硕士学位论文-基于miR528靶向水稻光温敏核不育系HD9802S的候选不育基因HDtms

分类号： 学校代号：10512学 号： 秘密 年湖北大学硕士学位论文（论文题名和副题名）作者姓名：朱丽娜 指导教师姓名、职称：居超明 副教授申请学位类别：硕士学位 学科专业名称：遗传学研究方向：植物遗传学论文提交日期： 年 月 日 论文答辩日期： 年 月 日学位授予单位：湖北大学 学位授予日期： 年 月 日答辩委员会主席： Application of the Wavelet Analysis inthe Fault Diagnosis of Rotating Machines“硕士学位论文”字 样A Thesis Submitted for the Degree of MasterCandidate：Zhu LinaSupervisor：Prof. Ju ChaomingHubei University Wuhan, China湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文使用授权说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。（保密论文在解密后遵守此规定）作者签名： 日期：指导教师签名： 日期：摘 要光温敏核不育水稻是一种珍贵的种质资源，为了能更好的利用该资源，必须对光温敏核不育水稻的不育基因的遗传机理及分子生物学方面进行广泛深入的研究。目前知道光温敏核不育基因的分布非常广泛，在不同的光温敏核不育系中表现出较大的差异。实验室前期的研究结果显示：该不育系HD9802S的育性受一对主效隐性基因控制，且将该不育基因定位位于水稻第二号连锁群上的SSR分子标记RM5897和RMAN8之间，进一步精细定位于第二号连锁群上的SSR分子标记RM12729和RM12732之间。将RM5897和RMAN8之间的约50K的物理距离称作光温敏核不育系水稻HD9802S候选不育基因HDtms。在BGI Rise Genome Database数据库中检索到位于RM5897和RMAN8之间的序列（编号为Scaffold002359），运用Fgenesh软件预测Scaffold002359之间的可能存在的基因，并成功预测了3个基因7个编码区，对7个编码区分别运用amiRAN靶的设计原则设计了21个干扰的靶位点。本研究中amiRAN双元表达载体的构建是分两步来进行的。首先是供体载体的构建：光温敏核不育系水稻HD9802S的候选不育基因HDtms的7个编码区21个靶位点的序列，利用PCR技术将该7个编码区的21个靶位点分别替换miR528的靶位点，而侧翼及环的结构与miR528保持一致，使其转录后RNA结构类似于miR528结构。其次是amiRAN双元表达载体的构建：将测序正确的中间载体通过结合转移mating-assisted genetically integrated cloning（MAGIC）将目标表达单元转移到双元表达载体，并通过电转法转入农杆菌EHA105中。为了能够进一步探索候选不育基因HDtms的精确位置和功能，我们将构建好的双元amiRNA表达载体通过农杆菌介导的方法转入模式籼稻9311中，目前带有抗性的水稻小苗已经分化出了，对其相关性状的研究有待进一步的验证。关键词：水稻 amiRAN表达载体 转基因 PCR 光温敏核不育基因AbstrackKey Words：目 录第一章 文献综述11.1 光温敏不育水稻的研究概况11.2 miRNA干扰研究概述31.2.1 miRNA的发现31.2.2 miRNA的发生及作用机制41.2.3 人工miRNA的概述71.2.4 siRNA和miRNA作用机制的关系81.3 构建质粒克隆载体的基本策略91.4 后基因组学研究概述与基因功能研究方法101.4.1 后基因组学概述101.4.2 后基因组研究的内容及方法101.5 植物的遗传转化及基因功能研究101.5.1 植物转基因的研究进展111.5.2 基因功能研究111.6 本研究的目的和意义13第二章 材料和方法142.1 供试材料142.1.1 水稻材料及质粒和菌株142.1.2 实验培养基152.1.3 主要试剂和仪器152.2 试验方法152.2.1 HD9802S候选不育基因HDtms人工miRNA表达载体的构建152.2.2 籼稻9311愈伤的转化21第三章 结果与分析273.1 一步PCR法获得amiRNA表达单元的供体载体结果分析273.2 amiRNA表达单元从供体载体转移到受体双元载体的设计原理图303.3 整合了amiRNA表达单元的双元载体p1301-HDtms的重组子检测323.4 农杆菌介导的籼稻转基因333.4.1 p1301-HDtms双元载体转化农杆菌333.4.2 籼稻9311转基因操作简单流程图343.5 转基因籼稻9311的阳性检测353.5.1 转基因植株基因组DNA363.5.2 转基因植株潮霉素基因PCR检测36第四章 讨论384.1 水稻温敏核不育系HD9802S候选不育基因HDtms的amiRNA干扰靶序列的设计384.2 amiRNA双元表达载体的构建策略384.3 基于LY培养基来进行籼稻9311转基因操作39参考文献41第一章 文献综述第一章 文献综述1.1 光温敏不育水稻的研究概况水稻是全世界第二大粮食作物，世界种植水稻的国家和地区有122个，其中亚洲占88.86%，美洲占6.43%，非洲占3.92%，欧洲占0.72%，大洋洲占0.08%。