（作物遗传育种专业论文）芥菜几丁质酶基因bjchi1启动子功能的初步分析.pdf

芥菜几丁质酶基因b j c h l l 启动子功能的初步分析 摘要 芥菜( b r 础s 把盘肛配c e d ) 几丁质酶基因b j c 1 受伤害、茉莉酸、虫食、 真菌侵染等的诱导，因此b j c i 丑1 启动子是一个诱导型启动子。目前报道 的转基因作物中，驱动导入的外源基因表达大多数是强表达的组成型启动 子，使得这些基因几乎在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都高效表 达，这无疑增加了植株的代谢负担，造成物质和能源上的巨大浪费，因此， 研究和利用组织器官特异性启动子和诱导型启动子具有非常重要的应用价 值和理论意义。本研究的主要目的是将芥菜b j c l 启动子导入烟草，初步 鉴定该启动子的功能。 本研究通过衔接头p c r 技术，于芥菜b j c 1 启动子b j c p ( 1 0 9 8 b p ) 5 、 端成功延伸了2 8 0 b p 的片段，获得长度为1 3 7 8 b p 的芥菜b j c h l l 全长启动 子b j c - p 1 ，将其序列与g e n b a n k 中已知序列进行对比，发现在g e n b a l l k 中 目前还没有该启动子的注册信息。 为了验证其功能，用芥菜b j c 1 启动子片段b j c - p 0 ( 1 2 8 7 b p ) 取代p b l l 2 1 上的3 5 s 启动子，构建成植物表达载体p b i c h p o 。用农杆菌介导法将携带芥 菜b j c l 启动子片段的植物表达载体p b i c h p o 、p b i c h p 2 和p b i c h p 5 以 烟草k 3 2 6 无菌苗叶片为转化受体进行漫染转化。总共获得1 0 3 株p c r 阳性 烟草植株，其中2 9 株p b i c h p o 、2 1 株p b i c h p 2 和0 株p b i c h _ p 5 为g u s 阳性 植株。 对转基因烟草( 苗期4 叶期) 的g u s 活性分析表明：( 1 ) b jc p 0 和 b j c p 2 驱动的g u s 基因在伤害处理前几乎没有活胜，但伤害处理3 h 之后， b j c p o 的g u s 活。性是处理前的2 9 8 5 倍，b j c - p 2 的g u s 活性是处理前的 2 7 1 倍；诱导处理后g u s 活性强度为b j c - p 0 大于b j c p 2 ；( 2 ) b j c p 5 在伤害处理前后几乎没有活。陛，且变化不大，以上结果与g u s 组织化学染 色结果相符；( 3 ) 当转基因烟草生长至大于苗期4 叶期时，伤害诱导前后 b j c p o 、b j c - p 2 的g u s 基因活性变化不大，表达强度为b j c - p o 大干 b j c _ p 2 ，而b j c - p 5 没有g u s 活性。 以上的结果证明，芥菜b j c 1 启动子在正常情况下本底表达量低，但 受伤害的强劲诱导，是一个受伤害诱导的诱导型启动子，诱导强度和活性 随着启动子5 端的不断缺失而不断下降，5 、端缺失至。3 1 6 b p 时没有g u s 活 性，该启动子调控基因的表达受到植物生长发育的调控。 关键词：芥菜b j c m l 几丁质酶诱导衔接头p c r 农杆菌介导启动 子功能鉴定 p r e limin a r yf u n c t10 n a la n a l y siso ft h e 删s s ，l 刎j 艺仉6 岛e c h i t i n a s eg e n eb j c h l lp r o m o t o e r a b s t r a c t t h e 占，j f ，“胛日c h i t i n a s eg e n eb j c 1i s i n d u c e db yw o u n d i n g ， t r e a t m e n tw i t hj a s m o n a t e ( j a ) ，i n s e c tf e e d i n go rb yf u n g a li n f e c t i o n ；i n d i c a t i n g t 1 1 e p r o m o t c r o fb j c 1i sa ni n d u c 洳j e p r o m o t e c u r r e n t i y ，c o n s t i t u t i v e p r o m o t e r sw e r eu s e di na l m o s ta 1 1r e p o r t e d 订a n s g e n i cp l a n t s h o w e v e r d u et o m e i rc o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o np a t t e m ，e x o g e n o u sg e n e sc