新型疫苗疫苗及其分类附加.ppt

,一、转基因植物疫苗,疫苗的研究和开发历程,以全细胞疫苗为标志的第一次疫苗革命 以乙型肝炎基因工程疫苗为典型代表的第二次疫苗革命 第三次疫苗革命:基因疫苗研究,转基因植物疫苗的技术基础,重组基因技术 实际上是重组DNA疫苗的一种 生产疫苗的系统:高等植物 转基因植物口服疫苗，例如水果、黄瓜、胡萝卜和番茄等 转基因的植物疫苗具有效果好、成本低、易于保存和免疫接种方便等优点，因此特别适合于包括中国在内的发展中国家的需要。,转基因植物疫苗的研究方向,一种是利用植物作为工厂采生产大量的蛋白质抗原，然后经过分离和提纯，再制备成疫苗； 另一种是不需要分离和提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。,转基因植物疫苗的优越性,(1)植物细胞的全能性 植物的组织或原生质体在适当的条件下经培养能得到一株完整的可育的植物体。 (2)完整的真核细胞表达系统 在植物中表达的产物可进行糖基化、酰胺化、磷酸化和亚基的正确装配等翻译后的加工过程，使表达产物具有与高等动物细胞表达一致的免疫原性及生物活性。,转基因植物疫苗的优越性,(3)诱导粘膜免疫反应 口服植物疫苗能诱导机体产生粘膜分泌性IgA。人体粘膜是阻挡某些病原体与人体接触的第一道屏障。粘膜免疫的产生对某些传染病，尤其是通过粘膜传播的传染病的预防是非常有效的。 (4)生产简便、成本低廉 用动物或微生物生产疫苗需要特殊的条件和设备，并需要冷藏和低温运输。植物种植是最经济的蛋白质生产系统。从消耗的能源来说，阳光是植物用之不尽的能源，营养来自土壤中的肥料、矿物质和水，无需专门的设施和昂贵的设备。转基因植物的种子可用以再生产和技术转让。非常适合发展中国家的需要。,转基因植物疫苗的优越性,(5)接种简便 植物疫苗的接种途径主要是口服，无需注射。如果给婴幼儿喂服香蕉泥疫苗，不再受皮肉之痛苦，无疑会受到家长们的欢迎。 (6)安全性 植物疫苗在本质上是人类的食品，因此安全可靠，无毒性和副作用，也无潜在的致病和致癌的危险性。,转基因植物种类的选择标准：,该植物可以在世界上较多地区，特别是发展中国家种植，并能获得较高的产量； 容易给婴幼儿喂服，并能获得家长们的接受； 作为疫苗的植物可食用部位必须是可以生食的，并且有较高的蛋白质含量,(1)烟草,烟草一直是进行植物组织培养和遗传转化的模式植物，较为容易获得转基因植物。 虽然烟草含有尼古丁等有害物质，但其蛋白质含量丰富，可通过纯化技术获得蛋白质，所以较适合于如乙型肝炎等转基因植物疫苗的生产及应用研究。,(2)马铃薯,遗传转化系统已经建立，在很短时间内即可获得大量的转基因植物； 可食用的块茎组织特异性启动子已被克隆，可以使外源基因在块茎内特异地大量表达。 组织培养快速繁殖系统业已成熟，可以供应大量遗传背景一致的种苗。 马铃薯可以作为很多动物的食物，所以动物实验绝无问题。 致命的缺点:即马铃薯块茎蛋白质的含量较低，而且人类无生食马铃薯的习惯。,(3)香蕉,在发展中国家有大量的种植，而且价格非常便宜。 每个香蕉可以表达110mg左右的外源基因蛋白质，大约100500g的蛋白质抗原就足以刺激人体产生特异的免疫反应，因而一个转基因的香蕉疫苗就能给10个婴幼儿进行口服免疫接种。,其他植物,豆类植物的种子虽然含有较高的蛋白质，而且转基因豆类作物的研究也有较多成功的报道。但是豆类种子中含有凝集素类物质，因而不能生食。 大部分蔬菜和水果类植物含有较多的水分，蛋白质的含量很低，显然也很不适合作为转基因植物疫苗的表达载体。