（农药学专业论文）拟酶生物传感器和细胞生物传感器的研究与应用.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 本论文的工作主要包括以下几方面：1 ) 超氧歧化酶拟酶c h h c u 的自组装及其 作为生物传感器对超氧阴离子的检测；2 ) 4 ( 巯基丁基) 三甘醇的合成及其对蛋白 非特异性吸附的研究；3 ) 聚球藻悬浮细胞快速叶绿素荧光诱导检测除草剂；4 ) 基 于金纳米信号放大的聚球藻细胞生物传感器对除草剂的检测。 具体研究内容如下： 1 ) 将三肽( c h h ) 通过自组装技术修饰到金电极表面，然后与金属铜离子配 位，形成配合物，即c u c h h a u 超氧歧化酶拟酶生物传感器。将这些修饰电极进 行电化学、接触角、x p s 等表征，并测定该自组装体系修饰电极对超氧阴离予的歧 化能力。在超氧阴离子浓度9 3 6 和6 5g m 之间时，c u c h h a u 在3 5 0 m v 和 1 5 0 m v 条件下灵敏度分别为1 0 4 2 x 1 0 4a m 。1 和2 3 6x 1 0 4a m 一。 2 ) 以二缩三乙二醇和l ，4 一二溴丁烷为原料，合成了具有自组装功能的目标 化合物4 ( 巯基丁基) 三甘醇。目标化合物的分子结构用1 hn m r 、g c m s 和i r 等进行了确认。将目标化合物组装到电极表面，通过电化学表征和表而等离子共振 ( s p r ) 来研究化合物的自组装膜对牛血清白蛋白( b s a ) 的非特异性吸附。 3 ) 培养聚球藻细胞并获得均匀的悬浮细胞体系，通过快速叶绿素荧光分析测定 了聚球藻悬浮细胞在阿特拉津抑制作用下的光合作用情况。在阿特拉津作用浓度为 1 0 m o l l 、1 0 。6 m o l l 时，细胞光系统i i 中q a 后的电子传递基本被完全抑制，当作 用浓度减至1 0 。7 m o l l 时其对应的抑制作用下降，出现不完全抑制现象，而浓度减 为1 0 。1 u m o l l 时，基本未被抑制。 4 ) 将壳聚糖和金纳米混合均匀，作为固定介质将聚球藻细胞包埋固定金电极上， 借助电化学方法研究阿特拉津对叶绿素光合作用系统i i ( p si i ) 电子传递影响情况， 金纳米能够使电化学信号提高近两倍。结果表明光电流抑制一半时阿特拉津作用浓 度约为5 x 1 0 一m o l l ，且在阿特拉津浓度范围为l x l 0 击到l x l 0 。8m o l l 时，电流大 小与相应的阿特拉津浓度对数值呈现良好的线性关系。 关键词：生物传感器；拟酶；细胞生物传感器；除草剂；非特异性吸附 硕士学位论文 m a s t e r st t t e s i s a b s t r a c t i nt h i s t h e s i s ，t h es t u d ym a i n l yc o v e r sf o u ra s p e c t s ：1 ) ，n l ec y s h i s h i s s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e rc o o r d i n a t e dw i t h c o p p e ri o n sa st h es u p e r o x i d ed i s m u t a s e m i m i cf o rt h ee l e c t r o c h e m i c a ls u p e r o x i d e d e t e r m i a n t i o n 2 ) s y n t h e s i sa n ds u r f a c e a s s e m b l yo f4 - ( m e r c a p t o b u t y l ) t r i e t h y l e n eg l y c o la n di t sp r o p e r t yf o rt h en o n s p e c i f i c p r o t e i na d s o r p t i o n 3 ) t h ea m p l i t u d em o d u l a t e dc h l o r o p h y l lf l u o r o m e t e r yo fa l g a s u s p e n s i o nc e l l su s e df o rt h ed e t e c t i o no fh e r b i c i d e 4 ) c e l l b a s e db i o s e n s o ru s i n gg o l d n a n o p a r t i c l e sa st h es i g n a le n h a n c i n ga g e n tf o rt h ed e t e c t i o no fp s i i i n h i b i t i n g h e r b i c i d e s 1 ) as u p e r o x i d ed i m u t a s em i m i cb i o s e n s o rw a sf o r m e db