a ne x p r e s si na 1 1 t i s s u e s o fp l a l l t sa ta 1 1 yd e v e l 叩m e ms t a g e ，w 协c hw o u l dl e a dt og r e a t l yw a s t eo f b o m m a t e r i a l sa 1 1 de n e 唱ya n di n c r e a s en e g d l i v ei n n u e n c e so nm e t a b o l i s mo fh o s t p l a l l t s t h g r e r o r e ，i ti sv e r yi m p o n a n tt oa 1 1 a l y s i st i s s u e - s p e c i f i cp r o m o t e r s 肌d i n d u c i b l ep r o m o t e r s i nm i ss t u d y ，ap r e d i c t e di n d u c i b l ep r o m o t c rf r o m 口r 4 s 5 f c 盘 ，“订c p 口w a s 打a n s f e r r e di m ot o b a c c o ，a n di t sf u n c t i o nw a sa n a i y s i s e d af a g e m e n t ( 2 8 0 b p ) w a sf o r w a r d e d 矗o m5 1b j c h i lp m m o t e rb j c p b y a d 印t o r _ p c r ，a n do b t a m e dt | 1 ep r o m o t 钉行a g e m e n tb j c p 1 ( 1 3 7 8 b p ) t h i s p r o m o t e ri sn o tr e g i s t e r e di ng e “b a n k t h e p l a me x p r e s s i o nv e c t o r ( p b i c h p 0 ) h a r b o r i n gt h ef u s i o ng e n eb j c _ p 0 ： g u sw a sc o n s t m c t e d b y 爿酽叼6 口c 饱r m m 觑m 岜庙c 招玎j m e d i a t e d ，m r e ed e i e t i o n c o 力s 臼u c t sj n c l u d i n gp b i c 0 ，p b i c 2a n dp b i c h p 5w e r et i a n s f e n e dj n t o t o b a c c ok 3 2 6 1 0 3p o s i t i v et r a n s g e n i ct o b a c c o sw e r eo b t a i n e d ，5 0p l a m sw e r e d e t e c t e db yg u sg e n e ( 2 9w i t hp b i c h p o ，21w i t hp b i c 2a n d0w i t h p b i c 5 ) w h e nt h et r a n s g e n i ct o b a c c o sw i t h4l e a v e s ，t h e r ew a sh a r d l ya n yg u s a c t i v i t yb e i n gt e s t e di np b i c h p oa n dp b i c h p 2t r a n s g e n i ct o b a c c o su n d e rn o w o 衄d i n gt r e a t n l e n t ； g u s a c i t i v i t y 啪s m a g n i f i e d 2 9 8 5t i m e sa f k r w o 哪d i n g i n d u c e d3 hf 研p b i c h p 0a n d2 7 1 t i m e sf o rp b i c h p 2 ；p b i c h p 5 c o u l dn o td r i v eg u sg e n ee x p r e s s i o nb e f o r ea n da f t e rw o u n d i n gt r e a t m e n t w 1 1 e nt l l e t r a n s g e n i c t o b a c c o sw i t hm o r e 山a n4l e a v e s ，t h e r ew a sl i 仕l e d i 鼢r e n c ei ng u s g e n ee x p r e s s i o nb e f o r ea n da 舭rw o u n d i n g 一 m d u c