,非直接口服的转基因植物疫苗 乙型肝炎表面抗原疫苗,目前市场上用的疫苗是用酵母细胞系统生产的DNA重组乙肝病毒表面抗原疫苗 将乙肝表面抗原基因转入烟草的基因组,结果发现烟草成功表达了乙肝表面抗原。,乙型肝炎表面抗原疫苗,发现烟草源性的乙肝表面抗原能够产生抗乙肝表面抗原的抗体，除了IgG1低于酵母源性疫苗外，IgG2、IgG3、IgM和IgA的滴度均高于后者。这些抗体能识别人血清中的乙肝表面抗原。 体外实验也证明烟草源性的乙肝表面抗原保留了相同的T细胞及B细胞抗原决定簇。 虽然烟草源性的乙肝表面抗原产生抗体比较慢，而且滴度略低于现有的疫苗，但烟草提取液只含3的蛋白质，而酵母源性的疫苗却是纯化的蛋白质制剂。,诺瓦克病毒衣壳蛋白,引起腹泻。 Mason等人用烟草来表达诺瓦克病毒衣壳蛋白取得成功。 表达量达到烟叶总蛋白质含量的023。对这种植物源性的蛋白质结构进行分析发现，它不但保留了抗原决定簇，而且能更加耐受蛋白酶的分解。在电镜下观察，其形状类似于NVLPs。 用转基因马铃薯去喂小鼠，在小鼠血清中测到了抗诺瓦克病毒的IgG和IgA抗体。,狂犬病病毒糖蛋白,McGarvey等人将狂犬病病毒的表面蛋白在番茄中表达，且表明它能与病毒天然蛋白质产生的多克隆抗体形成免疫沉淀。 他们还用植物病毒为载体得到狂犬病植物疫苗，并且在被免疫的小鼠血清中测到了中和抗体。,直接口服的转基因植物疫苗 大肠杆菌肠毒素植物疫苗,产肠毒素型大肠杆菌引起腹泻 在感染性腹泻的免疫机制中，粘膜免疫重要 用转基因植物作为口服疫苗有可能产生理想的粘膜免疫反应，从而达到预防腹泻性传染病的目的。 Mason等人于2019年根据这个原理将LT-B的编码基因转入烟草及马铃薯，研制成功转基因植物疫苗,结核转基因植物疫苗,卡介苗 结核DNA疫苗已在小鼠实验中获得了可喜的免疫保护效果 口服能表达结核杆菌蛋白质抗原的植物，有可能在肺部产生特异IgA抗体等粘膜免疫反应 把结核杆菌分泌性蛋白质MPT-64和ESTA-6基因导人烟草、黄瓜、番茄和胡萝卜的研究正在进行之中，其中MPT-64蛋白质的基因已经在番茄中获得了成功的表达。,动物传染病的转基因植物疫苗,家畜都是生吃植物的，因而转基因植物的选择范围比较广。 Carrillo等报道了他们用编码家畜口蹄疫病毒结构蛋白VP1的基因转入到植物拟南芥中，然后用转基因植物的叶子提取液来免疫小鼠，发现产生的特异性抗体能保护小鼠抵抗口蹄疫病毒的侵袭。,转基因植物疫苗研究的发展方向,优化重组基因 无抗生素抗性的转基因植物 转基因植物疫苗的稳定性,优化重组基因,在插入基因的3端加上微粒体保留信号SEKDEL多肽序列，使合成的蛋白质能保留在细胞的内质网部位，不会分泌出来，从而提高产量。 选择特异的启动子。花椰菜花叶病毒35S启动子是一个常用的启动子，适合于多种植物。对马铃薯来说，patadin启动子更为适合。在启动子3，端加上烟草蚀刻病毒5，端的非翻译区也是一种提高表达的方法。 编码甘氨酸的GGG在单子叶植物基因组中非常少见，因此将插入基因中的这一编码改为GGA是一种更适合在植物中表达的方法。 其他的方法包括去除虚假的mRNA加工信号、减少AT含量、选择植物偏爱的密码子等。,无抗生素抗性的转基因植物,在转基因植物的再生过程中抗生素作为筛选标记被广泛应用。 人类和动物在口服疫苗后，抗生素基因也势必由此进人体内，这会使人感到担忧。 有关在转基因植物的子代去除抗生素基因的策略已有不少。