水稻生产的丰歉直接影响和决定我国粮食供应和人民的生活水平。根据我国人口不断增加而耕地面积逐年递减的事实，只有不断地提高粮食的产量，才能解决人类生存的粮食供应问题。21世纪人类面临着环境、资源和人口的巨大挑战，据国际水稻研究所(IRRI)的估计，消费水稻的人口每年以1.8%的速度递增，到2020年，世界人口将增至80亿，消耗大米的人数将可能比现在增加一倍。到2025年，水稻的年产量必须从现在的每年5亿6000万吨提高到8亿5000万吨，稻谷产量的增长幅度需达到74%，才能满足人口不断增长的需求。而我国一半以上人口以稻米为主食，因此，提高水稻产量和质量尤为重要1-3。在构成产量的诸多因素中，新的基因和种质资源的发掘、创造，杂种优势利用是今后粮食增产的方向和途径。1926年，美国琼斯(JWJones)首次提出水稻具有杂种优势。1964年，袁隆平在洞庭早籼中发现水稻雄性不育株，从而开始了我国水稻雄性不育研究，并提出通过选育雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢复系的三系法途径来利用水稻的杂种优势。1970年，李必湖等在海南岛崖县发现野生稻雄性不育株(简称野败)，为培育杂交水稻打开了突破口。随后开展了以袁隆平为攻关主将的全国协作研究，于1973年实现三系配套，1974年选配出强优势籼型杂交水稻组合并试种成功，1975年攻克制种技术关，1976年开始大面积推广。1973年石明松在农垦58大田中发现一株天然不育株并观察到其育性会随季节发生变化，从此揭开了水稻光温敏不育性研究和利用的新篇章。据此，学者们提出，利用光温敏核不育系在长日高温条件下制种，在短日低温条件下进行繁殖，实现两系配套，无需保持系。基于这一重大发现，1987年袁农平提出了杂交水稻发展由三系、两系到一系的战略设想。此后通过辐射、地理远缘材料间的杂交、生物技术和杂交转育等方法选育了大批光温敏不育系。在进行育种研究的同时，还对这些光温敏不育系育性的一些基本理论问题开展了研究，在理论和实践上都取得了重大成果。光敏型雄性核不育是一种新的不育类型，在育种时利用这种类型的不育系比三系配套法有许多优点。该项研究已被列入“863”国家高科技攻关计划，迅速进行了大规模的研究。1988年8月籼型光敏核不育系W6154S、粳型光敏核不育系N5047S、3111S和WD1S通过国家级鉴定，标志着光敏核不育特征能够转育到生产上推广的籼粳品种中，两系杂交稻能够用于生产。之后又在籼稻中发现了多个光敏型雄性核不育材料，以及温敏型雄性核不育材料。一批实用型低温敏核不育系相继育成后，从而使籼型两系杂交稻育种获得了突破。据“2004中国怀化国际杂交水稻与世界粮食安全论坛”报道，截至2003年，全国共育成并通过省级或省级以上技术鉴定的光温敏核不育系80多个，选育两系杂交水稻组合100多个，累计种植330多万公顷。国内外发现的光温敏核不育系水稻已有很多，比较重要的有以下几种：湖北省农业科学院石明松（1981）在NK58大田中发现天然不育株“NK58S”，以及由NK58S作不育基因供体转育而成的7001S，W6154S等，湖南杂交水稻研究中心由NK58S作不育基因供体转育而成的培矮64S；湖南安江农业学校李必湖等（1990）从超40B/H285/6209-3的F5中发现的天然不育株“安农S-1”，以及由安农S-1作不育基因供体转育而成的香125S等；湖南省衡阳市农业科学研究所周国峰等（1991），武小金等（1992）在长芒野生稻/R0183/测64后代中选育而成的“衡农S-1”；湖南亚华种业股份有限公司杨远柱等（2000），株洲市农业科学研究所杨文才等（2000）用遗传距离较远的不同生态类型材料杂交育成的籼型广亲和温敏不育系“株1S”；福建农业大学杨仁崔等（1988，1990）在IR54辐射后代5460早熟突变系中发现的“5460S”； 湖北大学 日本Maruyama等（1991）经辐射育成的H89-1（农林PL-12）；菲律宾国际水稻研究所Virmani等（1991）经辐射育成的IR32364；越南Dong等（1995）选育的TGMS-VN17。2004年，国内已报道的102份光温敏核不育系统计，农垦58 S转育的达80份，安农S-1转育的有13份和几个5460S转育的，农垦58 S、安农S-1、5460S都是自然突变株，因此，自然突变的材料无论是从种质资源还是应用方面来说都有较高价值。