e d3 h f o r “l t h ep r o m o t e r 丘a g e m e n t s t h er e s u l t so fg u s a c t i v i t yd e t e c t i n gi 1 1 u s t r a t e dt 1 1 a tt 1 1 ep t o m o t e ro fb j c h l l c o n i dn o te x p r e s su n d e rn o m a lc o n d i t i o n s ，b u th a so b v i o u sw o u n d i n gi n d u c i b l e c h a r a c t er ，t h e r e f o r e ，m ep r o m o t e ro fb j c li sa j li n d u c i b l ep r o m o t e r ，i t s i n d u c t i v ei m e n s i o na i l dm e i ra c t i v “i e sd e c r e a s e da l o n gw i t ht 1 1 e g r a d u a l d e l e n t i o no fb j c f i1 p i o m o t e r ，a 丹a g e m e n t ( 一3 l6 b p ) c o u l dn o td r i v eg u s g e n e e x p r e s s i o n i na d d i t i o n ，b j c 1p r o m o t e rw a sr e g u l a t e db yp l a n tg r o w t 1a n d d e v e l o d m e m k e yw o r d s ：占r 以阳地盘，“砟曰；b j c h i l ；i n d u c e d ；a d 印t o r - p c r ：爿g 阳6 口c 把r f 蝴 f “岜廊c 把肝s m e d i a t e 出p r o m o t e r ；如n c t i o n a la n a l y s i s 广西大掌顼士掌位论文芥菜几丁质碑基因b j c h l l 启动子功能的初步分析 1 1植物几丁质酶概述 前言 几丁质酶( e c 3 2 1 1 4 ) 是一种由单基因编码的降解几丁质的糖苷酶【1 i a 几丁质酶 ( c l l i t i n a s e ) 主要水解几丁质多聚体中伊1 ，4 糖苷键，产生n 一乙酰氨基葡萄糖寡聚体。 多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶。高等植物本身不含作为真菌细胞壁组 分之一的几丁质，但当植物受到真菌、细菌和病毒等感染时，几丁质酶的活性迅速提高。 因此，普遍认为几丁质酶与植物对病原微生物的抗性有关，是重要的病程相关蛋白。 1 1 1 植物几丁质酶的结构和分类1 2 】 典型的几丁质酶由n 端信号区、催化区和c 端延伸区组成，有的还有几丁质结 合域。各功能域具有各自的功能。n 一端信号区由2 0 多个氨基酸组成，引导几丁质酶 运输到内质网，该区段与酶的抑菌活性有关；催化区负责催化功能，催化作用并不是抗 真菌活性所必需，估计可能参与干扰真菌菌丝的生长；定位于液泡的几丁质酶具有c 端延伸区，该区是几丁质酶导向液泡所必需也是足够的信号【3 j 。缺乏c 端序列的几丁质 酶基因转化烟草不会提高抗病性，将烟草几丁质酶基因导入酿酒酵母中，表达产生的几 丁质酶有9 4 存在于胞内( 液泡中) ，切去c 端7 个氨基酸的编码区，转化后酶却分泌 到培养基中【4 】。 对植物几丁质酶的分类已经过多次改进，s 1 1 i 1 1 s l l i 等pj 提出几丁质酶可以归为三类， c o l i i n g e 等f 6 】在其基础上增设了第4 类。i 类几丁质酶结构上包括3 个功能区域，即n 端区是几丁质结合区，c 端区是酶的催化区，也是酶的主要功能区域，二者通过一 个多变的交联区连接在一起；i i 类仅具有类似于i 类的酶催化区域，而没有几丁质结合 区和交联区：i i i 类与i 、i i 类没有同源性；类类似于i 类，但功能区较小，保守序列 中有4 处缺失，其中仅有i a 型定位于液泡7 1 。根据不断更新的研究资料，n e u h a u s 等s 】 对上述分类系统进行了改进，将几丁质酶细分为4 个大组9 个亚组。相信随着研究的深 入，更加详细、合理的分类系统将会被提出，这将有利于对该酶的合理有效利用。 岭； 广西大掌司陆掌位论文 芥菜几丁质酶墓因b j c h l l 启动! 窆竺竺竺兰竺塑 1 1 2植物几丁质酶的功能【9 】 1 1 2 1 参与植物抗胁迫反应 现已证实几丁质酶是主要的植物病程相关蛋白之一，不 过大多数几丁质酶也可受某些非生物因素的诱导，这说明几丁质酶的诱导表达是植物对 逆境的般反应。h o n g 等【1 0 】的研究表明，病原诱导几丁质酶表达过程中a b a 、n a c l 和干旱等因素也有着重要的作用。