细菌染色技术

细 菌 染 色 技 术,细菌染色方法,细胞不染色而背景染色,燃料与细胞结合而染色,常用的染色方法,革兰染色：最经典常用；革兰阳性、阴性菌；初步识别特殊形态 抗酸染色：抗酸性、非抗酸性细菌；用于结核病、麻风病等 荧光染色：敏感性强、效率高、易观察；用于结核分枝杆菌等 其它：鞭毛染色鞭毛有无、位置、数量； 异染颗粒染色白喉棒状杆菌； 荚膜染色,常用燃料,碱性染料 带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。常用的染料有碱性复红、结晶紫、亚甲蓝等。 酸性染料:显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。 通常用来染细胞质，而很少用于细菌的染色。常用的染料有伊红、刚果红等。 复合染料（中性染料）：是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红亚甲蓝）、姬姆萨染料(伊红天青)等； 荧光染料：如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。用于某些特殊的染色技术。 脂溶性染料 如Sudan black。,染色方法的分类,1.单染法:采用一种染料染色 如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种细菌均染成同一种单一的颜色。故此法只能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别价值不大。 2.复染法（鉴别染色）: 采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。,染色过程,涂片,干燥,固定,染色,水洗、吸干,镜检,细菌基本形态结构,基本形态 球菌 杆菌 弧菌 特殊结构 芽孢：枯草杆菌、破伤风梭菌 荚膜：肺炎链球菌 鞭毛：变形杆菌,标本处理,痰液：用无菌棉签挑取干酪样或脓性痰部分0.05-0.1ml，涂于载物玻片右2/3 处，均匀涂抹成卵圆形痰膜（约2cm长),每张玻片只涂一份标本。 脓液： 同痰涂片法。 病灶组织或干酪块等：先用组织研磨器磨碎后再行涂片。大小、厚度同痰涂片。 体液标本：取标本10ml，3000rpm,离心30min，取沉渣涂片。大小、厚度同痰涂片。 脑脊液：将脑脊液离心或甩片集菌后涂片备用。 大便：取粘液便或者血便少量均匀涂布玻片，不可过厚。,标本处理注意事项,标本应以打圈的方式反复涂抹均匀，避免标本涂布不均影响结果判读，或使染色不均造成阴阳不定。 标本涂布不能过厚，影响染色效果。 体液标本应浓缩集菌后取沉渣涂片。,普通染色法,革兰染色法（Gram Stain）,是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是由丹麦细菌学家 Christian Gram氏于18821884年发明的，至今已逾百年，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色方法。,一、原理 细菌经结晶紫初染染成蓝色。G+菌细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而G-菌细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。,二、步骤,标本处理,用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。 不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精(ethanol)。 复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。,三、结果: 阳性菌紫色 阴性菌红色,固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP” （Grams Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G”或“GN” （Grams Negative）表示。,四、影响因素,1.操作： 涂片的厚薄，不宜过厚 染色时间的把握，尤其是脱色时间，脱色不宜过度 固定过程不可用酒精灯直接加热，避免过热使菌体变性而影响染色效果。,2.染液 染液用完后应及时盖上盖子，以免挥发影响染色效果 3.细菌因素 被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如培养时间过长革兰阳性菌可能染成阴性，所以被检菌的菌龄一般最好在1824h之内。 某些细菌存在染色困难、不易脱色等情况，可能会出现染色不均，阴阳不定的现象。,五、临床意义,鉴别细菌： 用革兰氏染色法可将所有细菌分为阳性与阴性两类，可初步识别细菌，以利进一步鉴定。 选择药物： 可根据革兰氏染色性的不同，供临床初步选择用药方向。 与致病性相关： 大多数革兰氏阳性菌的致病物质为外毒素，而大多数革兰氏阴性菌的致病物质为内毒素。由此，可采取有针对性的治疗方案。,革兰氏阳性葡萄球菌例子 (金黄色葡萄球菌 x 1000),革兰氏阳性链球菌例子,革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌 x 1000),革兰氏阴性弧菌例子,革兰氏阳性产芽孢杆菌例子,革兰氏阳性短杆菌例子 (李斯特菌 x 1000),革兰氏阴性弯曲菌例子,革兰氏阳性棒状杆菌例子,抗酸染色法,一、原理 结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。利用这特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色），也就易于鉴别。,涂片固定 酸性复红初染 3%盐酸酒精脱色 美蓝复染 镜检,标本处理,二、步骤,染色过程中的细菌颜色变化：,抗酸杆菌,非抗酸杆菌,三、结果: 抗酸菌红色； 非抗酸菌蓝色。,抗酸染色注意事项,每张玻片只能涂一个标本，以免染色过程中因冲洗使菌体脱落，造成阴阳性结果混淆； 注意生物安全，自我防护； 脱色时间依据涂片厚薄适当调整，以无红色为止。,抗酸染色的意义： 用以鉴别抗酸菌（如结核杆菌和麻风杆菌）和非抗酸菌。,荧光染色法,一、原理 抗酸杆菌用荧光燃料Auramine O(金胺O)染色后，用含有紫外光源的荧光显微镜检查，将会发出闪亮的橘黄色。这种方法可用较低倍镜头镜检，因此能快速找出抗酸杆菌。,二、步骤：,涂片固定 金胺O染色 盐酸酒精脱色 复染 镜检,涂布均匀，不可过厚,时间可稍微延长，但不可少于规定时间,脱色时间依片子厚薄适当调整,复染时间不可过长,荧光显微镜观察有无黄绿色荧光,标本处理,三、结果: 阳性明亮橘黄色荧光； 阴性无荧光,三、临床应用： 荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。 四、注意事项： 荧光染色法可以作为分枝杆菌的初筛实验，初筛阳性的须做抗酸染色确认。,特殊结构染色法,细菌的某些基本结构如细胞壁、核质、胞浆颗粒和特殊结构如荚膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易着色，须用一些特殊染色法才能染上颜色。特殊染色法主要有荚膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、异染颗粒染色法等。这些染色法不仅能使特殊结构着色，还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色，有利于观察和区别。,负染色法,所谓负染色法是指使背景着色而细菌本身不着色的一种染色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如刚果红或水溶性苯胺黑等进行染色。因酸性染料带负电荷，而细菌本身在近乎中性的环境中也带负电荷，同种电荷相排斥，故染色时菌体不着色，而只能使背景着色。实践中常用墨汁负染色法配合单染色法（如美兰染色法）检查细菌的荚膜，使背景成黑色；菌体呈蓝色；而荚膜不着色，从而使荚膜包绕在菌体周围成为一层透明的空圈。,墨汁染色法,标本：脑脊液 处理方法：离心或用细胞离心机离心浓缩 染色方法：墨汁染色（负染色） 结果：,在细菌检验工作中，除异染颗粒染色法较常用外，由于其它特殊结构染色法操作费时，费用较高、染色过程要求非常严格，而普通染色法虽不能使特殊结构本身着色，但菌体着色后，荚膜和芽孢部分由于不着色也能显示出来，再加上特殊染色法比较复杂，故日常工作中较少使用这些特殊结构染色法。,特殊染色,鞭毛染色,质量控制,每批或每天染色时应同步进行质控，质控方法如下：,被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的,陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在,1824h,之内。,被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