众所周知，光温敏核不育系是两系杂交水稻的基础，而不育系育性转换的光温反应是两系杂交水稻的关键。尽管对光温敏不育育性转换的光温反应的认识在不断深化，但是还有许多重大问题亟待解决，特别是必须尽快阐明光温反应的遗传机理和定位温敏不育基因，只有这样才能真正消除制约两系杂交水稻发展的瓶颈。目前光温敏不育系的选育进展迅速，两系杂交水稻技术已经成熟，超级杂交水稻也正在崭露头角。然而稍加分析即可知，真正在生产上发挥作用的光温敏不育系非常少，光温敏不育的基因源十分狭窄。这样不但存在遗传脆弱性带来的潜在危险，而且制约了产量水平。因此，在继续选育实用性光温敏不育系的同时，有必要发掘利用目前所拥有的光温敏资源基因来进行分子育种，将光温敏核不育基因通过分子手段和常规杂交育种手段相结合，为水稻产量和质量的改善提供理论和技术基础。水稻两个亚种的全基因组测序基本完成，分子育种技术已经开始实用化，在此基础上开展超级杂交水稻的育种研究完全有章可循。在该项研究中，将把常规育种技术与以分子生物技术为代表的高新技术有机地结合在一起，培育出具有杂种优势强大，株高株型优良，外源基因高效表达的高产、优质、多抗、高效、低耗的新型杂交水稻。可以预料，这一目标的实现，将是水稻育种技术发展史上第三次重大突破。1.2 miRNA干扰研究概述1.2.1 miRNA的发现microRNAs(miRNAs)是生物体内源性长度约为2023nt核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制4-6。1993年，Lee7等在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegan)8-10中发现了是在动物生殖时期发现的大约的长度为22核苷酸的小分子基因lin-4，它只在线虫发育的生殖和发育阶段大量表达。它的突变能够在发育的特定时期内导致细胞分裂的紊乱。例如，线虫的皮下缝合细胞在4个幼虫时期的每一期都有精确的细胞分裂模式，但是，如果lin-4基因发生了突变，线虫的生命周期中的第一幼虫期类型的细胞就会反复发生分裂。Lin-4有两个靶向mRNA，基因是lin-14和Lin-28编码核蛋白，调控线虫从生殖期向发育期的转换。Lin-4通过碱基配对的方式结合到靶mRNA lin4的3非翻译区(3-untranslated region，3-UTR)，从而抑制Lin-14的翻译但不影响其转录。通过这种方式，短暂下调Lin-14蛋白质的表达水平，使线虫由Ll期向L2期转化。此外，lin-4还以相同机制，抑制lin-28基因的翻译，它触发线虫从L2期到L3期的发育转变【8】。Lin-4功能缺失会导致线虫在幼虫晚期重复出现幼虫Ll期特征，结果导致线虫的表达特性，在成熟结构缺失和排卵受阻碍91。Lin-4使特异靶标翻译抑制，表明了miRNA基因表达调控的新机制。在几乎7年之后的千禧年， Reinhart等11在于线虫幼虫的第三期、第四期及成虫期，发现了另一个重要的决定幼虫向成虫转变的miRNA基因let-7。let-7基因编码了一个22nt RNA，遗传上的抑制基因筛选显示lin-41基因是let-7 RNA负调控的靶基因，并且在lin-41的m RNA的3-UTR序列中有let-7的互补位点。它具有着与lin-4相似的作用机制。lin-41编码一种RBCC(Ring Finger，B box，coiled coil)蛋白。Lin-41的分子功能目前还不清楚，这种蛋白质包含了几个结构域：一个RING finger、B框和卷曲螺旋，另外还有几个NHL的拷贝 Ncl、HT2A和lin-41（被认为是含有这种氨基酸基序的第一种蛋白质），这种蛋白质的结构域在动物进化上是保守存在的，这很可能暗示在蠕虫内由lin-41调控的时序模式途径也适合于其他生物。这些具有明显时间表达特异性的小分子RNA，当时科学家将称为小分子时序RNA(small temporal RNA，stRNA)。时序基因lin-4和let-7则被认为是miRNA家族的典型代表。到目前为止，已报道有几千种miRNA 存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。在植物和动物中，miRNA 虽然都是通过与其靶基因的相互作用来调节基因表达，进而调控生物体的生长发育，但miRNA 执行这种调控作用的机理却不尽相同。1.2.2 miRNA的发生及作用机制1.2.2.1 miRNA的发生虽然现在数以百计的miRNA已经从各个物种中被分离得到，但指导它们产生的基因组编码信号依然还没被鉴定。RNA聚合酶将最初的miRNA前体转录物（pri-miRNA）转化成天然的miRNA。事实上，现在所有的新近鉴定的miRNA还没有和它们调控的靶子配上对，没有哪个动物的miRNA能让我们看到它能和一个蛋白质编码基因精确地反义互补，因此使得通过扫描基因组来寻找靶基因变得更加复杂，而且，miRAN和靶基因形成不完全互补双链的结构模式还很难捉摸。