s c h n e i d e r 等【l i l 进一步发现，病原和水杨酸诱导的 几丁质酶活性上升与植物体内的c a 2 + 密切相关。c a 2 + 是植物体内重要的第二信使， 广泛地参与了植物逆境胁迫过程中的信息传导，这一研究成为上述推断的有力佐证。 1 9 8 6 年s c l l u m b a 眦等【1 2 】首次报道了提纯的菜豆几丁质酶具抗真菌活性。进一步研 究表明1 6 】，提纯的烟草、马铃薯、黄瓜等多种植物几丁质酶对立枯丝核菌等2 0 多种病原 真菌和非病原真菌的菌丝生长或孢子萌发具有抑制作用。除抗真菌外，几丁质酶对细 菌、昆虫、螨等也表现出一定抗性。类几丁质酶大多兼具溶菌酶活性，可分解细菌 细胞壁的肽聚糖，因而能对细菌产生毒害作用；昆虫围食膜中含有几丁质物质，几丁质 酶可作用于围食膜而影响昆虫的消化。d i n g 等1 1 3 】的研究表明，转几丁质酶基因的植物 叶片在昆虫幼虫每日食物量中占2 即可导致幼虫的全部死亡。几丁质酶也可对豇豆象 鼻虫【1 4 】、蝴蝶幼虫等产生抑制或致死作用。线虫的卵壳和螨类均含有几丁质物质， 几丁质酶对这两种病原物也起作用【l “。 1 1 2 2 参与发育调控很多资料表明，植物几丁质酶的表达具有组织特异性，参与了植 物的发育调控。目前此类研究大多集中在几丁质酶与植物有性生殖过程的关系上。 r o b i n s o n 等【1 刀的研究表明，类几丁质酶和葡萄的成熟密切相关，并存在表达的组织 或器官特异性；而在胡萝h 中，几丁质酶则参与了控制早期胚胎的发割1 8 1 。此外，几丁 质酶和植物营养生长也有密切的关系。导入外源几丁质酶基因的植株生长更加迅速”。 从已有的资料来看，几丁质酶参与植物生长发育调控，可能在细胞分裂和分化以及在植 物生长发育( 如器官形成过程中) 的信号分子的产生中起作用，其详细机制尚不清楚， 有待进步研究。 1 1 2 3 其它生理功能几丁质酶还具有其它多种生理功能。m i i l i c 等研究表明，几丁 质酶可以降解固氮菌产生的结瘤因子，从而控制结瘤因子水平，使植物与根瘤菌达到共 生平衡，参与共生固氮调控：s t a l l g a r l i n 等【2 l 】的研究表明，几丁质酶广泛参与了植物光 合作用等过程。这些研究均暗示着几丁质酶具有多种生理功能，可应用领域十分广泛。 2 、l ； 广钽大学硬士掌位论文 芥菜几丁质酶基因b j c h i l 启动子功理塑翌步分析 11 3植物几丁质酾的特性 1 1 3 1 植物几丁质酶的可诱导性【2 2 】 在正常情况下，植物中几丁质酶活性较低，经诱导后活性会迅速升高，真菌、细菌、 病毒等病原微生物都可诱导几丁质酶的活性迅速上升l 。此外，大多数几丁质酶也可受 某些非生物因素，如机械损伤、乙烯、紫外光等【7 】的诱导。有的植物几丁质酶除具有几 丁质酶活性，还具有核糖体失活蛋白活性【2 4 l 和蛋白酶抑制剂活性等【2 5 1 。目前普遍认为植 物体内不同类型几丁质酶的诱导存在着极其复杂的机理，如s a l z c r 等【2 6 】在苜蓿菌根形 成过程中发现：病原侵染导致i 、类几丁质酶基因被诱导了；结瘤的形成也导致 了同样种类酶的诱导表达，但成瘤的早期i 、n 类几丁质酶基因被诱导，而瘤成熟阶段 类几丁质酶基因被诱导；在菌根形成过程中上述3 类几丁质酶基因的表达水平没有变 化，而一种类几丁质酶基因被强烈地诱导表达了，但有另外2 种类几丁质酶基因在 上述所有过程中均未被诱导。由此可见，几丁质酶的诱导存在着极为复杂的机理，对这 方面的深入研究将为在不同的领域选用不同类型的几丁质酶提供依据。 植物几丁质酶基因的表达通常可被多种不相关的诱导因子所诱导，这些诱导因子包 括：病毒、类病毒、细菌、病原真菌、植物寄生真菌、真菌细胞壁组分、脱乙酰几丁 质、昆布多糖、乙烯、水杨酸、某些盐溶液、重金属、紫外光、臭氧、昆虫取食及机械 损伤等。诱导可以发生在不同的组织器官中，包括胚、种子、子叶、根、茎、叶、花、 愈伤组织、悬浮细胞和原生质体。 1 1 3 2 植物几丁质酶基因表达特点唧 植物几丁质酶基因表达受反调节作用，如菜豆单用激发物处理，几丁质酶水平升高 1 5 6 倍，而激发物加i a a 处理则几丁质酶水平不升高，也表明生长素对几丁质酶诱导 的遏制作用。植物几丁质酶基因表达亦表现出协同遏制，即某些转基因植物中几丁质酶 水平低于未转化对照植株，转入的基因和受体植物的几丁质酶基因都破遏制。例如，h a n 等将烟草几丁质酶a 基因转入野生烟草，受体植物不存在几丁质酶a ，但有与几丁质 酶a 高度同源的几丁质酶b ，在密封管内生长的转基因植物有2 5 表现“基因沉默”( g e n e s i l e n c e ) 现象，几丁质酶水平低于未转化对照植株。而这种协同抑制机制尚不清楚。 f i l l 【u d o 等认为几丁质酶b 基因启动子的2 6 8 2 4 7 区的7 2 b p 可能起遏制子的作用。植物 、孽0 广西大掌硕士掌位论文 芥菜几丁质醇墓因b j c h i l 启动子功能蝗初竺分析 几丁质酶在常态下的基因表达和酶活性有组织专化性并受发育调节。