这些策略包括crelox重组子和转座子系统，或利用改变代谢途径和共转化等方法。 其中共转化较容易操作，其基本原理是将一个具有抗生素标记的质粒和另一个仅含目的基因质粒同时导人同一农杆菌。由于不同质粒的基因一般插入到植物基因组的不同部位，可以通过有性生殖而分离，在子一代的植株中就可以筛选得到无抗生素基因而只含有目的基因的转基因植物。,转基因植物疫苗的稳定性,植物细胞壁的天然生物胶囊作用虽然能使植物疫苗避免在消化道中过早降解，但如果它久久不能释放也显然是致命的缺点。 寻找一个最佳平衡点，使植物疫苗在最合适的部位发挥作用也是一个研究方向。,展望,虽然植物疫苗离临床应用还为时尚远，但这一领域充满了希望，吸引着广大科学研究者。 在众多转基因植物疫苗的研究中，最有可能成为商品化的植物疫苗是转基因香蕉。,香蕉具有其他植物无可比拟的3大优点：,香蕉泥已经是能被广泛接受的婴幼儿食品 香蕉是蛋白质含量最高的水果之一 香蕉有厚实的外皮，保存和运输都十分方便。,二、黏膜疫苗,粘膜,是人体先天性免疫系统中很重要的防止病原微生物入侵的生理防线 粘膜能将机体的内环境和外环境隔离开来，有效地将致病因子和对机体有害物质拦阻在外； 粘膜的分泌液可防止病原微生物在其表面生长，并可通过排泄或咳痰等生理过程将它们清除出去,黏膜免疫系统的组成,亦称为黏膜相关淋巴组织(MALT) 是指广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜固有层和上皮细胞下散在的无被膜淋巴组织以及某些带有生发中心的器官化的淋巴组织，如扁桃体、小肠的派氏集合淋巴结(Peyers patches，PP)及阑尾等。,黏膜免疫应答的诱导,启动黏膜免疫发生的场所主要是一种特化扁平上皮细胞-微褶细胞(microfoldcell,M细胞) 其功能为选择性黏附,摄取外来抗原物质并以小囊泡形式转运给上皮内淋巴细胞以及生发中心淋巴组织,诱导黏膜免疫应答,M细胞-各种病原微生物侵入机体的门户,M细胞(microfold cell)是表面具有粗糙皱折结构，覆盖在粘膜表面的滤泡相关上皮组织FAE中 M细胞的表面是稀疏的绒毛状结构，这有利于M细胞摄取大分子抗原，甚至细菌和病毒，抗原穿越粘膜的屏障，传送到下面的淋巴组织中去，诱导产生特异的粘膜免疫反应,M细胞总结,M细胞是诱导和产生粘膜免疫反应场所的门户，在那里发生了细胞的内饮和抗原的传送、及随后的病原微生物的杀灭、抗原的加工、处理和呈递，以及抗原的储存等一系列过程，最后诱导和产生了粘膜免疫反应。,黏膜免疫的优点,口服疫苗可在粘膜局部产生特异的抗体反应，来有效地阻止病原微生物的入侵甚至将其杀灭和清除出体外。 通过口服或滴鼻接种疫苗，可以使机体全部的粘膜获得抵御相应传染病的免疫保护力。 粘膜免疫也能产生很高的血清抗体效价，甚至能诱导细胞毒T淋巴细胞的活性。 接种比较方便，副作用小，安全性好，生产方便，成本也比较低。,人用黏膜疫苗,脊髓灰质炎疫苗 灭活霍乱全细胞B亚单位疫苗和减毒灭活苗 减毒伤寒疫苗 BCG活疫苗 腺病毒疫苗 AIDS疫苗?,IgA抗体介导的粘膜免疫保护效果,抗原的摄取、加工、处理和呈递，并激活抗原特异性的淋巴细胞，然后通过局部的淋巴结，进入全身性循环，再回到粘膜组织产生第二阶段的免疫效应。 此时的B淋巴细胞产生了克隆性的增殖，在再度接触抗原和辅助性T淋巴细胞分泌的细胞因子的作用下，发生了向IgA浆细胞分化的过程，进而产生大量的特异性IgA抗体,IgA抗体,免疫球蛋白总量的80是IgA抗体 在粘膜局部合成的分泌性sIgA，每天随分泌物排泄出去的sIgA的数量可高达10g,分泌性IgA的结构与功能,sIgA的多聚体结构能增强其对抗原和病原体的亲和力； sIgA表面特殊的糖成分或糖链有助于使其粘附于粘膜的表面和抵抗蛋白水解酶的消化作用。 