源器官，而甲状腺过氧化酶的表达受甲状腺转录 因子1 的调控机制早在文昌鱼中就已经形成吲。 脊椎动物中m n x 基因家族中h b 9 基因，其上游调控基因基因m n r 2 共同参与神经 元的分化；在文昌鱼中与之相对应的同源基因已经被确认，在文昌鱼的发育过程中的神 经管内f e r r i e r 等确认了a m p h i m n x 的信使r n a ，通过比较发现脊椎动物的h b 9 ，m n r 2 与文昌鱼的a m p h i m n x 基因和果蝇的直系同源( o r t h o l o g u e s ) 基因共为同一基因家族1 。 广西大学硕七学位论文自氏文吕鱼b a c 测序与比较基劂组学分析 根据组织溶原复合体( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 的共生同源 ( p a r a l o g o u s ) 序列的研究嗍，a b i r a c h e d 等克隆了文昌鱼的相应区域的9 个m h c 祖 先基因并对这些基因和两侧的各2 0 0 b p 的区间进行了测序，根据这9 个祖先基因与其他 2 4 个基因序列通过系统发生分析，认为脊椎动物全基因组复制( w h o l eg e n o m e d u p l i c a t i o n ) 发生于有颌总纲( g n a t h o s t o m a t a ) 分化之前。i j 等报道了文昌鱼的酚氧化 酶( p h e n o l o x i d a s e ) 在神经管和外胚层胚胎发育过程中的作用，结果发现酚氧化酶活性存 在于外胚层包括早期神经胚时期而不在中胚层和内胚层，当神经盘与外胚层分离时不在 表达于神经管p o 。h u a n g 等对白氏文昌鱼在金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r c u s ) 和 副溶血弧菌( v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ) 感染后基因转录表达的情况同哺乳动物具有类似 的精确免疫应答基因( 凝集素，金属蛋白酶，溶菌酶和抗菌肽等) 的表达天免疫系统中 几个新的精确的免疫应答基因进行了系统的研究，确定了基因组序列，m r n a 序列，蛋 自信息等【3 1 】。 2 w n t ，n o t c h 和h e d g e h o g 信号通路 文昌鱼的多个参与生命过程的重要的基因或基因家族已经开展了深入的研究。w r i t 基因是一类高度保守的信号蛋白家族，在机体发育和疾病发生中所起的重要作用。通过 不同种分子问的相互作用，w n t 蛋白触发了调节细胞生长、迁移、分化及发育等多方面 的复杂信号级联反应。在研究得最透彻的经典通路中，w n t 信号分子与细胞表面的两个 辅助受体f r i z z l e d 和l r p 同时结合，从而避免了b 连锁蛋白( f l - c a t e n i np r o t e i n s ) 的降 解，使其能够稳定地进入细胞核，与转录因子复合物硎e f 结合，激活与细胞生存、 增殖或分化相关的基因表达，而不恰当的b 连锁蛋白激活往往和许多肿瘤发生相关。 w n t 配体也在一些非经典信号通路中发挥作用。s c h u b e r t 等在经过c d n a 测序之后发现 了5 个新的文昌鱼w n t 基因，通过氨基酸和核酸构建分子系统进化树，在比较了8 2 种 已经知的w n t 序列之后确定a m p h i w n t 5 和a m p h i w n t l 0 为w n t 家族中新的基因【3 2 】。2 0 0 1 年s c h u b e r t th o l l a n d 等发现w n t 基因家族的文昌鱼三个w n t 基因( a m p h i w n t 3 ， a m p h i w n t 5 ，a m p h i w n t 6 ) 的表达对表皮细胞和问质形成尾芽的过程中发挥着极其重要 的作用【3 3 1 。 n o t c h 基因为在决定细胞命运的事件中起作用的细胞表面蛋白编码基因，n o t c h 信 号通路在胚胎发育中，当上皮组织的前体细胞中分化出神经元细胞后，其细胞表面n o t c h 配体d e l t a 与相邻细胞膜上的n o t c h 结合，启动信号途径，发挥侧向抑$ i j ( 1 a t e r a l i n h i b i t i o n ) 作用，防止其它细胞发生同样的分化。