mi RNA从茎环结构的前体中产生，前体转录物自身可以通过不完全的碱基配对折叠形成茎环结构，该结构在动物中的长度为7080 nt，而在植物中的长度为80-250nt。在动植物中，pri-miRNA要比茎环结构长得多，可以达到几千kb。 茎环结构中的5-或 3-端的臂都可以形成成熟的miRNA。植物mi RNA的前体在细胞核中由Dicer -like protein 1 ( DCL1) 经过剪切加工最终形成成熟的 mi RNA并释放到细胞质中。动物miRNA广泛存在基因簇现象，即多个miRNA由同一个前体RNA加工而来，且来自同一基因簇的miRNA具有较强的同源性，不同基因簇的miRNA的同源性则较弱12基因组的基因之间及结构基因的内含子区域均存在大量编码miRNA 的基因，因此，来源于 pre-mRNA 内含子区域的miRNA 伴随pre-mRNA的剪接而形成；而植物miRNA多数由单一pre-RNA加工而来，只有极少数miRNA，如miR395 存在基因簇现象13。除了极少数特例(编码miR402 的基因被发现存在于 pre-mRNA 内含子区域14，编码miRNA的基因主要存在于编码蛋白的基因之间的区域，且大多是远离 miRNA目标基因的独立的转录单元。miRNA的发生主要的过程主要分为2个阶段：(1) 启动阶段，pri-miRNA首先在细胞核内被核糖核酸酶（RNase）剪切，放出一个60-80nt的发卡结构中间体，即miRNA前体（ miRNA precursor，pre-mi RNA）并释放到细胞质中，这一过程需要依赖Ran GTPexportin-5的转运机制来完成的。（2）效应阶段，释放到细胞质中的pre-mi RNA由Dicer酶或者Dicer酶类似物剪切成约21nt长度的miRNA：miRNA双链形式15.。随后miRNA 的双链解链形成成熟的单链miRNA7，成熟的单链miRNA和内切核糖核蛋白以及其它蛋白质一起形成RNA介导的沉默复合体 RISC (RNA-induced silencing complex)。成熟的miRNA与RISC的核糖核蛋白结合形成miRNP 而发挥作用16。其中RISC的核酸部分起靶向性的作用，而蛋白质部分则起到降解信使RNA(m RNA)的作用。植物中，细胞核内编码miRNA 的基因的转录与加工是偶联的，即miRNA的形成过程是在细胞核中完成的，不存在miRNA前体从细胞核到细胞质的运输过程。首先，细胞核中编码miRNA 的基因在RNA聚合酶的作用下转录形成长度约为几百个核苷酸的初级转录物pri-miRNA；然后在一种类似Dicer 酶-DCL1 的作用下形成miRNA 前体premiRNA16，该前体长度一般为64303 nt，DCL1继续作用于pre-miRNA 而形成双链miRNA；最后，双链miRNA在miRNA甲基转移酶-HENI的作用下，使3 端最后一个核苷酸发生甲基化修饰。1.2.2.2 miRNA的作用机制在绝大多数情况下，复合物中单链miRNA与靶mRNA的3-UTR不完全互补配对，阻断基因的翻译过程，从而抑制该基因的表达。在胞浆中被称为P-bodies区域里有许多靶mRNAs和miRNAs以及许多与mRNA降解相关的酶类，P-bodies是胞浆中的一个特定单位，它包含了许多参与转录后过程的蛋白质：mRNA降解（m RNA degradation）、无义介导mRNA衰退（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）、转录抑制及RNA介导的基因沉默（RNA-mediated gene silencing）。因此，尽管P-body成分在mRNA沉默及衰退中起重要作用，但介导基因沉默机制中P-body不是必需品，而只能作为他们活动的结果。关于miRNA作用机制的p-body17的作用机制如下图1-1所示：图1-1：p-body的作用机制关于miRNA的另一种作用方式在植物体中较为常见的：当miRNA和mRNA完全配对时，则目的mRNA在互补区的特异性断裂而导致的基因的沉默，这种作用方式与siRNA18-19相似。在大部分植物中ORF与它的靶位点几乎完全配对。以siRNA参与RNAi为例进行说明，amiRNA可与RISC结合，作为模板识别信使RNA(mRNA)的靶子，通过碱基之间的互补配对，信使RNA(mRNA)与amiRNA(人工微RNA)的21bp的茎序列结合，置换出正义链。在Dicer酶、ATP和解旋酶及其他微效因子的共同作用下双链信使RNA(dsmRNA)转化成21nt左右的amiRNA，amiRNA继续同RISC形成复合体，与amiRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解，最终阻断基因的下调表达调控，使基因表达沉默。该过程也成为转录后基因沉默机制（PTGS）。