yu s i n ga c y s h i s h i s t r i p e p t i d ea sl i g a n d st oi m m o b i l i z ec o p p e ri o n t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro ft h e c u c h h _ m o d i f i e dw a ss t u d i e di np h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o nb yc y c l i cv o l t a m m e t e r y ， g o n i o m e t r y , a n dt h ea s s e m b l e dm o n o l a y e rc o n s t i t u e n t sw e r ed e m o n s t r a t e db yx r a y p h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p ya sw e l la se l e c t r o c h e m i e a lm e t h o d s t h es t e a d y s t a t ec u r r e n t r e s p o n s e sa t3 5 0a n d 一1 5 0 m vw e r ep r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f0 2 一g e n e r a t i o n i nt h er a n g eo f 9 3 6t o6 5p m n l es e n s i t i v i t yo fc u c h h a uw a sf o u n dt ob e 1 0 4 2 x 1 0 qa m 1a n d2 3 6x l o qa m a t3 5 0a n d 1 5 0m v r e s p e c t i v e l y 2 ) ac o m p o u n d4 - ( m e r c a p t o b u t y l ) t r i e t h y l e n eg l y c o lw a ss y n t h e s i z e ds t a r t i n gw i t h t h et r i e t h y l e n eg l y c o la n d1 , 4 一d i b r o m o b u t a n e n em o l e c u l a rs t r u c t u r eo ft h et a r g e t c o m p o u n dw a sc o n f i r m e db y l hn m r 、g c m s 、i re t c t h e nt h ec o m p o u n dw a su s e df o r t h ef o r m a t i o no fas e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r ( s a m ) o ng o l de l e c t r o d e ，a n d c h a r a c t e r i s t i c so ft h es e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e rw e r ei n v e s t i g a t e db yt h ee l e c t r o c h e m i c a l c y c l i cv o l t a m m e t r ya n de l e c t r o c h e m i c a li m p e n d e n c es p e c t r a a sar e s u l t , t h es e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e rs h o w e das t r o n ga n t i n o n s p e c i f i ca d s o r p t i o nt ot h ep r o t e i nb s a ，a s d e m o n s t r a t e db yt h es u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c et e c h n o l o g y 3 ) a l g ac e l l ( p c c7 9 4 2 ) s u s p e n s i o nw a sc u l t u r e di nb a t c hc u l t u r e si n2 5 0m l c o n i c a lf l a s k s u s i n gt h eb g1 lm e d i u m t h ea m p l i t u d em o d u l a t e dc h l o r o p h y l