n o a h 突变的杂合子或纯合子会导致胚胎期死亡。 h o l l a n d 等克隆了文昌鱼的n o t c h 基因( a m p h i n o t c h ) 7 , 5 7 5 b p 的编码区，确定了2 , 5 2 4 个氨基酸序列，通过c o s m i d 克隆，找出了外显子和内含子在基因组中的定位情况。 a m p h i n o t c h 基因和果蝇的n o t c h 基因，脊椎动物的n o t c h l 和n o t c h 2 具相似性，存在 3 6 个e g f 类似重复序列，3 个n o t c h l i n 1 2 重复区，一个跨膜区和6 个锚定蛋白重复序 4 广西大学硕士学位论文自氏文昌鱼b a c 测序与比较摹田纽学分析 列( a n k y f i nr e p e a t s ) 。通过p c r 和s o u t h e r nb l o t 杂交确认了n o t h c 基因在文昌鱼中为单 拷贝基因，同果蝇的n o t h c 基因，脊椎动物n o t c h 基因家族中的三个基因通过分子系统 发生( p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ) 研究提示a m p h i n o t c h 与脊椎动物的n o t c h 基因家族的同 源( h o m o l o g s ) 基因明显的聚在一起。同时，还发现a m p h i n o t c h 与其他脊椎动物一样 与w n t 信号通路共同在早期胚胎体轴形成期与b r a c h y u r y 基因共同作用来调控体胚体形 成【卅。 h e d g e h o g ( m ) 基因编码一种高度保守的分泌型糖蛋白，首先在果蝇中发现，随 后在脊椎动物( 斑马鱼、小鼠、鸡、人等) 中发现了h h 的同源基因，构成了h h 基 因家族，研究发现它对动物发育过程中许多组织的定向分化有重要的调控作用。人类存 在3 种h h 的同源基因：s o n i ch e d g e h o g ( s h h ) ， i n d i ah e d g e h o g ( 1 h h ) 和 d e s e r t h e d g e h o g ( d h h ) 。s h h 包括具有信号活性的n 末端和具有自身蛋白水解酶及胆 固醇转移酶作用的c 末端。通过自我剪切和脂质修饰后，s h h 获得完全的信号活性。 z e n g 等描述了一种可溶的可以自由扩散的多聚h h ，这种多聚形式的h h 可以从合成 它的细胞中释放出来，使长距离的信号转导成为可能 3 s i 。s h i m e l d 对文昌鱼的h e d g e h o g 基因进行了研究，首先确定了文昌鱼中h e d g e h o g 基因的一个单拷贝基因，a m p h i h h ， 并推测可能h e d g e h o g 基因家族在文昌鱼中仅有该基因。a m p h i h h 表达于脊索和背腹神 经管，其信号通路与脊椎动物相比具同样的模式其表达位置与作用方式同脊椎动物的 s o n i c 型h e d g e h o g 基因一致1 3 6 j 。 3 h o x ，p a x 等同源框基因家族 同源框基因是一种含1 8 0 b p 高度保守序列的基因，能编码螺旋一转角一螺旋结构的 d n a 结合域即同源结构域( h d ) 。 h o x 基因( 即同源异形基因) 它们具有1 8 0b p 的保守区域称为h o m e o b o x ，编码了 一个含6 0 个氨基酸能结合d n a 的结构域，在动物的发育过程中起到关键作用，其中包 括确定沿着身体轴线的体节发育等。h o x 基因首先在黑腹果蝇中发现，后来在包括人类 在内的所有动物中均有发现。h o l l a n d 等在1 9 9 2 年发现文昌鱼的胚胎发育与脊椎动物的 胚胎发育有很多相似之处，为了解文昌鱼胚胎发育期关键形态变化的分子的机制，开展 了文昌鱼h o x 基因的测序与分析工作，并确定了与哺乳动物同源的a m p h i h o x 3 基因。 通过原位杂交技术确定了a m p h i h o x 3 表达于中胚层后段( p o s t e r i o rm e d s o d e n n ) ，但不 在体节中表达，进一步研究发现a m p h i h o x 3 特定表达于背神经管p ”。