一般而言，根和花 器中几丁质酶活性水平高于其他器官。黄瓜1 1 日苗根中存在6 种酸性的几丁质酶，其 中2 种为根中特有，其余4 种也在子叶和茎中发现，不过以根中含量最高，碱性几丁质 酶在根中未发现。x u 等发现水稻几丁质酶基因r c 2 4 在根和茎中表达，而在叶中未发 现，但在叶组织受伤时，在叶中高效表达。1 酞a l 【u r a 等从水稻雌蕊分离出几丁质酶基因 o s c h i a l ：1 7 5 ，并发现该基因在水稻抽穗期的花器( 雌蕊、雄蕊、浆片) 中高发表达，而在 营养器官中表达水平极低或不表达。另外，花中几丁质酶活性依花龄而异，c l a s sh 几丁 质酶在烟草中随花的成熟而积累，健康烟草花中至少有5 种酸性的几丁质酶，其中2 种 在萼片和花瓣中表达最强。花中特定几丁质酶的积累可能在有性生殖中起作用，但尚未 确定。健康叶中几丁质酶活性水平低于根和花。衰老的烟草叶实质上无酸性几丁质酶活 性，而顶叶至少含有7 种几丁质酶；碱性几丁质酶在老叶和顶叶中的活性水平相等。大麦 中有一种几丁质酶c h i 2 6 特异性地在糊粉细胞中表达，经分析启动子，发现2 1 7 9 2 1 4 7 区负责活化糊粉细胞中转录和抑制叶中转录。 1 1 4 几丁质酶基因的克隆 到目前为止在g e i l b a n k 中登陆的几丁质酶基因核苷酸序列已有2 7 7 8 条，其中已有2 5 6 个几丁质酶基因被克隆，部分已克隆的几丁质酶基因见表l l 。 4 广西大掌硕士掌位惶。文 芥秉几丁质酶l 园b j c h l l1 翌! 兰兰竺竺兰竺竺 裘i i 部分已完隆的凡丁质醇基因” n b kl ec h m 口m ；c b m d 莲斟暂l j ： 米隙作者 序列导 砷份 c 坫4栅秉r 驯耀州x 6 1 4 s 3 日 m 刷椭rj 杨 c h c hrl j 。l 0 、u 0 1 6 6 11 忡4 曲口“c 们3大蠢嘲耪崖l 翻hr l3 4 2 i 仉l 3 4 2j i1 9 州 凸咿i自辫矗蛀e h m d 4 9 0 5 ，i 帅8 曲疋摩稻k mc y l 4 强、“0 ；拍i w s 册雌旭茁位染的甜菜n t k nkkl 2 5 s 拍 i 帅4 甩4嚣草m e “ls) ( 6 5 m ) 【6 5 7 0 l i 帅 曲d 小n f l 7 、咖a d 缓荻霉病番茄 d 帅h 抽nz 5 i 罅b z 4 li 鲫3 c ”集 帖i期5 6 1 0 l 。1 6 正邢松树c h a 喈sj 【j 3 1 3 l 辨6 n 越、n 州- l 、o 圳电丈w w d 卧曲c a b 0 0 6 7 4 “a b 0 0 7 1 2 h n 0 0 7 1 2 7i 聊 朋哪3甜橙 n l m c 砌2帅7 m 舌i炯草o i l l l e l ma 邮惴8 9 2 i j 8 以j柑橘p d m l r 0 4 0 1 弘 2 0 。l f 口ha e 2 西b a e 4 马镥并b 钟d h ”# l l j 0 2 6 0 5b u 0 2 6 0 82 0 1 1 0 ji自丑 v 耐kx 6 j 8 9 吼h 1 2 6 9 7l 棚2 珊r 1 f 融c 一水陋 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结合蛋白作为转录调控因子通过与启动子d n a 结合以调节基因转录。 基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物。启动子分为三类：启 广西大掌司仕掌位论文 芥菜几丁质酶l 困b j c h l l 启兰! 兰兰竺翌兰分析 动子i 、启动子、启动子。只有启动子i i 指导m r n a 的转录。真核生物启动子由 两大部分组成：核心启动子元件( c o r ep r o m o t e re l e m e m ) 和上游启动子元件( u p s t r e a m p r o m o t c re l e m e m ) ( b u c h c rc ta l ，1 9 9 0 ) 【2 9 1 。 1 2 1植物启动子的结构 真核基因的表达是由位于转录起始位点5 上游的启动子元件调节的。研究表明，植 物启动子区域存在各种特征元件，通过同r n a 聚合酶识别、结合，诱导转录过程。启动 子含有一系列与特异蛋白结合的位点，通常称这些位点为顺式作用元件( c 打e l e m e m ) ； 这些特异蛋白则称为反式作用因子( 打臼瑚t o r ) 。 p l a c e ( h 札p ：伽m d m a 胁g o j p 触d o c s p l a c 彤)是关于植物基因顺式调控元件核苷酸序列 的数据库。可做植物启动子中顺式元件的同源对比，为鉴定可能的顺式元件提供了一种 快捷的方法【3 0 】。 1 2 1 1 核心启动子组件( c o mp r o m o t e re l e m e n t ) 指r n a 聚合酶起始转录所必需的d n a 序列，包括转录起始点及其上游的t a t a 盒。 