l f l u o r o m e t e r yo ft h ea l g ac e l ls u s p e n s i o nw a su s e df o rt h ed e t e c t i o no fh e r b i c i d e t h u s ，a d1 p r o t e i ni n h i b i t i v eh e r b i c i d e ，a t r a z i n e ，w a se m p l o y e df o ri n h i b i t i o no ft h e p h o t o s y n t h e t i cc u r r e n t ，a n dt h er e s u l t e df l u o r e s c e n c ec h a n g eo fc h l o r o p h y l l si nt h ea l g a e e l l s u s p e n s i o nw a su s e df o rt h ed e t e c t i o no ft h eh e r b i c i d ea t r a z i n e w h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fa t r a z i n ew a s10 m o l lo rlo 6 m o l l ，t h ee l e c t r o n t r a n s f e ro f p h o t o s y s t e mi iw a sc o m p l e t e l yi n h i b i t e d ，b u ti n c o m p l e t ei n h i b i t i o nw a so b s e r v e da tt h e 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s c o n c e n t r a t i o no f10 m o l l w h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a sr e d u c e dt o10 1 0 m o l l ，a l m o s t n oi n h i b i t i o nw a so b s e r v e d 4 ) t h es o l u t i o no fg o l dn a n o p a r t i c a l sa n dc h i t o s a nw a su s e df o rt h ee n c a p t u r eo f p l a n tc e l l sf r o ma l g a , a n df o r m e dak i n do fc e l l b a s e db i o s e n s o rb yc a s t i n go na n e l e c t r o d es u r f a c e s i n c et h ei n t r o d u c t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e si nt h ec o m p o s i t e m e m b r a n e ，t h es i g n a lo fa m p e r o m e t r i cc u r r e n tr e s p o n s ea t2 5 0 m vw a se n h a n c e da b o m t w o f o l d ，c o m p a r e d 嘶t ht h es i g n a lw i t h o u tg o l dn a n o p a r t i c l e su n d e rt h es a m ec o n d i t i o n i tw a sf o u n d5 0 i n h i b i t i o no ft h ep h o t o c u r r e n ta tt h ec o n c e n t r a t i o no f5xl0 。s m o l lf o r a t r a z i n e t h eb i o s e n s o re x h i b i t e da na m p e r o m e t r i cc u r r e n tr e s p o n s ew i t l lag o o dl i n e a r c o r r e l a t i o nt ot h el o g a r i t h m i cv a l u eo ft h ec o n c e n t r a t i o no fa t r a z i n er a n g i n gf r o mlxl0 由 t o1 x 1 0 罐m o i l k e yw o r d s ：b i o s e n s o r ；s o dm i m i c ；c e l lb i o s e n s o r ；h e r b i c i d ed e t e r m i n a t i o n ； n o n s p e c i f i ca d s o r p t i o n 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：匀禾甚 日期：2 口7 年月厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：j ；冬泛 导师签名：膨 日期：7 年6 月歹日日期：口矸年6 月，日 f 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程 中的 规定享受相关权益。