1 9 9 4 年，h o l l a n d 等人根据h o x 基因簇在不同物种内的拷贝数，胚胎发育过程等研究，认为从文昌鱼到脊 椎动物的h o x 基因簇变化提示基因复制是脊椎动物进化的原动力l 蚓。1 9 9 6 年h o l l a n d 等人使用视黄酸( r e t i n o i ca c i d ) 来诱导文昌鱼a m p h i h o x 1 和a m p h i p a x 1 基因在文昌 5 广硬人学硕二l ：学位论文白氏文晶鱼b a c 测序与比较基阑组学分析 鱼的胚胎时期表达，从而对背神经管和咽由无脊椎动物向脊椎动物演化的过程进行了深 入研究1 3 9 1 。同年，h o l l a n d 等在比较了海鞘，文昌鱼，八日鳗类鱼，硬骨鱼类的h o x 基 因簇的分化，基因组定位信息，胚胎时期h o x 基因及相关作用基因表达情况后，认为 h o x 基因可以说明脊索动物的系统发生问题。通过比较h o x 3 基因在脊椎动物后脑和文 昌鱼的背神经管表达情况以及文昌鱼h o x 1 基因的表达和在脊椎动物中定位，认为文吕 鱼是研究脊椎动物大规模基因复制，基因表达调控网络，生长发育机制和脊椎动物起源 的模式动物【柏j 。w a d a 等在1 9 9 9 年对文昌鱼的h o x 基因簇进行了细致的研究，描述了 文昌鱼的a m p h i h o x 1 到a m p h i h o x - 4 的基因组位置结构和表达位置情况，并认为这四 个基因是时空表达共线性的，其中a m p h i h o x 1 ，a m p 蝴o x 3 和a m p h i h o x 4 在神经管 发育过程中还遵循空间共线性的规律1 4 ”m a n z a n a r c s 等在2 0 0 0 年在比较了文昌鱼和脊 椎动物的h o x 基因表达情况和调控过程发现了新的与发育相关的表达域( e x p r e s s i o n d o m a i n ) ，通过检测转基因小鼠和鸡的胚胎中文昌鱼的h o x 基因的基因组顺式作用元件 的活性，发现了约5 0 0 0 万间进化保守的h o x 基因顺式表达元件，包括一个依赖视黄酸 的信号通路。尽管头索动物缺少神经嵴细胞和听基板，m a n z a n a r e s 等还发现了文昌鱼的 h o x 基因调控元件调节h o x 基因在脊椎动物的神经脊细胞和听基板( n e u r o g e n i c p l a c o d e s ) 和肢端的特异位置( s p a t i a l l yl o c a l i z e d ) 表达。从而证实了脊椎动物祖先的h o x 基因簇在进化过程中受顺式表达元件的精确调控 4 2 1 。e s c r i v a 等在2 0 0 2 年克隆了文昌鱼 视黄酸受体基因( a m p h i r a r ) ，视黄醇类x 受体( a m p h i r x r ) 和一个孤儿受体( o r p h a n r e c e p t o r ) 基因( a m p h i t r 2 4 ) 。a m p h i t r 2 4 基因抑制a m p h i r a r - a m p h i r x r 介导 a m p h i h o x l 基因的表达上游调控1 4 3 i n p a x 基因广泛存在于动物界中，在果蝇的p o xm e s o 基因和脊椎动物的p a x 1 和 p a x 9 基因确定后，h o l l a n d 等开展了文昌鱼p a x 基因的功能和编码序列研究。通过构建正 在发育过程中的文昌鱼c d n a 文库策略，获得了一个文昌鱼的p a x 基因( a m p h i p a x - 1 ) ， 该基因有2 5 k b ，编码3 3 7 个氨基酸，与人和鼠的p a x 1 和p a x 9 基因9 2 同源。通过原位杂 交检测到文昌鱼的a m p h i p a x 1 仅表达于发育期内胚层咽的位置；同时未在中胚层的任何 位置检测到a m p h i p a x 1 基因具有转录活性 4 4 1 。g l a r d o n 等分离出文昌鱼p a x 6 基因 ( a m p h i p a x - 6 ) ，此基因在文昌鱼中是单拷贝基因，其转录的m r n a 有多种可变剪切方 式，可以产生多种明显不同的氨基酸编码和碳末端氨基酸。文昌鱼的a m p h i p a x 6 蛋白与 哺乳动物相比较其同源框结构域可1 0 0 识别，具9 2 的同源性。