粘膜上皮细胞产生的分泌体(secertory component，SC)很快以二硫键共价连接成sIgA并分泌到粘膜的表面,能延缓小肠中蛋白酶对sIgA的降解作用，却不影响它与抗原的亲和力。,黏膜免疫途径,鼻腔免疫 和口服 在许多情况下，鼻腔免疫更为有效，所需的疫苗量和佐剂量一般较小，且可以靶向病原体侵入的天然门户，同时避免了胃肠道的酸性环境及酶的作用对抗原的破坏,黏膜免疫在禽病防治中的作用,经滴鼻、点眼、饮水和喷雾途径免疫弱毒活疫苗，均可产生SIgA而建立相应的黏膜免疫力。 检测雏鸡l5日龄期间，局部免疫器官包括眼结膜和哈氏泪腺内，缺乏免疫活性细胞和黏膜抗体，而当1日龄接受疫苗免疫后，该部位的免疫活性细胞开始增多，说明早期免疫对免疫器官的活化至关重要。,艾滋病黏膜疫苗的现状及未来方向,胃肠道和阴道黏膜是HIV进入机体和初始感染的主要部位,能预防HIV感染的疫苗必须能够诱导长期的黏膜免疫应答 实验证实,小鼠口服免疫包裹于微粒的质粒DNA能产生HIV特异性全身及黏膜CD8+CTL应答。 另一项小鼠研究中,仅在阴道或直肠局部免疫HIV重组 Sindbis病毒后方可观察到抵抗HIV重组Sindbis病毒攻击的保护作用,而肌肉注射或经远端黏膜部位(如鼻腔)接种相同疫苗载体则不能为小鼠提供抵抗阴道攻击的保护作用。,三、治疗性疫苗,概念的提出,20世纪90年代的中期。美国Scripps的Chisari小组在2019年所发表的文章中即提出了therapeutic vaccine。 自2019年之后，治疗性疫苗愈来愈受到研究小组和公司厂商的重视，研究和开发工作迅速发展，尤其是HIV预防性和治疗性疫苗受高度重视和支持。 2019年至2000年前后，治疗性疫苗或其相关研究成果及其文章如雨后春笋般涌现 在最近三四年间，治疗性疫苗的研制工作在多种重点疾病领域广泛开展起来，尤其在AIDS、慢性乙肝、肿瘤、自身免疫病、移植排斥等疾病治疗上已获得可喜的或相当有启示性的结果，进一步激励了大量的后续研究工作。,治疗性疫苗的意义,传统疫苗的基本性质 慢性疾病极度困扰人们 在已感染或已患病个体诱导免疫应答,治疗性疫苗的概念,是指有别于传统预防性疫苗的、具治疗作用的新型疫苗。 它主要应用于发生慢性感染、肿瘤、自身免疫病、移植排斥、超敏反应等患者，发挥治疗疾病的功能，有时兼具预防功能。,治疗机制,主动地激活患者的自身免疫力 通过强化疫苗靶抗原的抗原性、激活并提高机体免疫系统对靶抗原的识别和效应阈 或改善免疫系统的总体平衡来实现治疗的目的,治疗性疫苗与预防性疫苗的不同 设计思路和原理的差异：,预防性疫苗着眼于普遍性、安全性和有效性，因此靶抗原主要为病原体本身或其天然的结构成分 治疗性疫苗着眼于病患的特殊性，以其致病的关键机理为突破口，靶抗原的选择更倾向于功能明确的病原体表位、基序、显现多肽或由此经分子改造和重组的非天然的新型分子等，针对性加强。,为增强免疫效果，治疗性疫苗经常联合应用形式多样的新型免疫技术和手段，并辅以细胞因子、共刺激分子、趋化因子等分子佐剂，辅助手段因疾病种类、人群、病程、病因不同而不一。 预防性疫苗仅提供免疫保护力；而治疗性疫苗则主要提供治疗作用，两种疫苗的结合应用可真正实现疫苗对人体健康的全面、有效的保护作用。