人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性.doc

人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性 作者：原野，张云生，李秀森，郭子宽，刘晓丹，侯春梅，唐佩弦，毛宁【摘要】 人干细胞生长因子（human stem cell growth factor，hSCGF）是一种早期造血调控因子。已知人干细胞生长因子具有两种形式，包括全长分子hSCGF以及在Ca2+依赖糖识别结构域（calcium-dependent carbohydrate recognition domain，CRD）内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGF。hSCGF的造血刺激活性具有严格的种属特异性。本研究目的在于探讨hSCGF能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。为克服hSCGF的cDNA GC含量较高的困难，本研究以两步PCR的方法从人胎肝cDNA文库（Clontech）中成功克隆hSCGF cDNA，进而将hSCGF成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体pGEX4T-2中，融合表达。研究结果表明，通过低温诱导（28），重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中，利用亲和层析纯化融合表达蛋白。对重组蛋白的造血刺激活性分析表明，不同于截短型分子hSCGF，全长分子hSCGF能够刺激小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞增殖。结论： hSCGF CRD不直接结合受体，可能具有其他生物学功能。 【关键词】 cDNA克隆Cloning，Expression and Purification of Human Stem Cell Growth Factor cDNA and Its Species-specificity in HematopoiesisAbstract Stem cell growth factor (SCGF) is an early-acting hematopoitic cytokine that has two isoforms including hSCGF with full length molecules and hSCGF，78 amino acids of which lost in the conserved calcium-dependent carbohydrate-recognition domain (CRD).It has been demonstrated that hSCGF is strictly species-specific in regulating he-matopoiesis.This study was aimed to explore whether human SCGF can exert synergistic stimulatory effect on heterogenous murine CFU-GM progenitor.Firstly，hSCGF cDNA was amplified from human fetal liver cDNA library by using two-step PCR.The hSCGF mature peptide coding sequence was subsequently placed at downstream of glutathione S-transferase (GST) sequence in GST gene fusion expression vector. The results indicated that there existed an additional 60 kD protein compared with mock BL21 when the cells hosting recombinant plasmid were induced with IPTG at 37.SDS-PAGE analysis demonstrated that the GST-hSCGF fusion protein mainly existed in insoluble form.When induced at low temperature (28)，the recombinant protein was mostly soluble.The GST-fusion recombinant protein was subsequently purified by using affinity chromatography.The clonogenic assay revealed that，unlike hSCGF，hSCGF had the granulocyte/ macrophage promoting activity (GPA) for murine bone marrow GM progenitor. It is concluded that，in contrast to human SCGF，the intact molecular hSCGF may have no species specificity，implying that CRD domain in human SCGF does not directly bind to corresponding SCGF receptor，but may have certain biological function.Key words human stem cell growth factor; CRD region; cDNA clone; fusion expression; hematopoietic species specificity细胞因子在造血过程中起到十分重要的调控作用1，2。