该种miRNA沉默方式的具体图1-2示如下：图1-2：ami RNA作用机制1.2.3 人工miRNA的概述人工miRNA技术最早于2002年由Zeng20等应用于哺乳动物细胞系，2004年Parizotto21等将其应用于模式植物拟南芥。植物amiRNA与内源天然miRNA相似，具有高度特异性，即amiRNA可以在不影响其他非靶标基因表达的情况下，选择性沉默一个或多个靶基因22。近几年研究表明amiRNA可在组成型或组织特异性启动子控制下在活体细胞内高效表达，所表达的 amiRNA不仅可以有效干扰外源报告基因的表达，而且可以有效干扰一个或多个内源靶基因的表达。首先amiRNA运用于人体细胞内，得到了很远的沉默效应。随后运用于植物细胞内也得到了很好的沉默效果。且大量的植物品种特别是很多粮食作物都是多倍体，因此在他们的基因组中存在许多相似度很高的等位基因，amiRNA可以同时干扰多个靶基因的特点，对等位基因功能的研究有很大帮助。此外amiRNA可以有效调控基因表达量从而改变农作物性状，为作物育种提供了一种新技术。Liu 23应用amiRNA技术下调两个主要脂肪酸脱氢酶基因 ( 硬脂酰载体蛋白脱氢酶和油酰卵磷脂脱氢酶)的表达，从而将棉籽油中的高油酸和高硬脂含量水平降低。咖啡是世界上主要的饮料之一，但咖啡植物里咖啡因含量多，饮用后易引起心慌、失眠、过度兴奋等症状，对于高血脂患者来说容易使血压升高并诱发心脏病虽然也可以用一些物理和化学方法来降低咖啡中咖啡因的含量，但这不仅增加成本而且咖啡的部分风味也丧失了Shinjiro Ogita等24利用RNAi技术对控制咖啡因合成的基因进行抑制，使材料中的咖啡因含量降低了50-70Norman Warthmann25等实验表明：人工合成的miRNA可以特异性的沉默日本晴水稻的三个基因Spl11，Pds和Eui1，且沉默这三个基因可以完全不干扰水稻的其他性状。 人工miRNA除具有高效性、特异性等优点外，还有一大优点，即它能够调节基因表达程度26，而且可以获得抑制目标基因的特定程度。我们可以通过使用大量同源于目标基因的相近或远缘种设计基因表达的抑制程度。如水稻突变系LGC.1(LOW GLUTELIN Content.1)，研究中由miRNA引起的同源依赖型抑制现象，能降低麦谷蛋白表达水平，给不能消化麦谷蛋白的肾病患者带来了福音27这也是第一个商品化的miRNA品种1.2.4 siRNA和miRNA作用机制的关系SiRNA起初是在植物中发现的28。在拟南芥中大部分的小RNA是SiRNA29,它们参与了各种各样的生理过程，包括病毒防御、异染色质的构建和转基因的沉默等。miRNA和siRNA最主要的区别在于它们的来源不同，但作用机制是相通的。miRNA和siRNA有许多相通之处：分子长度相同，都是22nt左右。 两者的形成过程都依赖于Dicer酶，是Dicer的产物，因而二者5端均是磷酸基，3端均为羟基。miRNA和siRNA的合成都是由双链的RNA或者RNA前体得来的。两者均在功能复合体RISC中发挥效应，部分miRNA自然进入RNAi途径，切割靶mRNA30miRNA和siRNA也有区别：其根本区别在于miRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位，而siRNA可以是人工合成的，也可以是基因的转录片段或专座片段，关键在于siRNA没有固定的基因座位，而且本身也不是基因组的功能片段是随机产生的，所以加工位点不是保守的。两者在结构上没有本质的区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来的必然是发夹结构，而siRNA可以由互补的双链切割而来，也可以从发夹结构而来。本质区别在于作用位点上，miRNA有特定的靶位点，是针对于某一类靶mRNA而作用的，而siRNA的作用位点是随机的。作用方式上没有本质区别，是否降解或抑制靶基因取决于互补程度。在生理功能上：miRNA主要调控发育分化与凋亡，调节内源基因的表达，而siRNA则是抵制外来核酸片段侵入的一种方式，其原始作用是抑制病毒的感染。miRNA和siRNA的区别总结于下表中： 名称 miRNA siRNA 来源 内源转录体 转基因，病毒RNA或异染色质DNA 大小 约22nt 约22nt 前体 茎环状的pre-miRNA 双链结构的dsRNA 催化酶 Drosha，Dicer或Dicer复合体 DicerRISC复合体 含Argonaute蛋白家族 含Argonaute蛋白家族前体产生二聚体的数目 一个 两个以上匹配方式 不完全互补 完全互补作用目标的专一性 相对较低 高作用点 蛋白质转录水平 转录后水平靶基因的命运 抑制转录或者被降解 被降解作用的位置 主要在靶基因的3UTR区 可作用于m RNA的任何位置物种间的保守性 较高 低沉默复合体的ago蛋白 AGO1 AGO2,AGO4,AGO6 功能 发育过程中调节 抑制转录活性，内源基因的表达 感染病毒，表观遗传 1.3 构建质粒克隆载体的基本策略克隆载体（cloning vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（vector）。