回童途塞握交卮溢卮；旦坐生；旦二生；旦三生筮盔! 作者签名：j | ￥洼 日期：。呷年6 月歹日 孙糨微粒 呐一7 年6 月 硝士幸位论文 第一章绪论 1 1 引言 传感器，概括地说，就是种信息获取与处理的装置。如果把人体的感觉器官 看作一套完美的传感体系，通过异、舌可感知气味和味道这样的化学刺激，通过耳、 眼、皮肤可感知外界的声、光、温度、雎力等物理信息。而化学传感器是对物质成 分传感的器件，具有微型化、专性和可逆性，能够对某种化学成分进行麻箨反成， 并且能够产牛与浚成分浓度成比例的町剃4 信号。而在这一类传感器中比较特殊的化 学传感器就是生物传感器，它是以同定化的生物成分( 酶、抗体、抗原等) 或生物体 本身( 细胞等) 为敏感材料，对被目测物具有高度选择性的检测器。在生物体内，许 多分了是以高度有序的方式组合的，这样高度有序排列的好处可以使其具有一定韵 生物功能。利，牛物传感器对其研究，可| 三l 认识牛物的分子0 j l j 及分子相互作用， 理解生物分子的功能及生命现象的本质。凼此，卜物传感器是生物技术研究_ - 的一 个匝要领域。 j 遂这些 奄感器之问的关系叮以用图l 一1 柬表示”j 。 削i - 1 人体感觉器官与化学，生物传罅器 1 2 生物传感嚣概述 生物传感瓣是传感器研究中的个重要身【成部分，f 司忖j 也是生物休巾电化学研 瑟塑目 暖壶 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 究的一个热点，因此生物传感器的研究无论理论上还是实际应用上具有十分重要的 意义。早在1 9 8 7 年，j a r v i s 已经指出生物传感器的重要性，并认为其在医学、临床、 生物、化学、农业、环境及工业等诸多领域将得到广泛的应用【2 j 。随着现代科学技 术的发展，生物传感器在临床医学3 4 1 、分析和发酵5 川、军事医学8 l 及环境监n t 9 加1 等得到了广泛的应用。 在临床医学方面，由于生物传感器是作为临床诊断使用，这就要求其不仪是一 种快速简便的诊断方法，而且要具有专一、灵敏、响应快等特点。如北京怡成生物 电子技术有限公司生成的酶电极式“s e nt e s t 快速血糖测试仪”，用来检测糖尿 病，这种诊断方法大大简化复杂的医学生化检测过程。 在食品分析和发酵工业方面，生物传感器不仅可以应用于食品成分、食品添加 剂、有害物质及食品鲜度等的测定分析，还可以用于对食品的质量监控、食品的品 质评价、食品生产过程的质量监控以及食品科学研究。如日本农林水产省研制出一 种滋味传感器，可以用来肉汤生产过程的质量监控1 5 j 。 在军事医学方面的应用，由于这种生物传感器具有高度特异性、灵敏性和能快 速地探测化学战剂和生物战剂( 包括病毒和细菌等) 的特性，使其将成为野外现场 分析需要的首选，成为生化战剂侦检的重要器材，而且减少了对使用者的要求和环 境的依赖，为军事医学领域广泛的应用提供可能性。 在环境监测方面，目前环境污染问题在社会发展同趋突出，人们迫切希望拥有 一种能对污染物进行在线监测的仪器，因此生物传感器在这一方面的研究也显得意 义非凡。目前已经有部分生物传感器应用于环境监测，如生物需氧量的检测、重金 属的检测、除草剂的检测、有机磷及氨基甲酸酯类抗乙酰胆碱酯酶农药的检测等等 方面的应用。 总之，生物传感器是一个由多种生物、化学、医学、物理、电子技术等学科互 相渗透成长起来的高新技术，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能 在复杂体系在线连续监测的特点。虽然已有部分生物传感器商品化，如葡萄糖、脲 酶和乳酸等，但由于它们是以生物活性的物质为敏感材料，其活性往往受到环境条 件及微生物等因素的影响而降低，而且这种凶素有时会使其寿命大大缩短。因此， 目前生物传感器的研究更倾向于保持生物物质的活性或具有相同的功能仿生材料 方向发展。 1 3 酶和拟酶生物传感器 酶在生命活动中起着极为重要的作用。新陈代谢是生命活动的基础，而新陈代 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 谢所有生化反应都是在酶催化条件下进行的。因此，以酶作为分子识别元件的生物 传感器的研究，无论在理论上还是在实际应用上都是有重要的意义。 1 9 6 2 年c l a r k 等人报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖的结果，可认 为是最早提出了酶生物传感器的原理i l l l o1 9 6 7 年u p d i k e 等人实现了酶的固定化技 术，成功研制酶电极，这被认为是世界上第一个生物传感器【1 2 1 。