Mio等31998年分离得到人干细胞生长因子（human stem cell growth factor，hSCGF）全长cDNA。该因子由323氨基酸组成，C端含有 1 个保守的 Ca2+ 依赖糖识别结构域 （ calcium dependent carbohydrate recognition domain，CRD），因此属于C型凝集素（C-type lectin）超家族成员。hSCGF的另一命名为LSLCL，其基因已被定位于人染色体19q13.3，由4个外显子和3个内含子组成4。已知人干细胞生长因子具有两种形式，全长分子hSCGF和在CRD结构域内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGF5。研究表明，截短分子hSCGF除具有协同刺激造血活性之外，还能协同VEGF诱导AC133阳性细胞向内皮细胞分化5，6。hSCGF的造血刺激活性具有严格的种属特异性，而全长分子hSCGF的同源性分析表明，人源hSCGF与鼠源的mSCGF在氨基酸水平上具有85.1%同源性，91%的氨基酸相似。为进一步探讨hSCGF的这种种属特异性是否与CRD结构域内部分缺失有关，本研究检测全长分子hSCGF能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。初步研究结果表明，hSCGF可以作用于小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞。材料和方法材料LA Taq DNA聚合酶（with GC buffer）购自大连宝生物工程公司。T载体pGEM-T easy 为Promega 公司产品。DNA连接酶，CIP（小牛肠碱性磷酸酶）以及各种限制性内切酶分别购自LTI、Promega及大连宝生物工程公司。原核融合表达载体质粒pGEX-4T2及宿主菌BL21（DE3）均为本院陆承荣博士惠赠。亲和层析柱GSTrap FF 购自Amersham Pharmarcia 公司。hSCGF cDNA克隆及鉴定引物上游： 5 CGCGAATTCGCCACCATGGAGGCAGCCTGGCTTTT 3；下游： 5 CGCGGATCC CTATTAGAAGGGGAACTCGCAGACGTAGTA 3。 PCR 反应：30 l体系含PCR模板3 l（1 g），2GC buffer I (TaKaRa)15 l，dNTP (2.5 mmol/l each) 3 l，上，下游引 物各1.5 l，LA Taq DNA聚合酶1.5 U，dd H2O补足至30 l。模板95变性2分钟，开始PCR循环：95 20秒，72 2分钟，共30个 循环，然后72 保温5分钟。PCR产物克隆与鉴定PCR产物回收后，连接于pGEM-T easy转化于受体菌，单酶切鉴定重组质粒，由大连宝生物工程有限公司测序。hSCGF成熟肽编码序列的扩增及融合表达载体质粒的构建引物上游：5 GGATCCGGTCACGGTGCTCGTGGTGCTGAACGTGAGTGGGAGGGA 3 其中斜体下划线部分为BamH I 识别位点。从后面的GGT开始为去掉了信号肽的hSCGF成熟肽编码序列。下游： 5 GGATCCCTATTAGAAGGGGAACTCGCAGACGTAGTA 3 其中斜体下划线部分为BamH I 识别位点，后面黑体为两个串联的终止密码子，相应于有义链TAATGA 。PCR 反应参数同前。回收PCR产物，与T载体连接，构建中间质粒pTsMT。测序后以BamH I切出0.9 kb 左右大小的成熟肽编码序列DNA片段，亚克隆于融合表达载体pGEX-4T2（Pharmacia）相应位点，构建融合表达质粒，命名为pGSC 。重组表达 重组质粒pGSC转化BL21（DE3）感受态细菌。挑单菌落37震荡培养。培养物分别以1/100稀释接种于液体LB（Amp+），37震荡培养至OD600约0.8。分别加诱导物IPTG至0.1、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L 。继续于37，235 rpm震荡培养2小时，SDS-PAGE分析诱导表达结果。重组蛋白存在形式的分析取37诱导表达产物超声破碎菌体离心收集上清，将沉淀重悬于PBS。分别取上清及沉淀以SDS-PAGE分析重组蛋白存在形式。低温诱导表达及诱导表达重组蛋白存在形式的分析具体方法同前，将诱导温度改为28。重组蛋白纯化4离心收集200 ml 28诱导培养物，重悬于10 ml PBS（pH 7.3，含PMSF）中。超声破碎后离心，收集上清存于4备用。