质粒克隆载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体,主要用于原核生物和植物的基因转移以及建立基因组文库和c DNA基因文库。质粒是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。作为克隆载体的基本要求是： 能进行独立自主复制； 具有便于外源 DNA 的插入和限制酶作用的单一切割位点； 必须具有可供选择的遗传标记，例如具有对抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体；噬菌体载体；柯斯质粒载体； M13 噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。根据以上的克隆载体的基本要求，构建质粒克隆载体的基本策略如下：选用合适的出发质粒。出发质粒（也称亲本质粒）中应含有质粒克隆载体必备的元件，如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子。正确获得构建质粒克隆载体的元件。一般采用限制性核酸内切酶切割出发质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段。此外，还可采用PCR技术从靶DNA分子中扩增出含有某些元件的特异性DNA片段。然后再采用酶连的方式将特异性DNA片段连接去出发质粒DNA分子中。组装合适的选择标记基因。构建质粒克隆载体应该组装什么样的选择标记基因，必须根据要转化的受体细胞的特性来决定。选用合适的启动子。为了构建表达质粒克隆载体，必须组装合适的启动子。在能达到预期目的前提下，构建质粒克隆载体的过程应该力求简单。1.4 后基因组学研究概述与基因功能研究方法1.4.1 后基因组学概述后基因组学（Postgenomics）又往往被称为功能基因组学（Functuional genomics），是确定基因组所有基因及其产物的生物学功能的学科，它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行的系统性研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入对基因组动态的生物学功能学研究（解涛等，2000）。1.4.2 后基因组研究的内容及方法后基因组研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等。（李子银等，2000）。后基因组研究方法采用的手段包括经典的基因打靶31，差示筛选，转基因技术，基因诱变，RNA干扰，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析32，新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析33（serial analysis of gene expression, SAGE），cDNA微阵列（cDNA microarray），DNA 芯片（DNA chip）34等。鉴定基因功能最有效的方法是观察基因表达被阻断或增加后在细胞和整体水平所产生的表型变异，因此需要建立模式生物体（model organism）（赵俞华等，2000）。目前，许多模式生物的基因组测序计划已经完成，在数据库总保存有大量功能未知的基因序列，所以急需建立基因功能的规模化研究体系。对于人类和动物基因，比较成熟的基因功能研究方法有基于动物模型的转基因和基因敲除技术、基因蛋白质相互作用的酵母双杂交体系和噬菌体展示技术、基因基因差异表达的芯片技术和双向凝胶电泳以及质朴技术。人类基因功能的研究很多程度上依赖于果蝇、线虫和实验小鼠等模式生物。在植物基因功能研究中，最有效的方法是突变体补偿技术，包括转座子标签和T-DNA突变体库技术等。近年来，RNA干扰技术和miRNA技术被证明是非常有效的基因功能分析手段，适用于所有真核生物的基因功能研究。1.5 植物的遗传转化及基因功能研究1.5.1 植物转基因的研究进展遗传转化是当今植物分子生物学的技术基石，是基因功能分析和验证的必须手段，也是加速目标基因在异种之间快速转移的重要手段，为生物应用和生物产业带来了前景。上个世纪80年代开始，一些重要物种都被陆续成功转化：Zambryski et al.,(1982)年将改造的Ti质粒导入愈伤组织。Krens等以及Hain等用农杆菌侵染烟草原生质体，并获得再生植株35-37(Krens et al.,1982; Hain et al.,1985)。1986年Ooms等用农杆菌侵染了马铃薯，并获得再生植株38(Ooms et al.,1986)。Klein39等(1988)和Gordon-Kamm40等(1990)用基因枪将外源基因导入玉米悬浮细胞，并稳定遗传。