此后，电极的研究 相当活跃。而生物传感器技术的真正成功，还是2 0 世纪7 0 年代中后期，d i v i e s 等人 提出的所谓“微生物电极 ，用固定化细胞与氧电极配合对醇类进行检测。生物传 感器技术逐渐形成了自己独立的体系，并得到了迅速的发展。 纵观酶生物传感器发展的历史可知，酶生物传感器的发展史其实就是酶的固定 基质和固定技术不断改进和完善的历史，其制备基础是将固定化的生物敏感膜如 酶、抗体或细胞等耦合在传感元件上 1 3 , 1 4 】。近几十年来，国内外学者对酶的固定化 技术进行了大量研究。酶生物传感器是生物传感器研究中的一个重要方向。 尽管天然酶是一种很好的生物催化剂，具有许多普通的化学反应所不具备的优 势，如反应条件比较温和、效率性高、专一性强、反应速率快i l5 。但是其也有其自 身不足之处，如来源有限，寿命不长，敏感易变，提纯刚难等，这些都限制天然酶 在实际中应用。于是，人们就开始设想合成具有天然酶活性的小分子模拟化合物， 替代天然酶。这样其产量就不会受到限制，且物质和能量消耗低。其次，还可以解 决天然酶在血液中存在着半衰期短( 如天然超氧歧化酶在人体中只稳定时问很短， 其半衰期只有分钟级) 、价格昂贵等缺点f l6 1 。所以，近年来人们把目光转向了天然 酶的模拟物，尤其是小分子模拟物上。通过化学方法设计和合成一些较天然酶简单 得多的非蛋白质分子，并以这些分子作为酶模型物来模拟酶其对底物作用情况【1 7 】。 研究表明，通过合理设计合成化合物，使其具有天然酶活性中心相似的结构， 并用它们来模拟天然酶的功能，从中筛选出具有天然酶相似的结构和功能的化合 物，并可以模拟酶体系应用实际生产。另外，天然酶是生物大分子，结构复杂，借 助此方法可能会得到直接从天然酶研究中不可能得到的信息，也是对天然酶研究的 一种补充，还可能获得具有特殊结构和性能的化合物i l 引。而利用生物传感器来研究 天然酶拟酶，并能使这种拟酶传感器用于实际，更具有应用价值。这也是近几年来 研究酶生物传感器的一个热点。 1 4 细胞生物传感器 1 4 1 细胞生物传感器研究的重要性 细胞同酶一样，在生命活动中起着极为重要的作用，而且细胞是有机结构体 硕士学位论文 m a s t e r st i i e s i s 与生命活动的基本单位，体内所有的生化反应和生理功能，都是在细胞及其产物( 如 细胞间隙中的胶原蛋白和蛋白聚糖) 的物质基础上进行的。随着细胞培养技术的成 熟和半导体微细加工技术的发展，以活细胞作为敏感元件的细胞生物传感器，已成 为生物传感器研究领域的一大热点。因为对于很多可以引起细胞电化学状态变化的 物质，这种细胞生物传感器都具有高度敏感性，且半导体器件的惰性可以提供一种 稳定可靠、无损持久的监测，可以用来检测到许多未知的物质，获得其它方法所不 能获得的宝贵信息。而基于酶、抗原或抗体、核酸、受体等分子的生物传感器只对 靶分子有响应具有高度选择性和敏感性，可能会检测不到某些具有相同功能的相关 分子【2 0 1 。目前已经有人将这种细胞生物传感器用于生化武器，地下水污染等环境监 测，药物筛选，新药开发和基础神经学等研究。 另外，细胞生物传感器的重要性还在于它能够通过确定某类物质存在与否及浓 度大小来定性定量测量和分析未知物质的信息，能够通过监测被分析物对活细胞生 理功能的影响来解决一些与功能性信息相关的问题。如底物相对于给定的受体是否 是激动剂或抑制剂，这也是现代药物筛选和开发的核心问题；生理系统如何受复合 药物中各成分的影响；底物是否以其它方式来影响细胞的新陈代谢，如第二信使或 酶；待测物足否对细胞有毒副作用以及环境足否受到污染等等。 总之，利用细胞生物传感器可以连续j l f 测和分析细胞在外界刺激下的生理性能 变化。从底物的角度来看，能够对底物的功能信息进行研究和评价。从生物学角度 来看，能够探索细胞的状态、功能以及基本生命活动。因此，以活细胞作为敏感材 料生物传感器在环境l 吠l n 涧t y ：9 、生物医学、药物丌发等领域具有十分广阔的应用前景。 1 4 2 细胞生物传感器发展的现状i l 州 目前，国内外很多研究小组都在从事有关细胞生物传感器方面的研究。下面主 要以细胞获得的信息对细胞传感器进行分类，并结合芯片技术在生物领域的运用， 简述各类细胞传感器的研究方法及发展状况。 1 ) 监测细胞电生理行为的细胞生物传感器 一些可兴奋细胞( 如神经细胞和内分泌细胞等) 的电生理信号与细胞功能性信 息是相关的，在光、电及药物等外界条件刺激下均能产生动作电位响应。一般地可 采用膜片钳技术! 直接测量细胞膜电位，但此法存在弊端，无法同时测量不同位置的 动作电位，而且细胞内记录和电压敏感染料对细胞足有损的，这就限制了它在实际 中的应用。而平面微电极阵列由于能无损、同步地记录多个可兴奋细胞或组织的动 作电位的传播1 2 1 。2 2 j 被人们广泛关注。研究表明，大量的神经细胞胞外记录信号在药 物筛选中有着及其重要的作用。