核心组件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。 1 ) 1 r a 框( 1 a ，r a b o x ) p 1 】 t a t a 框是第二类启动子中最为典型的组件，保守序列为t a t a a a a ，通常第五或第 六个碱基由t 代替a 。它在基因转录起始点上游约一3 0 5 0 b p 处，基本上由a - t 碱基对组 成，是决定基因转录起始的关键( w a s y l y k c ta l ，1 9 8 1 ；b a s e h o a re ta l ，2 0 0 4 ) 【3 2 ，3 3 1 ，为r n a 聚合酶的结合处之一，启动子的活性取决于转录因子和r n a 聚合酶组装起来的前转录起 始复合物( m a t i l i sc ta l ，1 9 9 9 ；g r o s s c h e d le ta l ，1 9 8 1 ；s a w a h a o g oe ta l ，1 9 8 5 ) 【3 6 1 。它在转录 起始位点处组装并启动转录过程。在第二类启动子中，t a t a 盒作为接合蛋白因子组装 的起始位点。第一个与其结合的蛋白因子是1 ：a t a 盒接合蛋白( t b p ) ( p e r s e n g i e ve t a l ，2 0 0 4 ) 【3 7 】。随后它再吸引结合其它蛋白因子，直到组装成前转录起始复合物( c o xe t a i ，1 9 9 7 ) 1 3 扪。真核生物的1 a r a 盒和原核生物的1 0 b p 盒具有相类似的碱基组成，只是位 置不同，一个位于2 5 处，另一个位于1 0 处。一般来说，那些仅有在特定类型细胞中表 达的特异基因一般都具有似r a 盒结构( g u ie ta l ，2 0 0 3 ，l e b l a i l ce ta l ，2 0 0 0 ) 【39 4 0 】。但有两 种例外：一是那些控制基本生化途径的持家基因( c l a r ke ta l ，1 9 9 8 ) 【4 i 】，它们实际上在 所有细胞中都呈组成型表达，以维持细胞的生命。如：腺嘌呤脱氨酶，胸苷酸合成酶， 6 广西大掌硕士学位论文 芥菜几丁质酶墓困b j c h l l 启跫! 兰竺塑翌兰分析 以及吲哚合成酶，所有这些基因都是编码合成核酸所必须的酶。但在这些基因中往往都 含有g c 盒以弥补1 肖r a 盒的缺失。二是那些发育调控( w j i se ta l ，1 9 9 7 ； b o g o m o l s k i y a h a l o me ta l ，1 9 9 7 ) 【4 2 4 3 1 ，如：控制果蝇发育的同源异形盒基因、哺乳动物 免疫系统发育过程中活化的基因。t a t a 盒的主要功能是定位转录的起始位点。 2 ) 转录起始位点 有些第二类启动子在转录起始位点附近存在保守序列，这些位点提供最佳的转录起 始，他们被称为起始子，并且具有一致的保守序列，即p y p y a n t a p y p y ，p y 代表嘧啶( c 或t ) ，n 代表任何一个碱基，并且加下划线的a 是转录起始位点( s a n t e lc ta l ，2 0 0 0 ；“s t o n e ta l ，1 9 9 9 ；w j e 嘲e ta l ，1 9 9 8 ) 【辑删。最典型的例子是衰老腺病毒启动子的起始子。起 始子与t a t a 盒可构成一个核心启动子( l in ，1 9 9 8 ) 【4 刀，此启动子可以驱动任何位于其 后面的基因转录( 即使在一个非常低的水平) 。如果给这个核心启动子连上上游组件和 增强子，就可以刺激或增强核心启动子的转录效率( w b i se ta l ，1 9 9 7 ) 1 4 2 1 。 另一个证明起始子重要性的例子是：哺乳动物脱氧核苷转移酶( t d t ) 基因的起始 子( g 锄孙v a ye ta l ，1 9 9 6 ) 【4 羽。该基因在b 型和t 型淋巴细胞发育期间被活化。s t e p h e ns m a l e 和d a v i d b a i t i m o r e 在研究老鼠( t d t ) 基因的启动子时( s m a l e ，1 9 8 9 ) 【4 9 】，发现该启动 子中无t a t a 盒及上游组件，只有一个1 7 b p 的起始子，它足以驱动该基因在其自身保守 的a 处开始转录。在s v 4 0 启动子中，t a t a 盒盒g c 盒能极大地刺激转录在起始子处开始 转录( s c l l l e h o f e re ta l ，1 9 8 3 ) 【5 0 】。因此，在这些基因中，单独的一个起始子就可以构成 一个简单的，具有功能的启动子，而其它的上游组件只是增强它的转录效率( c l a r ke t a 1 1 9 9 8 ) 【4 。 