DNA重组技术基本工具.ppt

布雷斯塔警长,鹰的眼睛,狼的耳朵,豹的速度,熊的力量,1.1DNA重组质技术的基本工具,专题一：基因工程,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切, 拼接, 导入, 表达,基因重组,基因工程,基因工程操作的四个基本步骤,1）提取目的基因 2）目的基因与运载体结合 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测和表达,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫基因),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接 导入,棉花细胞(含抗虫基因),转基因棉花植株,上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,剪刀 限制性核酸内切酶,针线 DNA连接酶,运载体,所需工具,识别某种双链DNA分子_，使每一条链中两个核苷酸之间的_断开。(具专一性),主要是从_中分离纯化出来的。,约4000种,1、来源： 2、种类： 3、作用： 4、结果： 5、命名,形成两种末端,黏性末端,平末端,原核生物,特定的核苷酸序列,磷酸二酯键,P7问题2,一、限制性内切酶,“分子手术刀”,2. 简式: A P P P,腺苷,磷酸基团,高能 磷酸键,30.54KJ/mol,1. 中文全称: 三磷酸腺苷,ATP分子中具有高能磷酸键,一分子ATP中含有的腺苷、高能磷酸键和磷酸基团的数目依次为 A、1，3，2 B、1，2，1 D、2，3，1,C、1，2，3,ATP的水解过程,APP P,为生命活动提供能量,细胞分裂、 营养物质吸收 神经系统活动、 肌肉收缩,1、组成元素：,三、核酸的分子结构,2、基本单位：核苷酸,脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,3、核苷酸链,脱氧核糖核苷酸链2条 核糖核苷酸链1条,4、核酸,DNA RNA,C、H、O、N、P,核酸,水解,核苷酸,核苷酸分子简式,两种核苷酸比较,五碳糖为脱氧核糖时为脱氧核糖核苷酸（简称脱氧核苷酸） 五碳糖为核糖时为 核糖核苷酸,DNA,RNA,碱基的种类,腺嘌呤 A 鸟嘌呤 G 胞嘧啶 C 胸腺嘧啶 T 尿嘧啶 U,核酸中共有多少种碱基？,DNA,RNA,DNA: A . G . C . T,RNA: A . G . C . U,T,磷酸二酯键,A,大肠杆菌(EcoRI)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制酶,EcoRI限制酶的切割：,中轴线,黏性末端,黏性末端,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的 核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,平末端是如何形成的？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,SmaI限制酶的切割：,只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNA分子了?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,思考题：,二、 DNA连接酶 “分子缝合针”,1、种类： 2、作用部位： 3、结果：,两类,磷酸二酯键,两个相同的黏性末端的连接,连接黏性末端,连接黏性末端和平末端,DNA连接酶连接黏性末端之间的 磷酸二酯键，形成重组的DNA分子。,DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？,三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”,常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒,运载体条件：,1.能够在宿主细胞内复制并稳定保存； 2.具有多个限制酶切点以便与外源基因相连； 3.具有标记基因，如抗四环素的抗性基因。便于进行鉴定和筛选 4.对受体细胞无害，容易分离，大小合适,能带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,标记基因的作用鉴别受体细胞中是否含目的基因。如将来可用含青霉素的培养基鉴别，将含目的基因的细胞筛选出来。,运载体的作用:,一：将外源基因转移到受体细胞中。 二：利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行复制。,噬菌体侵染细菌的动态过程：,侵入别的细菌,注入DNA,合成,吸附,组装,释放,1.以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键,C,练习,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,下列四个DNA分子片段，可能是同一种限制性内切酶切割产生的黏性末端的一组是 A B C D,D,3.有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体,B D,练习,练习,4、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶 5、基因工程常用的受体细胞有（ ） (1)大肠杆菌 （2）枯草杆菌 （3）支原体 （4）动植物细胞 A. （3）（4） B. （1）（2）（4） C. （2）（3）（4） D. （1）（2）（3）,6、 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,2和7能连接形成ACGT TGCA； 4和8能连接形成GAATTC CTTAAG； 3和6能连接形成GCGC CGCG； 1和5能连接形成CTGCAG GACGTC。,教材P7思考与探究 1,2. 生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵 。,3.提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。 （1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 （2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 （3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 （4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 （5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,作业：,一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外_和_等技术,赋予生物以心得遗传特性,创造出符合人们的需要的新的_和_.又叫做DNA的重组技术 . 二、DNA重组技术的基本工具 1.限制性核酸内切酶-”分子手术刀” (1)主要来源:从_生物中分离出来的. (2)特点:能够识别DNA特定的核苷酸序列,切开,两个_之间的_ . (3) DNA末端:限制酶切割DNA产生的DNA末端有两种形式:_和_. 2. DNA连接酶-”分子缝合针” (1)作用:将双链DNA_,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_. (2)种类: E.coli DNA连接酶:只能缝合DNA的