如m o r e f i e d 等人利用老鼠胚胎的耳皮质神经元培养 4 硕士学位论文 m a s t e r st t t e s i s 对药物a n ( 一种抑制兴奋剂的药物) 进行评价2 3 1 。k r a u s e 等人【2 4 1 采用将电极直接 和栅极场效应管连在一起，研发了一种基于8 x 8 扩展门电极阵列的细胞传感器，可 以长期记录胞外信号。 2 ) 监测细胞内外环境的细胞生物传感器 采用离子敏感微电极能够实时监测活细胞内外环境的变化，通过测定细胞内自 由离子浓度可以了解细胞生理性能及其机制。而监测有关细胞的离子浓度、蛋白表 达的信号变化的最有效方法是荧光成像，利用荧光探针和共聚焦显微技术结合，可 以使细胞结构和功能的分析可达到前所未有的精确性和清晰度，而且还能更好地监 测细胞内各种离子浓度( 如游离c a 2 + 和细胞内旷等) 。如美国分子器件公司开发出 一种细胞微生理计( m i c r o p h y s i o m e t e r ) ，以硅技术为基础的传感器可以检测细胞酸 化的微环境【2 5 】。另外，它还可以对化疗药物对肿瘤细胞的作用效果进行评价【2 6 】， 并可实现药物的高通量筛选【2 7 1 。h a f n e r 等人【2 8 1 还对该仪器做了进一步研究了，将其 应用在g 蛋白耦合受体、内源性触发受体和配体门控离子通道等亚细胞结构的分析 中。 3 ) 监测细胞特殊行为的细胞生物传感器 某些特殊行为的细胞生物传感器，通过测量某这些细胞的某种特殊性质，进而 研究这些生物体对外界刺激的响应。如基于植物细胞的生物传感器可以用来检测p s i i 抑制型除草剂，基于某些发光特性的细菌生物传感器，可能对某些重金属产生敏 感，从而实现对环境的监测i 2 邺。基于细胞色素的细胞生物传感器，通过诱发色素 细胞与酶相关的运动1 3 引，改变细胞的颜色，以检测颜色变化为标准来测量神经毒素。 总之，细胞生物传感器已经成为目前生物传感器研究中一大热点。细胞拥有一 系列潜在的可以作为靶标分析物如酶、受体、离子通道等分子识别元件，当它们受 到外界刺激时，活细胞就会按照固有的生理机制进行相应的生理功能活动。所以， 以活细胞作为敏感材料的生物传感器可以对许多具有生物活性的物质响应，进而可 以对这些物质进行筛选或评价。此外，更为重要的是细胞生物传感器还能够进行功 能性分析，从而更深入了解细胞的生理活动。细胞生物传感器已经成为生命科学以 及环境科学领域中不可或缺的工具。 1 - 5 植物细胞传感器在除草剂方面的应用 近年来，除草剂的使用量已超过杀虫剂和杀菌剂【3 3 1 。但多数除草剂对生物体有 着较大的潜在影响，能抑制植物包括藻类的光合作用和生长，对动物的神经机能及 细胞分裂有毒害作用，甚至会引起染色体突变【3 4 1 。除草剂在环境中残留量的增加带 5 硕士学位论文 m a s t e r st t t e s i s 来了越来越大的危害。为评估环境和农产品中除草剂的残留，建立灵敏、高选择性 和快速的现场分析方法尤为必要。除草剂的测定方法通常为色谱法 3 5 - 3 6 l ，但该法对 设备要求较高，不适合于现场监测。因此，利用生物传感技术对除草剂进行在线及 连续检测越来越受到重视【3 7 1 。常用的方法有酶联免疫生物传感器法( e l i s a ) 1 3 8 - 4 0 ， 该法灵敏度高，选择性好，但通常只用来测定单个种类的除草剂，且试剂昂贵，操 作繁琐。由于绝大多数除草剂可以影响绿色植物的光合作用，因此利用叶绿体制备 传感器检测除草剂受到人们的关注【4 1 书】。 植物细胞是细胞中一个种类，是植物体结构与生命活动的基本单位，而植物体 的光合作用主要发生在植物体的细胞中。通过细胞来快速、连续、高效地筛选除草 剂或检测除草剂残留己成为近年来研究的热点。 在筛选除草剂方面，通过培养离体异养植物悬浮细胞，不仅可以改变季节和气 候的限制，以及所需的空间限制，还可以减少待测物的用量( 仅以m g 计) 。另外， 细胞与其植物具有相同的基因型和代谢活性，在不需要表面活性剂及其它的辅助性 成分的条件下，能够解决那些在整株植物试验中穿透力差和运输困难的物质，并且 短期内能够检测大量化合物，更为重要的是这种离体悬浮细胞还能检测到潜在具有 生物活性的化合物。如b a s f 公司采用油菜( b r a s s i c an a p u sl ) 和小麦( t r i t i c u m m o n o c o c u ml ) 、( z e ym a y sl ) 的自由细胞进行异养悬浮培养【4 5 1 ，筛选筛选药物。 在除草剂残留检测方面，绝大多数除草剂都足光和系统i i 电予传递抑制型除草 剂，而细胞的光合作用、呼吸作用、物质的跨膜运输等又与生命细胞荷电粒子或电 活性粒子定向有序的传递、传导或转移有关，与细胞物质有序、专一、特异的氧化 和还原有关。细胞的这些生化反应都是以电化学反应为基础的，电化学是研究和探 讨生命现象和本质最合适最有力的手段之一m l 。因此，可以通过细胞电化学方法来 检测这种类型的除草剂残留。 通过将植物细胞固定到电极上，利用除草剂对植物光合作用电子传递的阻碍， 可以检测除草剂的残留，同时也可以作为新药物筛选的一种途径。因此，植物细胞 生物传感器已经被人们特别关注。 