,治疗性疫苗的种类,基于组成成分及性质的分类 新型治疗性疫苗在形式上呈多样组合，但在组成成分及性质上，可分为蛋白质、基因和细胞等3种类型。,1,蛋白质复合重构的治疗性疫苗,免疫禁忌、免疫无能和免疫耐受状态 在蛋白质水平上进行修饰 在组合上可有多蛋白的复合及多肽偶联等 抗原抗体复合物,2,基因疫苗,DNA疫苗和RNA疫苗 体内表达抗原使其在空间构象、抗原性上更接近于天然抗原 可模拟体内感染过程及天然抗原的MHC和MHC的呈递过程 可诱生抗体和特异性CTL应答 便于在基因水平上操作和改造 生产周期短，经济实用,3,多水平基因修饰细胞疫苗,以辅助分子修饰肿瘤细胞及DC细胞，可增强其免疫原性，达到治疗性目的。 通常所用的修饰分子有细胞因子如IL-2、IL-12、IFN-、GM-CSF等，有协同刺激分子如B7-1、B7-2、CD40、CD28、CD3等，有趋化因子如RANTES、IP-10及MHC分子等。 修饰可发生于多环节上，如偶联表达、共构建、质粒转染、共注射等，发挥的辅助作用也各不相同。,基于治疗疾病种类的分类 根据治疗性疫苗主要针对的疾病的种类可将其分为5种类型。,1,感染性疾病的治疗性疫苗,感染性疾病通常伴随病原体的持续存在和Th1型免疫应答的下调 重点在于清除病原体的持续性感染和上调Th1型免疫应答,2 肿瘤治疗性疫苗,人体自身细胞失控后恶性增殖的结果 通过获得对自身细胞生长的有效控制而真正消退肿瘤,3 自身免疫性疾病的治疗性疫苗,系统性红斑狼疮(SIE)、类风湿关节炎、自身免疫脑脊髓炎(EAE)等 在于对自身抗原反应的克隆失清除、失无能和失耐受 自身免疫性疾病发病与自身免疫表位诱生的Th细胞应答有关，其治疗性疫苗设计重点在于重新消除对自身抗原的特异反应性T细胞克隆,4 移植用治疗性疫苗,用于抗移植慢性排斥反应的治疗性疫苗可通过封闭协同刺激分子、诱导对移植物的免疫耐受来延长移植物的存活期 以多肽疫苗体外封闭移植物协同刺激分子等治疗性疫苗的设计,5 变态反应治疗性疫苗,变态反应疾病属常见病，其中的各类过敏和哮喘有致命危险 思路有:细菌未甲基化的CpG基序或人工合成的CpG寡核苷酸被认为具强免疫调节力，可诱导Th1免疫偏离，从而有效抑制Th2依赖的变态反应,影响治疗性疫苗效果的因素及其可能机理,增强机体对疫苗的摄入 改善对疫苗靶抗原的有效处理 增强对靶抗原的有效呈递 诱生全面的免疫应答,治疗性疫苗分子设计的基本策略,疫苗靶抗原的改造和组合 以抗原表位为基础的疫苗设计 模拟天然病原体感染 多水平基因修饰 不同类型疫苗的交替 新型佐剂的辅助作用 疫苗和基因治疗的联合应用,治疗性疫苗的应用,治疗性疫苗是在全球慢性病毒性疾病广泛流行和肿瘤疾病缺乏治疗手段的情况下应运而生的新型疫苗。 其目的希望通过免疫已感染或已患病机体，重新唤起、激发和增强机体所缺乏或下调的特异性免疫应答，清除感染病原体或突变的细胞，治愈疾病也可通过诱导某些免疫抑制功能，缓解或治疗超敏反应或自身免疫性疾病。,慢性病毒性肝炎的治疗性疫苗,在法定报告的传染病中，病毒性肝炎的发病率和死亡率均占首位 我国乙型肝炎疫苗于1982年面世，经过约20年的推广应用，取得了较好的预防效果，但对已感染者无效 发展新型乙肝治疗性疫苗，具有必要性和紧迫性，它的应用前景和潜在的市场都是十分巨大的,HBV和HCV慢性感染的机制,机体不能诱生有效的特异性免疫应答，尤其是病毒特异性的CTL应答。 研究证实在HBV和HCV慢性感染者中，特异性CTL的数量和活性明显下降，不足以清除肝细胞内感染的病毒；Th1类细胞因子，如IFN-和TNF-分泌下调。