文昌鱼的p a x 6 基因表 达于将会发育成被认为与脊椎动物眼睛同源的板层体( 1 a m e l l a rb o d y ) ，然后在文昌鱼 中两处光感受体处并未发现有p a x 6 的表达1 4 5 1 。h o l l a n d 等研究了与脊椎动物p a x 3 和p a x 7 基因同源的文昌鱼a m p h i p a x 3 7 基因，此基因在文昌鱼基因组中可能只是一个单拷贝基 因。可能与肌肉发生和前端中枢神经的发育相关【蛔。同年，k o z m i k 等发现a m p h i p a x 扔8 基因表达于发育阶段的文昌鱼的光感细胞，肾管，类甲状腺组织和咽，但不表达于中脑 一后脑边界 4 7 1 。k r e l o v a 等比较了文昌鱼的转录因子p a x 家族表明，文昌鱼的p a x 基因与 6 广两人学硕：b 学位论文白氏文只鱼b a c 测序与比较基阑组学分析 人类的p 瓢转录因子家族具有高度的序列相似性和功能同源性【4 8 , 4 9 1 。 g o o s e c o i d 基因编码一个同源异型盒基因，最先表达于原肠胚，之后在形态发生期表 达于第一，二鳃弓处，在头部及外胚层的形态发生中起重要作用，当异位表达时可引发 畸形。n e i d e r t 等克隆并测定了文昌鱼的g o o s e c o i d 基因的表达情况。在文昌鱼中，g o o s e c o i d 基因主要表达区并不在中胚层脊索前体的位置，而在原肠胚形成时的胚孔边缘 ( b l a s t o p o r el i p ) 的中胚层脊轴位嚣。文昌鱼与脊椎动物的窖0 0 s e c o i d 基因表达的共同点 表明头部的形成早于脊椎动物的祖先；而二者的表达差异则可以说明头索动物缺少脊柱 前体区( p r o c h o r d a lp l a t ed o m a i n ) ，而脊椎动物雕j g o o s e c o i d 在脊柱前体的表达在前脑 的形成中发挥重要作用刚。 n k 2 型同源框基因家族成员均可编码1 个含c o + 高度保守氨基酸的d n a 结合结构域 h d ，h d 空间构像上有3 个a 螺旋结构，通过第3 个a 螺旋与双链d n a 表面大沟结合，大 多数同源框家族h d 与d n a 特异序列t a a a t 结合，而n k 2 型家族h i ) 与d n a 的1 c a a g 序列结合，第4 位核甘酸是g 而非t ，n k 2 家族所特有的h d 的第5 4 位氨基酸是酪氨酸，负 责特异性地识别、结合d n a 。h o l l a n d 等确认了表达于原肠胚后期内胚层腹而的文昌鱼 n k 2 型同源框基因家族的a m p h i n k 2 2 基因，第一次分离得到非脊椎后口动物的n k 2 同源 框基因。根据保守区氨基酸的比对发珊u n p h i n k 2 2 基因分别与果蝇的d 基因和脊椎动 物的n k x 2 2 基因同源l 5 ”。 ( 二) 文昌鱼基因组研究 i 染色体结构与核基因组研究 在1 9 7 9 年，s c h m i d t k e 等，利用d n a 重组技术对文昌鱼的基因组内重复序列和非 重复序列的组成位置情况进行了研究，根据文昌鱼和海鞘的一些非重复序列的比较结 果，认为脊索动物不是海鞘多倍体演化来的。文昌鱼内基因组中重复序列和非重复序列 明显的( p r e d o m i n a n t l y ) 在短的区域内散在分布，首次了阐述文昌鱼基因组结构与脊椎 动物类似5 2 1 。1 9 9 4 年，g a r c i a f e r m a n d e z 等在前人已经确认h o x 基因在线虫和昆虫中为 单基因簇，而在哺乳动物中有4 个基因簇3 8 个h o x 基因的研究基础上，对文昌鱼的h o x 基因簇在基因组上的位置结构进行研究。发现文昌鱼只有1 个h o x 基因簇，与哺乳动物 的h o x 基因具有相似的基因组位置结构( g c n o m i co r g a n i z a t i o n ) ，并且至少与脊椎动物 的前十个共生同源( p a r a l o g o u s ) h o x 基因在同一个共线性组内。并由此得到了文昌鱼 是h o x 基因进化这程中的重要的现存中间阶段物种的结论【5 3 】。h o l l a n d 等，认为海鞘， 文昌鱼和脊椎动物的h o x 基因簇及同源框基因家族，w n t 基因和胰岛素相关基因都表明 在文昌鱼世系分化后脊椎动物的近祖发生了一次大规模基因复制，从文昌鱼到脊椎动物 的进化历程中一批新功能的基因在复制过程中产生i 蚓。