1 6 选题意义及论文设计 目前，生物传感器随着生物科学、信息科学和材料科学的发展而飞速发展，其 研究方向更倾向于实际应用，这也要求其更具有小型化、低成本、选择性好、灵敏 度高、寿命长、快速的响应时间和与环境的相容性等。可以预见，生物传感器将在 众多领域具有广阔的应用前景。 6 硕士学位论文 m a s t e r st i i e s i s 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) 简称s o d ，广泛地存在于生物体内， 它在保护细胞不受活性氧氧化损害方面起着十分重要的作用。以天然s o d 为敏感 材料的生物传感器可以用来进行实时、原位地检测超氧阴离子【2 4 】。由于天然s o d 同大多数酶一样具有自身的缺陷，使得超氧化物歧化酶拟酶( 简称s o d m ) 的研究 更有实际意义。据文献报道某些含咪唑基的多肽是生命体中重要的配体，它们常常 与许多过渡金属c u ( i i ) 、f e ( i i ) 等一起，共同在酶催化和生物酶物质运送等众多生 物过程中起关键作用d 7 q 8 】。所以对于天然s o d 的模拟，咪唑基起到重要的作用。 在检测超氧阴离子的过程当中，由于黄嘌呤黄嘌呤氧化酶作为产生0 2 的体系反应 稳定，便于检测而被广泛采用。因此，合理设计s o d m ，并将其组装到电极上面， 形成检测超氧阴离子的s o d m 生物传感器，这为研究s o d 催化歧化超氧阴离子提 供了一个较好的研究方法。由于s o d m 是化合物模拟生物分子，所以其具有分子模 型结构简单、易于研究其与底物的界面分子识别及电子转移机制、形成的s o d m 生 物传感器稳定性高、寿命长、制作重复性好等优点。 细胞传感器是生物传感器研究中的另一个热点，以活细胞作为传感器的敏感元 件，对于很多可以引起细胞电化学状态变化的物质，可以检测到许多未知的物质。 目前已经有人将这种细胞生物传感器用于生化武器，地下水污染等环境监测，药物 筛选，新药开发和基础神经学等研究。植物细胞足细胞中的一个种类，可以应用于 除草剂等药物方面。 因此，本论文的乇要研究内容是通过自组装的方法将超氧化物歧化酶模型化合 物固定在金电极表面，研究其对超氧阴离子的歧化能力，表明界面拟酶分子组装体 系对超氧阴离子自由基具有歧化能力，为制作超氧化物歧化酶模型化合物生物传感 器打下基础。另外，利用壳聚糖通过包埋方式将聚球藻细胞固定到金电极表面，用 电化学方法表征，研究光合作用抑制剂阿特拉津对聚球藻细胞电子链抑制情况，为 检测除草剂或筛选新除草剂提供町能。 具体的研究内容如下： 1 ) 将三肽( c h h ) 通过自组装技术修饰到金电极表面，然后与金属铜离子配 位，形成配合物，即c u c h h a u 超氧歧化酶拟酶生物传感器。将这些修饰电极进 行电化学表征，并测定该自组装体系修饰电极对超氧阴离子的歧化能力。 2 ) 以二缩三乙二醇和l ，4 一二溴丁烷为原料，合成日标化合物4 ( 巯基丁基) 三甘醇。然后将其组装到电极表面，通过电化学表征和表面等离子共振( s p r ) 来 研究此化合物对牛血清白蛋白( b s a ) 的非特异性吸附。 3 ) 培养聚球藻细胞并获得均匀的悬浮细胞体系，以除草剂阿特拉津作用于聚球 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 藻悬浮细胞，通过快速叶绿素荧光分析测定聚球藻悬浮细胞在阿特拉津抑制作用下 的光合作用情况。 4 ) 将壳聚糖和聚球藻细胞混合均匀，利用壳聚糖空腔将细胞包埋固定金电极上， 借助电化学方法研究阿特拉津对叶绿素光合作用系统i i ( p si i ) 电子传递影响情况， 对此类型除草剂作用机理可进一步的研究。 8 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 第二章超氧歧化酶拟酶c h h u 的白组装及其作为生物传感器 对超氧阴离子的检测 2 1 引言 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) ，概括地说，生物体内一类含氧化合物 的总称。一般情况下，生物体内有一套完整的抗氧化体系，可以维持自由基的代谢 平衡，细胞内r o s 的水平被控制在很低的范围h 引。而超氧阴离子是活性氧的主要种 类，它与人体内0 2 - 与衰老、癌症、帕金森症、糖尿病、关节炎等病症有关 5 0 - 5 1 1 。 在正常的生理条件下，0 2 能够通过自身歧化和酶促分解反应保持在较低在生理浓 度，这种情况对有机体是有益的。但是，当这种动态平衡被打破，尤其是0 2 。在体 内没有及时清除时，过多的0 2 。就会引起细胞损伤，诱发各种病变。实际上，0 2 本 身并不是那么活泼，当有f e 2 + ，c u 2 + 等金属离子存在时，它很容易通过f e n t o n 反应转 化成羟自由基( h o ) ，而h o + 是对细胞毒害最强的自由基【5 2 。 超氧化物歧化酶，简称s o d ，是动、植物及微生物体内普遍存在的、重要的抗 活性氧毒害的金属酶。s o d 具有催化作用，能够把超氧阴离子自由基( 0 2 - ) 歧化 成h 2 0 2 和0 2 ，可以防止体内0 2 一的积累，因此很早就被人们所重视。