McCabe41等（1988）将外源基因导入大豆悬浮细胞并稳定遗传表达(Mccabe et al.,1988)。1992年，Vasil42通过基因枪将GUS基因和basta基因导入小麦，并获得第一个转基因小麦植株(Vasil et al.,1992)。1994年农杆菌侵染水稻愈伤组织并获得再生转化植株43-45(Hiei et al.,1994)。目前转基因棉花46(Finer and Mcmullen,1990)，玉米47-48(Kim, Utomo, et al.,2009; Liu et al.,2009; Zhao, Zhang, et al.,2009)，大豆49-51(Yan et al.,2000; Zhang et al.,2000)，油菜等已经大规模的种植，并给转基因生物产业带来巨大的希望。将外源基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法52、基因枪轰击法53、花粉管导入法、聚乙二醇介导法、激光微束法、硅碳纤维漩涡处理法和点击法等。双子叶植物遗传转化最常用的载体是来自根癌农杆菌的Ti质粒。根癌农杆菌是一种土壤细菌，与冠瘿的形成有关。但这种细菌通过茎部的伤口感染植物后，在植物顶部可以形成冠瘿组织，冠瘿的形成的原因不是细菌本身，而是细菌携带的Ti质粒。野生型Ti质粒的大小为140-234kb，它包含与冠瘿形成有关的基因、与毒性功能有关的基因以及与氨基酸衍生物冠瘿碱合成和利用有关的基因。Ti质粒的T-DNA区在农杆菌感染植物组织后可以转移到植物基因组中，这是一条天然的植物转化途径。目前对T-DNA的转移机制还没有定论，一般认为乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮等酚类小分子化合物能够诱导Ti质粒上的致毒基因Vir，Vir基因的表达产物可诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链线性拷贝，这种单链DNA分子与致毒蛋白VIR D2共价结合后，在VIR D4和VIR B蛋白的帮助引导下穿过农杆菌细胞的细胞膜和细胞器、植物细胞的细胞壁和细胞膜以及核膜，最后整合到植物细胞的染色体DNA中。1.5.2 基因功能研究1.5.2.1 农杆菌介导法农杆菌介导的植物遗传转化体系可以分为共整合载体系统和二元载体系统。经过基因操作技术得到含有解除武装的重组Ti质粒的农杆菌株后，就可以用它来感染植物组织。通常以叶圆盘为起始材料，经过选择培养可以再生出转基因植株。羧苄青霉素、氨噻肟头孢霉素，羧噻吩青霉素钠对植物细胞没有毒性，可用来在转化操作后的选择培养阶段除去农杆菌。在农杆菌转化方法中，将内含子序列插入目的基因编码序列可以提高表达效率。加入内含子后，转移基因只在转化的植物细胞中表达，而在属于原核生物的农杆菌细胞中不能表达。很多研究工作表明，转化体中只整合一个拷贝的外源基因最为理想，因为单拷贝转移基因在表达上十分有效，并且能够稳定地遗传下去。通过反向PCR可以分析转化体中的T-DNA的插入拷贝数。先用在T-DNA区没有酶切位点的第一种限制酶切割从转化体中提取的基因组DNA，然后T4 DNA连接酶将酶切产生的DNA片段连接成环状DNA分子；再用在T-DNA中间具有酶切位点的第二种限制酶将环状DNA切开，这时T-DNA序列将位于线性DNA两侧，根据T-DNA序列设计引物可以扩增插入位点两侧的DNA序列。插入位点不同是，可扩增产生大小不一样的片段，每一条扩增片段代表一个插入位点。如果插入位点在T-DNA和第一种限制酶识别位点之间存在不同的限制酶分别进行切割，并进行三个单独的PCR反应，最后根据不同反应产生的扩增条带数确定插入位点的多少，如果内的不存在第二种限制酶识别位点，三个反应的扩增条带数和扩增片段的大小应该相同。如果中间存在第二中限制酶的识别位点，扩增条带将会减少。单子叶植物没有伤应答特征，一般不能被农杆菌感染。通过使用酚类诱导物和超致毒农杆菌菌株，目前已经建立起水稻、玉米、小麦等禾本科植物的农杆菌转化体系，受体材料主要为未成熟胚和胚性愈伤组织。1.5.2.2 基因枪转化法单子叶植物遗传转化的最有效方法是基因枪直接导入法，但该方法存在外源基因拷贝数较高等缺点。外源DNA包被或吸附到金粉颗粒表面，在高压气体的作用下用基因枪发射形成高速粒子流，穿透细胞壁核细胞膜，将DNA带到细胞核中，进一步的整合到植物基因组中，在稳定整合中54(Klein et al.,1987)在通过基因枪进行转化时，使用环状、线性、双链或单链DNA都可以得到转化体，完整的细菌细胞也曾经被用来轰击植物细胞。在禾本科植物的转化中，使用最有效的启动子有水稻肌动蛋白基因的启动子Act1和玉米泛素基因的启动子Ubi等，由玉米乙醇脱氢酶基因Adh1启动子改造产生的pEmu启动子也十分有效。