,传统重组DNA疫苗的治疗作用,主要用于乙型肝炎的预防。 最近的研究显示由传统肌肉注射改为皮内注射传统HBV疫苗，可大为改善免疫应答，并且可在对肌肉免疫无应答人体内诱生较好的特异性抗体和CTL。 台湾学者以重组DNA的HBV疫苗免疫慢性HCV患者，发现既无毒性也无明显降低病毒复制的效果，但可改善肝损伤。提示对传统HBV疫苗的修饰和改造也应成为治疗性疫苗的设计思路之一。,基因疫苗,基因疫苗诱生特异性细胞免疫应答的优势使其在治疗性疫苗设计中格外受到重视。 Hu等以编码HCV核心抗原的基因疫苗免疫BALBc小鼠，并以核心蛋白加强免疫，结果诱生了很好的特异性体液和CTL应答。,若干新型治疗疫苗的提出,澳洲学者认为在慢性HBV或HCV感染基础上重叠感染HAV，可通过上调Thl型细胞因子，如IFN-、IL-2、TNF-等增强CTL强度而使HBV或HCV病毒的复制大为下降，因此建议HAV疫苗作为HBV或HCV的治疗性疫苗 我国科学家提出用抗原抗体复合物(immune complex，IC)疫苗治疗HBV慢性感染的方案。发现IC通过Pc受体介导可增强APC对抗原的摄取和改善抗原的呈递，上调IL-2和IFN-的分泌和提升IgG 2a的比例,已进入临床试验的慢性肝炎治疗性疫苗,其一为多肽脂化提高免疫原性 其二是在免疫诱生和效应发挥中以HTL表位辅助CTL表位功能,艾滋病的治疗性疫苗,在短短20年间，席卷全球，迄今已感染4000万人，死于AIDS的人数高达1 170万，2019年的每天新感染人数达15000，非洲部分国家成人感染率高达32，仅在肯尼亚每天新感染者就达500多人。,AIDS使患者的免疫系统遭受严重的破坏，多重继发感染严重，死亡率极高 核苷抑制剂AZT、3TC及蛋白酶抑制剂RTV组成的“鸡尾酒”，新研制的药物还有PRO542、Cyanovirin-N、AOP-RANTES、T-20等等，均为抑制HIV有效进入细胞的小分子物或蛋白。,靶抗原的选择应有效阻断HIV的感染,首选的靶抗原是包膜蛋白gp160、gp120，以此设计的在细菌、酵母、哺乳动物细胞中表达的疫苗至少有13种已经应用于临床的预防评估。 寡聚gp120被认为具有更佳的抗原性，而将构象考虑在内的以分子间二硫键偶合的gp120-gp41糖蛋白疫苗可能更有利于阻断HIV的入侵。 包膜蛋白表面的多糖基化及茎环结构可遮蔽表位，因此去糖基化或阻断茎环结构形成均有利于增强靶抗原的免疫原性。,展望,有若干种疾病治疗性疫苗已进人期和期临床试验 治疗性疫苗也面临着许多理论和技术上的尚未解决的难题 治疗性疫苗的开发在极大程度上依赖于感染性疾病、肿瘤、自身免疫病、移植免疫机理的阐明，病因学基础研究上的突破，联合疫苗的策略，疫苗研制的工艺、接种疫苗的途径等技术，才有可能加快治疗性疫苗出台的步伐,四、肿瘤疫苗,研究原由,肿瘤疫苗作为肿瘤生物治疗的一种重要手段， 已成为抗肿瘤研究的热点之一。 肿瘤疫苗通过接种引起细胞免疫， 激发人体自身的天然抗肿瘤反应达到防治肿瘤的目的。 它适应了现代肿瘤治疗中强调靶向性的要求， 它的设计力求最大程度地诱导针对肿瘤的特异性免疫应答， 在应用中需要克服的关键环节是肿瘤的免疫逃避。,机体抗肿瘤的免疫机制,机体抗肿瘤的免疫反应包括非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫， 前二者的作用微乎其微。 体内的抗肿瘤免疫反应主要是细胞介导的细胞免疫，它包括+细胞的特异应答和+细胞的辅助效应， 最终对肿瘤细胞形成直接杀伤作用的主要是细胞毒性淋巴细胞。 