1 9 6 9 年，s o d 成为第一个被定义为抗氧自由基的物质1 5 3 1 ，根据它所配位的金属离子的不同，主要 可分为c u z n s o d 、f e s o d 和m n s o d 三类。此外，在牛肝中还存在一种 c o z n s o d ，以及最近在链球菌中还发现了n i s o d t 5 4 】。研究结果表明，以上这几 种s o d 在生物体内具有相同的生理作用机制，都可以催化超氧阴离子自由基( 0 2 - ) 发生歧化反应，进而有效地清除细胞中超氧阴离子自由基而使其免受0 2 。的氧化损 伤。 然而，尽管天然酶具有很多优势，但其也有不足之处，如天然酶来源有限，敏 感易变，寿命不长，提取困难，且不宜在有机溶剂中使用。所以，人们把目光转向 了天然酶的模拟物，通过合理设计化合物，使其具有天然酶活性中心相似的结构和 功能。半胱氨酸中的巯基可以连成双硫键，双硫键在蛋白质的三维结构中起着重要 的作用【55 。组氨酸又是生物体必需的基本氨基酸之一，并广泛存在于肌肉、神经组 织中，许多酶和功能蛋白质的活性中心存在组氨酸残基。而组氨酸的咪唑基单元是 自然界中金属酶中与金属离子最常见的键合位置之一。文献中已有报道，根据天然 s o d 的活性部位设计的含氮、氧原子的配体与过渡金属离子配位，可以形成的超氧 化物歧化酶模型化合物( s o d m ) ，并对0 2 - 具有较好的歧化能力【5 6 。 9 硕士学位论文 m 人s t e r st h e s i s 本章主要通过含组氨酸的三肽半胱氨酰组氨酰组氨酸( c h h ) 自组装膜与c u 2 + 的配位作用形成超氧歧化酶拟酶，并研究其对超氧阴离子的歧化作用，以此制作生 物传感器用电化学方法监测生物体中0 2 提供一种可能。 2 2 实验部分 2 2 1 实验仪器与试剂 仪器：p h s 一3 c 型精密p h 计( 上海精密科学仪器有限公司) ；接触角测量在 ( d a t a p h y s i c so c a 2 0 ) 测得；x p s 图谱在( e s c a l a bm ki i ) 室温下1 0 西p a 获得； 所有的电化学操作都在a u t o l a bp g s t a t 3 0 ( 荷兰) 电化学工作站上进行。实验均在 室温下进行，采用三电极系统：饱和a g a g c l 电极为参比电极，铂电极为对电极， 处理好的金电极为工作电极。 试剂：三肽c y s h i s h i s 为化学纯( 上海吉尔生化) ；磷酸缓冲溶液( p b s ， p h _ 7 0 ) ：其余试剂均为分析纯，氮气为高纯氮( 9 9 9 9 ) ；电化学实验用水为超纯 水( r 1 8 0m q c m ) ( 由台湾艾可公司制备的超纯水制备仪纯化制得) ；电化学实验 所用溶液实验前均进行高纯氮气除氧；对超氧阴离子歧化活性测定前均用高纯氧气 通氧1 5 分钟。 2 2 2 三肽( c m i ) 白组装膜修饰电极的制备及其与c u 2 + 的配位 将金电极在a 1 2 0 3 粉术( 依次1 0 t t m 、0 3 t t r n 、0 0 5 t t m ) 抛光五分钟左右，然后 将抛光后金电极用超纯水冲洗放入新制的p i r a n h a 溶液( 浓硫酸和双氧水体积比为 7 ：3 ) 中浸泡1 0 m i n ，再用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声清洗3 m i n ，氮气吹 干，然后放入0 5m o l l 的硫酸溶液中进行电化学处理。最后将清洗后的电极在0 1 m o l l 的硫酸溶液循环伏安扫描，记录到稳定后的图循环伏安( 见图2 1 ) ，电位窗 口为一0 2 1 5 v 。电极的真实面积可以根据下式由该循环伏安图上还原峰的峰面积 来求得 5 7 - 5 8 1 ： 4 = 笋 p 一4 、一一 4 其中矿= 3 9 0 1 t cc m 2 ，氏是电化学面积，r 是电化学表面粗糙度，a g 是几何面积 1 0 硕士学位论文 m a s t e r st t t e s i s e v 图2 1 裸电极在0 1 mh 2 s 0 4 溶液中的循环伏安图，扫速为1 0 0 m v s - 1 。 将电化学表征好的金电极用超纯水清洗，氮气吹干后放入浓度为l m m 的c h h 的乙醇溶液中浸泡2 4 h ，取出后用无水乙醇充分洗涤，除去非化学吸附成分，再用 超纯水冲洗，氮气吹干即得c h h a u 修饰电极。c h h 的结构式如图2 2 所示。 酬一罕一! ! 一 j 一罕一| ! 一j 一：；! 一c 。h e h 2 s h 图2 2 三肽c h h 的结构 将上述制得的c h h a u 修饰电极浸入l m m 的c u ( c 1 0 4 ) 2 溶液中浸泡3 0 m i n ，然 后取出用超纯水冲洗，氮气吹干，即形成c u 2 + c h h a u 修饰电极。 2 2 3c u 2 + c h h a u 修饰电极对超氧阴离子歧化作用的测定步骤 取活性单位0 6 u m g 黄嘌呤氧化酶1 6 m g 配制的水溶液5 0 m l ，配制