1.5.2.3 植物遗传转化的意义通过基因工程技术可以增强植物对病虫害和逆境的抗性，提高植物的光能转换效率，也可以给豆科植物以外的植物种类赋予固氮性状，还能够改善储藏蛋白的营养价值，改变水果的色泽和大小，延长水果蔬菜的贮藏和保鲜时间。第一个在植物上进行的重组DNA实验事实上没有产生转基因植物，但是使用了经过遗传修饰的丁香假单胞菌。在自然界，低温条件下冰的形成与成冰菌表面的蛋白质有关，这种细菌可以使用种植物对低温的敏感性增强。最普通的成冰细菌为丁香假单胞细菌，用去除成冰蛋白基因后得到的不结冰丁香假单胞细菌喷洒植物，可以减轻霜冻对植物的损伤作用。植物基因工程技术在水果蔬菜生产中有恒的应用价值。在番茄种植过程中，为了避免在运输时被挤伤，通常在果实还是绿色的时候就采摘，然后利用乙烯进行人工催熟。通过基因工程技术控制乙烯产生也可以延缓番茄果实的自然成熟过程。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）可以消化细胞壁中的果胶，导致果实变软，引起腐烂现象。Galgene生物技术公司通过反义技术开发的Flavr Savr番茄带有多聚半乳糖醛酸酶反义基因，表达产生的反义RNA与正常m RNA可以形成双链结构，能够有效地关闭PG基因的表达活性，这种果实在采摘后更容易管理和运输。1994年Flavr Savr番茄成为第一个在美国获准生产的遗传修饰产品，它的PG含量下降到正常果实的1%左右。1.6 本研究的目的和意义本研究第一部分主要基于PCR技术和结合转移技术来构建人工miRNA表达载体，将实验室前期对光温敏核不育系水稻HD9802S的不育基因HDtms定位的第二号连锁群上的SSR分子标记RM5897和RMAN8之间的约50KB的片段进行设靶构建人工miRNA表达载体。本实验的第二部分主要是对构建好的人工miRNA表达载体通过农杆菌介导的方式转入模式籼稻9311中，以期观察转基因水稻的表型是否为不育的，为今后对这个光温敏核不育系水稻HD9802S的不育基因HDtms的分离和克隆奠定基础，并最终应用于水稻的杂交育种中，为选育水稻新品种打下基础。45第二章 材料和方法第二章 材料和方法2.1 供试材料2.1.1 水稻材料及质粒和菌株由本实验室提供的籼稻模式材料9311，大肠杆菌菌株E.coli DH10，E.coli BUN21，农杆菌菌株EHA105和用于构建载体的基本质粒pDONOR-gfp，p1301-gfp，均由湖北大学生命科学学院生物化学与分子生物学实验室提供。pDONOR-gfp，p1301-gfp图谱如图2-1及图2-2所示：图2-1：质粒pDONOR-gfp图谱图2-2：质粒p1301-gfp图谱2.1.2 实验培养基LB(液)：1% Tryptone，0. 5%Yeast extract，1%NaCl，pH 7. 0，121C灭菌 20min； LB (固)：1% Tryptone，0. 5%Yeast extract，1%NaCl，pH 7. 0，1.5% Agar，121C 灭菌 20min； NZY：1% NZ-Amine，0.5% Yeast extract，0.5% NaCl，pH 7.5， 0.625%(v/v) Mgcl2(2M)， 0.625%(v/v)MgSO4(2M)，2%(v/v)葡萄糖(1M)，121C灭菌20min；LY培养基：用于转籼稻9311的LY培养基由武汉大学生命科学学院3135实验室提供。2.1.3 主要试剂和仪器EDTA、Tris：武汉亚法公司进口分装SDS、溴酚蓝：Sigma公司 异戊醇：天津博迪公司LA-taq酶、-EcoT14Marker：TaKaRa公司 d NTP：Genciwe公司植物凝胶、酸水解干酪素、头孢霉素、乙酰丁香酮、MS铁盐，谷氨酰胺，Tris饱和酚：北京鼎国公司相关引物及测序服务：上海桑尼生物科技有限公司提供七水合硫酸亚铁：国药集团 酵母浸粉：北京奥博星蔗糖：天津市红岩化学试剂公司 潮霉素B（Hygromycin B）：德国产TECHNE TE512型PCR仪：英国产 Tripette、Finnpiptrre移液枪DYY-8C型电泳仪，DYCP-31DN型电泳槽：北京六一公司Tanon凝胶自动成像系统：上海产 50ml，100ml广口三角瓶、90mm塑料培养皿：武汉申博公司其他常规试剂采用进口分装或国产分析纯。2.2 试验方法2.2.1 HD9802S候选不育基因HDtms人工miRNA表达载体的构建2.2.1.1 候选基因HDtms靶位点的设计及引物的合成本实验室前期的研究表明，该温敏核不育系水稻HD9802S的育性受一对主效隐性基因控制，并且将该候选不育基因HDtms定位于水稻第二连锁群上的SSR分子标记RM5897（6，733，537-6，733，67）和RMAN8(6，780，044- )之间。在BGI Rise Genome Database数据库中检索到位于RM5897和RMAN8之间的序列（编号为Scaffold002359），运用Fgenesh软件预测Scaffold002359序列可能存