1 2 1 2 上游启动子组件( u p s 仃e mp f o m o t e re l e m e m ) 通常位于1 ：a t ab o x 上游，包括组织特异性序列、诱导特异性序列、组成型表达序列、 g c 盒、一7 0 b p 附近的c a a t 盒以及距转录起始点更远的上游组件如增强子、沉默子。这 些组件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子 组件，其位置也不同，这使得不同的基因表达分别有不同的调控。 1 )c a a t 盒( c a a tb o x ) c a a t 盒是真核生物基因常有的调节区，其共有序列为g g g t c a a t c t ( f r a i l g e mc t a l ，2 0 0 4 ) 刚，位于转录起始点上游约8 0 1 0 0 b p 处，可能也是r n a 聚合酶的一个结合处， 控制着转录起始的频率( b e z l l a t l ie ta l ，2 0 0 l ；k u s n e t s o ve ta l ，1 9 9 9 ) 1 5 2 彤1 。在很多第二类 启动子中还发现了另外一个被称为c a a t 盒的上游组件。其共有序列是g g c c a a t c t ， 7 广西大掌硕士学位钝文 芥菜几丁质酶墓因b j c h i l 生竺! 兰兰竺竺兰竺塑 一般位于7 5 b p 附近( s o n gc ta l ，1 9 9 8 ) 【5 4 1 。在兔子的伊球蛋白基因中，如果缺失掉c a a t 盒，则其转录效率只有原来的1 2 ( d e l v o y ee ta l ，1 9 9 3 ) 【5 5 】。这就表明：c a a t 盒可能 控制着转录的频率。在其它的许多实验都证实了c a a t 盒在启动子中具有重要作用。至 少有两种转录因子结合在c a 盯盒上，即c a a t 盒结合转录因子( c t f ) 和c a a t 盒结合 蛋白增强子( c e b p ) 。 2 ) g c 盒( g c b o x ) g c 盒通常位于c a a t 框的上游或下游，由g g c g g g 组成，是一个转录调节区，有 激活转录的功能。m c 跚g h t 和鼬n g s b u r y 用接头突变替换法研究了疱疹病毒胸腺嘧啶脱 氧核苷激酶( t k ) 基因的启动子( m c 蹦g h tc ta l ，1 9 8 2 ) 【5 6 1 ，发现t a t a 盒旁侧具有一些 重要的启动子组件，在- 4 7 到6 1 盒，8 0 到1 0 5 这两个区段的突变将导致启动子严重失活， 在编码链上这些序列是g g g c g g 和c c g c c c ，又称之为g c 盒。后来在许多启动子中发 现存在g c 盒，通常位于1 a r a 盒上游。在s w o 启动子中有6 个拷贝g c 盒。将这些g c 盒 突变将极大的降低启动子的活性，如缺失一个g c 盒将使启动子的活性降低至原来的6 6 ，缺失两个g c 盒将使启动子的活性降低至1 3 。细胞中一种称作s p l 的特异转录因子 与g c 盒结合，并刺激转录。g c 盒翻转1 8 0 仍具有功能( 如：疱疹病毒胸腺嘧啶脱氧核 苷激酶( t k ) 基因的启动子的g c 盒) ，但g c 盒并不具有典型增强子那种位置的不依赖性 ( r o s se ta l ，2 0 0 1 ) 【5 7 】。增强子与启动子的距离可以改变几千碱基对，甚至可位于下游基 因编码区内都能发挥作用。而将g c 盒与t a t a 盒的距离改变几十个碱基后将失去刺激转 录的功能( i n o u ee ta l ，1 9 9 3 ) 1 5 8 】。 1 2 2 植物启动子的种类 启动子是转录所必需的调控序列。目前人们己经从植物、动物以及微生物中分离到 了许多适用于植物转化的启动子，按照其作用方式可分为三类：即组成型启动子、组织 或器官特异型启动予和诱导型启动子。这种分类大体上反映了它们各自的特点，但在某 种情况下，一种启动子往往兼具有其它类型启动子的特性。 1 2 2 1 组成型启动子 在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而 称之为组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒( c a m v ) 广西大掌硕士掌位论文 芥菜几丁质酶基园b j c h l l 启动子功能的初步分析 3 5 s 启动子，它具多种顺式作用元件1 5 9 1 。其转录起始位点上游一3 4 3 4 6b p 是转录增 强区，3 4 3 2 0 8 和2 0 8 9 0 b p 是转录激活区，一9 0 4 6b p 是进一步增强转录 活性的区域。在了解c a m v3 5 s 启动子各种顺式作用元件的基础上，人们利用它的核 心序列构建人工启动子，以得到转录活性更高的启动子。m i t s u h a r a 等【删利用c 心f v 3 5 s 核心启动予与c a 3 5 s 启动子的5 端不同区段和烟草花叶病毒的5 非转录区 ( o m e g a 序列) 相连，发现把两个c a 3 5 s 启动子- 4 1 9 - 9 0 ( e 1 2 ) 序列与o m e g a 序列 串联，在转基因烟草中g u s 有最大的表达活性。