t w e e d i e 在1 9 9 7 年对文昌鱼全基 因组甲基化水平进行了研究，发现从小区段的甲基化到全基因组甲基化与脊椎动物起源 7 广西大学颂i ：学位论文白氏文吕鱼b a c 测序勺比较基围组学分析 有着明确的相关性，原始的脊椎动物，如八目鳗鱼和七鳃鳗鱼有着典型的脊椎动物基因 组甲基化的特点，而文昌鱼基因组则表现出典型的无脊椎动物甲基化特点【跚。文昌鱼基 因组相对简单，没有大规模的基因复制，是研究脊椎动物发育过程，进一步揭示脊椎动 物生命过程的模式动物1 1 3 j 。 2 线粒体测序与系统发生分析 s p r u y t 等在1 9 9 8 年完成了文吕鱼( b r a n c h i o s t o m al a n c e o l a t u m ) 线粒体全基因组的 测定工作，测定的线粒体全长为1 5 ，0 7 6 b p ，含有两个短的r r n a 基因和t r n a 基因和一 段非常短的非编码区( 5 7 b p ) 。包括两个r r n a 基因和1 3 个编码蛋白的基因顺序( g o n e o r g a n i s a t i o n ) 与七鳃鳗一致。密码子使用有明显的偏好性，第三位是鸟苷核的比例较高， a g a 密码子翻译成甘氨酸，这点与脊椎动物线粒体中该密码子被作为终止子明显不同， 而更象是无脊椎动物【5 5 】。1 9 9 9 年b o o i 等人对佛罗里达文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a f l o r i d a e ) 的线粒体基因组进行了测序工作，得到了1 5 ，0 8 3 n t 的测序结果。与多数后生动物一样有 1 3 个编码蛋白基因，2 个r r n a 基因和2 2 个t r n a 基因。与普通脊椎动物相比有四个 t r n a 的基因位置不同，其中有3 个排列形式为文昌鱼所特有，第四个是脊索动物所共 有的。在佛罗里达文昌鱼的线粒体基因组中使用的密码子中，除a g a 编码丝氨酸外， 其他密码子与脊椎动物通用。与脊椎动物相比，佛罗里达文昌鱼缺少与脊椎动物线粒体 基因组中类似的大的非编码区，其最长的非编码区只有1 2 9 n t ；同样也缺少一个可能的 d n a 发夹结构来作为复制的起点闭。 k u s a k a b e 等比较了白氏文昌鱼和佛罗里达文昌鱼的肌动蛋白基因在基因组中的组 织结构和探讨了可能存在的进化机制。两种文昌鱼都具有两种典型的肌动蛋白基因，肌 型和细胞质型( m u s c l ea n dc y t o p l a s m i c ) ，通过比较外显子一内含子和非翻译区核苷酸序 列，发现佛罗里达肌型肌动蛋白基因b f m a l 和b f m a 2 之问可能发生过基因转换 ( c o n v e r s i o n ) 。通过文昌鱼肌动蛋白基因内含子的保守位点和其他后口动物的肌动蛋白 基因序列，对后口动物肌动蛋白的进化历程进行了推断。早期脊椎动物与其他后口动物 分化以后，肌型和细胞质型的肌动蛋白基因之间可能发生过一次转换【5 7 】。 n a y l o r 等选取了包括佛罗里达文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a f t o r i a a e ) 在内的1 9 个后生动 物的1 3 个线粒体编码蛋白基因( 1 2 ，2 3 4 b p ) 在做系统发生过程中未能构建成脊索动物广 泛接受的进化关系树1 5 引。p e b u s q u e 等根据一些共生同源基因家族的特性，从e m b l 数 据库中搜寻后进行系统发生分析。每个基因家族中只有一个基因具高度相似性，在哺乳 动物中有基因复制。并进一步推测两轮大规模全基因组复制发生与文昌鱼与脊椎动物共 祖分化之后的脊椎动物的祖先1 5 9 】。文昌鱼的线粒体测序与进化分析工作f 删为人们进一步 研究此物种基因组奠定了基础。 三、大规模测序及生物信息技术的发展推动文昌鱼基因组测序开展 8 广西大学硕士学位论文白氏文吕鱼b a c 测序与比较基州组学分析 ( 一) d n a 测序与生物信息技术概述 1 测序方法的发展 1 9 7 7 年s a n g e r 等提出了双脱氧链终止测序法【6 ，同年m a x a m 和g i l b e r t 【6 2 】发明了 化学降解法测序。双脱氧法利用d n a