肿瘤疫苗的研究都聚焦在细胞毒性淋巴细胞特异性杀伤的诱导上。,抗肿瘤免疫应答的简单过程,肿瘤抗原经抗原呈递细胞（）摄取后 在胞内经蛋白酶降解成短肽并运输至内质网 经过加工后和抗原，主要为主要组织相容性复合体（）类分子结合成肽复合物，再运送定位至细胞表面。 +细胞主要是细胞毒性淋巴细胞的 细胞受体识别该复合物并引发一系列的连锁免疫反应。在该过程中,和抗原扮演了重要的角色。,肿瘤免疫逃避,肿瘤细胞绝大多数的大分子抗原都与人体的正常细胞相同， 属共同自身抗原， 免疫系统无法识别。 肿瘤细胞的特异性抗原表达低下， 免疫应答很难激发。肿瘤疫苗的理想效应是在不损伤正常体细胞的前提下， 克服肿瘤的免疫逃避， 诱导免疫系统专一识别肿瘤特异性抗原， 引发一个足以杀伤或消灭肿瘤的免疫反应。,解决的关键问题,在肿瘤疫苗的设计中要是能否很好地确定肿瘤细胞特异性抗原 在众多同种类型的肿瘤患者中该抗原是否一致 免疫系统能否通过对该抗原的识别激发特异性的免疫应答,肿瘤疫苗分类,肿瘤细胞疫苗 肿瘤多肽疫苗 肿瘤基因疫苗 肿瘤树突状细胞疫苗 （ ， ），,1,肿瘤细胞疫苗机制,是在机体肿瘤组织中提取肿瘤细胞， 经灭活处理后使瘤细胞丧失致瘤性， 但仍保持其免疫原性和抗原性， 将其主动免疫机体， 在理论上能提供肿瘤细胞的所有抗原， 包括特异性抗原和广谱性抗原， 以期形成抗肿瘤免疫应答。,特异性抗原表达低下，免疫原性低， 常无法诱导有效的抗肿瘤免疫应答。因此， 通常采用在疫苗中加入诱导免疫的细胞因子， 或导入细胞因子的编码基因，或导入协同共刺激分子的编码基因， 借此来达到增强疫苗免疫原性的目的。 白细胞介素 、白细胞介素 和粒巨噬细胞集落刺激因子（）,2,肿瘤多肽疫苗,通过提取高纯度的肿瘤细胞特异性抗原多肽， 即所谓的优势表位， 来激发特异性更强的针对肿瘤的细胞免疫。 在设计上强调优势表位。但是，稳定性较差， 在缺乏有效保护时易被降解，致使免疫效果不佳。 作为抗原表位的多肽是限制性的，只有与适合的分子结合并被呈递出来才能起效。,改善多肽疫苗的效能,通过对多肽表位氨基酸序列的修饰 无论肽序列怎么改变，必须使修饰后的表位能够被细胞识别，否则就失去意义。 添加一些免疫佐剂: 热休克蛋白、和鸟苷寡脱氧核苷酸,3,肿瘤基因疫苗,是利用基因工程技术将编码肿瘤特异性抗原的基因结合于表达载体上 （ 重组病毒或质粒 ） ， 再将疫苗直接注入机体， 借助载体本身和机体内的基因表达系统表达出期望的抗原， 从而诱导出专一性的细胞免疫应答。,基因疫苗的特点,优点:目的基因在体内充分表达， 将打破肿瘤免疫耐受， 显示出较强的免疫原性， 能够长期稳定地诱导特异性的抗肿瘤免疫反应。 缺点: 由于肿瘤患者免疫功能不足， 基因表达低下， 致使基因疫苗还不能显示出充分有效的抗肿瘤免疫。 提出的疫苗增强方案:是在基因重组过程中加入刺激免疫的细胞因子或协同共刺激分子基因， 增强疫苗诱导肿瘤免疫的潜能。,4,肿瘤疫苗,是专职的，它是目前公认的未致敏细胞最强有力的诱导刺激细胞。 在肿瘤患者中，的成熟和功能均有缺陷，这就有必要在活体外制备疫苗，之后将结合肿瘤抗原的疫苗接种至体内。,肿瘤疫苗制备,在体外用肿瘤细胞特异性抗原致敏 后， 将致敏接种至体内，或是用负载瘤细胞特异性抗原编码基因的进行接种。 将诱导特异性的细胞免疫应答，杀伤肿瘤细胞，随后尚能激发免疫记忆，对肿瘤的复发有明显的免疫抑制作用，并能持续较长的时间。