把7 个c a m v3 5 s 启动子的一2 9 0 - 9 0 ( e 7 ) 序列与o m e g a 序列串联，非常适合驱动外源基因在水稻中表达。用这两种结构驱 动g u s 基因表达，在转基因烟草和水稻中( m s 活性比单用c a m v3 5 s 启动子高2 0 7 0 倍。 另一种高效的组成型启动子c s v m v 是从木薯叶脉花叶病毒( c 私s a v a v e i n m o s a i c v i n 塔) 中分离的【6 1 j 。该启动子2 2 2 1 7 3b p 负责驱动基因在植物绿色组织和根尖中 表达，其中2 1 9 ，2 0 3 是t g a c g 重复基序，即船l ( t i v a 血g 辩q u e n c e1 ) ，1 8 3 一1 8 0 为g a l 哺( 又称为a s 2 ) ，这两个元件的互作对控制基因在绿色组织中表达至关重要。 该 启动子1 7 8 6 3b p 包含负责调控基因在维管组织中表达的元件。c s v m v 启动子在 转基因葡萄中驱动外源基因的转录能力与使用两个串联的c a m v 3 5 s 启动子相当，两个 串联的c s v m v 启动子转录活性更强( 6 2 1 。r a l l c e 等【6 3 利用c oy m v ( c o m m e l i n ay e l l o w m o s a i cv i r u s ) ，c s v m v 启动子区和c a 3 5 s 启动子的激活序列汹1 ，a s 2 ) 人工构建 高效融合启动子，瞬时表达实验表明该启动子可驱动报告基因在双子叶植物烟草中高效 表达，在单子叶植物玉米中其驱动能力比通常使用的p 玉米蛋白启动子高6 倍。因此用 这种人工构建的高效启动子驱动抗病基因或目的蛋白基因，在双子叶和单子叶植物中 均可达到较理想的效果。 人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子，并初见成效。例如肌动蛋白( a c t i n ) 垆4 1 和泛素( u b i q u i t i n ) 【6 5 】等基因的启动子已被克隆。 用这些启动子代替c a m v3 5 s 启动子， 可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。n a o m i 等j 分别从拟南芥的色氨 酸合酶口亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替c a m v 3 5 s 启动 子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果。 由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，应用中逐渐暴露 出一些问题。例如外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物 体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍 9 广西大掌硕士掌位论文 芥菜几丁质酶基因b j c h l l 启动子功能的初步分析 了植物的正常生长，甚至导致死亡。另外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上 的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象研。 因此，人们寻找更为有效的组织、器 官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控植物基因表达。 1 ) 组织或器官特异性启动子 这类启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，目前已发现这 类启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的元件，其表达特异性由这些元件的 种类、数目及相对位置等共同决定。 根特异启动子 根的发生和发育是植物发育过程中的重要问题，研究根中特异表达基因及其启动子 无疑是重要的。拟南芥根中特异表达的黑芥予酶( m y r o s i i l 锄e ) 是由p ) 府d 基因编码的。 毋女d 启动子中存在若干器官特异性表达和植物激素应答的特异元件，如a c g t 核心序 列、c a m 盯g - m o t i f s 、g 朋r a m o t i 矗、诱导物( e l i c 洳r ) 应答元件弘b o x ( ( dt g a c ( c ) ) 、 植物激素应答元件( 如够1 元件、生长素和脱落酸应答元件、m y b 元件) 和细胞特异表 达元件等硎。其中a c g t 、c a n n t g 、g