,目前， 制备 疫苗较为肯定的方法有如下 种：,肿瘤细胞融合疫苗 肿瘤抗原肽负载疫苗 肿瘤基因导入 疫苗,(1)肿瘤细胞融合疫苗,先将肿瘤细胞经射线照射灭活， 再采用细胞融合技术使之与融合 肿瘤抗原可直接在融合细胞内被加工呈递， 保证了抗原的完整有效及充分呈递， 省略了一些抗原提纯等较为繁琐的中间步骤 用电融合技术融合肿瘤细胞与 制备疫苗， 并在荷瘤小鼠中诱导了特异性的抗肿瘤免疫,(2)肿瘤抗原肽负载疫苗,提取肿瘤细胞的裂解物或提纯肿瘤抗原， 将提取物与 共同培育， 在此过程中有效抗原即被 摄取呈递， 用这种已致敏的 疫苗进行接种， 可诱导出特异性较强的免疫应答。 等用恶性胶质瘤细胞裂解物致敏 ， 用该疫苗免疫恶性胶质瘤患者后， 在体内诱导了特异性的细胞毒性 淋巴细胞反应。 等将癌胚抗原肽负载 ， 用该疫苗治疗晚期结肠癌， 在患者体内检测到癌胚抗原特异的 细胞反应。,(3)肿瘤基因导入疫苗,通过质粒转染、逆转录病毒载体、重组腺病毒或肿瘤 电穿孔等基因工程技术将编码肿瘤特异性抗原的基因导入 ， 再免疫机体。 该类疫苗的特点是导入的基因在体内能够长期表达肿瘤靶抗原， 并不断被 呈递， 能有效打破免疫耐受， 维持一个较为稳定的免疫保护状态， 是当今较为推崇的一种改良 疫苗。 等将编码癌胚抗原和协同共刺激分子的基因导入 ， 用该疫苗免疫机体治疗结直肠癌， 诱导了有效的抗肿瘤免疫。,其他肿瘤疫苗,颗粒性肽 复合疫苗 超抗原疫苗 抗独特型抗体疫苗,A,颗粒性肽 复合疫苗,将多肽疫苗和基因疫苗进行综合， 设计出新型颗粒性肽 复合疫苗。它可有效激发抗原特异性 细胞反应， 对肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。 同时， 这种肽 的复合成分在引发抗瘤免疫反应的过程中具有协同效应。,B,超抗原疫苗,超抗原是近年发现并研究证实在恶性肿瘤治疗方面具有良好应用前景的免疫分子。它无需加工即可与分子结合，激活所有携带特殊细胞受体片段的细胞， 激活细胞的克隆数大约是普通抗原的 1000 倍,对靶细胞产生强烈的杀伤作用。 目前研究较多的超抗原主要是金黄色葡萄球菌肠毒素 ,C,抗独特型抗体疫苗,肿瘤抗原的抗独特型抗体具有模拟肿瘤抗原及免疫调节的双重作用， 称为抗原的内影像型， 能有效克服肿瘤的免疫逃避。 抗抗独特型抗体在不用任何载体蛋白及佐剂的协助下就能引发特异性的抗瘤免疫应答， 若将其与 等细胞因子或 耦联， 则诱发的免疫效应更强。,肿瘤疫苗前景,由于肿瘤发生发展的复杂性和多样性， 肿瘤疫苗的理论研究与实际应用目前仍存在一定差距。但不管如何， 其设计理念与研究成果已显示出强大的生命力， 有望在抑制肿瘤生长、转移和复发等方面取得突破。 在提高肿瘤疫苗效能的研究中，增强疫苗的免疫原性、克服肿瘤的免疫逃避、诱导靶向的细胞免疫将成为核心问题。,五、DNA疫苗,DNA疫苗的概念,又称基因疫苗或核酸疫苗 是一种细菌的质粒，在克隆了特异性的基因以后，能在真核细胞中表达蛋白质抗原，刺激机体产生特异的体液和细胞免疫反应，尤其是能诱导产生具细胞毒杀伤性功能的T淋巴细胞，对病毒、细胞内寄生的细菌和寄生虫所引起的传染病可能具有治疗性效果和重要的预防作用。,DNA疫苗的发现,追溯到20世纪90年代的初期，当时有一些从事基因治疗的科学家们用可在体内表达基因产物的核酸来做基因治疗的试验 两个令人欣喜的结果: 流感DNA疫苗在小鼠动物实验中显示的对不同型别毒株攻击的交叉免疫保护作用使得有希望解决流感疫苗长期以来面临的因为流行株表面