层析柱GSTrap FF以PBS（pH 7.3）充分平衡，将存于4的菌体破碎、离心上清以0.5 ml/min的速度上样，之后以PBS（pH 7.3）0.5 ml/min的速度洗柱至基线。以浓度为15 mmol/L的还原型谷胱甘肽（GSH，溶于50 mmol/L Tris.HCl，pH 8.0）洗脱重组蛋白。SDS-PAGE分析纯化结果。融合蛋白协同刺激造血活性的初步分析以Ficoll（1.083 mg/ml，Sigma）常规法分离10周龄BALB/c小鼠骨髓单个核细胞，进行半固体集落培养。实验分为rmGM-CSF （5 ng/ml）组、rhSCGF组和混合组。各组设3个重复，置于37、5% CO2、饱和湿度条件下培养7天，然后计数，大于50个细胞计为1个集落。 结 果hSCGF全长cDNA的扩增根据所设计的引物，PCR产物应为包含hSCGF完全开放读码框架（ORF）的980 bp片段，电泳检测结果显示PCR产物与预期结果相符。回收的PCR产物连接于pGEM-T easy，测序结果与已发表序列相同。结果见图1。37融合表达的SDS-PAGE 检测hSCGF成熟肽蛋白预测分子量为33.8 kD，加上GST Tag（26 kD）融合蛋白分子量大小为59.8 kD。图2显示IPTG能够诱导融合重组蛋白的表达，不同IPTG诱导的重组蛋白表达量没有明显差异进一步分析显示，0.1 mmol/L IPTG在37诱导表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在于全菌裂解物离心沉淀中，如图3所示。低温诱导表达结果分析分析结果显示，不同浓度的IPTG在低温诱导的条件下，仍然可以诱导融合重组蛋白的表达，且表达量没有明显差异（图4）。28诱导表达融合蛋白的存在形式分析研究结果显示，相对于37诱导，低温诱导表达的蛋白更多以可溶蛋白的形式存在于裂解物离心上清中。显然，低温诱导表达更适合下一步的亲和层析纯化。结果见图5。融合表达蛋白的亲和层析纯化表达菌经诱导裂解后，进行GST亲和层析纯化，SDS-PAGE 显示产物纯度在90%以上，如图6所示。rhSCGF造血支持作用小鼠骨髓细胞半固体集落培养结果显示，在150-500 ng/ml浓度范围内，单纯rhSCGF组无集落形成，与已有的文献一致7。然而，当体系中存在鼠GM-CSF时，它能够协同rmGM-CSF刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。而且，这种作用呈剂量依赖性，rhSCGF浓度达到350 ng/ml时为最大值，如图7所示。讨 论hSCGF cDNA GC含量高达69%，对于PCR反应影响较大。本研究应用二步法PCR即模板DNA 变性之后，将引物的退火和延伸合并为同一个温度（72）进行，同时应用TaKaRa公司扩增GC丰富序列的专用PCR buffers，成功扩增目的基因。TaKaRa公司提供的PCR buffer包括两种，即GC buffer I和GC buffer II，用同一模板试用两种PCR buffer获得了不同的结果。这说明扩增GC丰富序列的效果需要使用者对反应条件进行进一步优化。 hSCGF分子没有潜在的N-link糖基化位点，可以应用原核表达系统进行重组表达，但是hSCGF cDNA的高GC含量对于表达效率的影响较大。GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合表达系统通过T7启动子引发的GST序列的高表达来带动下游外源序列表达，该表达系统已被用于蛋白质-蛋白质相互作用及基因的表达克隆8。本研究应用该融合表达策略，既克服了高GC含量给表达带来的困难，同时可以应用亲和层析的方法纯化重组蛋白。对于融合蛋白的存在形式的分析结果显示，在37诱导时融合蛋白主要为包涵体，即存在于细菌破碎沉淀中（图3），而在相对低温（28）时，GST融合蛋白相对更多地以可溶蛋白的形式存在于细菌破碎上清中（图5）。这种低温诱导的方法避免了包含体复性的过程，更适合下一步的亲和层析纯化。 截短分子hSCGF的造血刺激活性具有种属特异性，即人源hSCGF不能协同刺激小鼠造血干/祖细胞增殖。本研究初步证明了全长分子hSCGF具有针对小鼠骨髓细胞的GPA活性。由此结果推断，hSCGF在CRD结构域内缺失78aa可能对于该分子的造血刺激活性有一定的影响。在此情况下，hSCGF仍然保持了对人骨髓细胞的刺激增殖活性，但缺少了对小鼠骨髓造血干祖细胞的刺激增殖能力。可以推测，CRD结构域可能不象某些C型凝集素超家族成员那样直接结合受体，但对hSCGF的造血刺激活性在某些方面有一定的影响。CRD结构域在hSCGF分子中所起的生物学作用将在进一步的实验中加以证明。 Northern blot显示，hSCGF在多种造血组织或相关组织中表达，如骨髓、胎肝、胸腺等，而在外周血淋巴细胞的表达量很低。hSCGF具有协同其他系特异性调控因子（GM-CSF，VEGF等）的能力表明，hSCGF可能是一种早期造血刺激因子。其他的早期的造血刺激因子SCF，FL和TPO在造血干细胞(HSC)自我更新、增殖、分化等一系列活动中具有重要的作用9-11。因此，hSCGF可能对早期造血细胞也具有一定的调控作用，Yao等12在无血清培养体系中加入hSCGF协同其他造血刺激因子，结果提高了脐血HSC的体外扩增效率。Ito 等13的研究结果表明，用ELISA的方法检测造血干细胞移植后血清中hSCGF的含量可以作为移植后的造血恢复造血指标之一；进一步的研究表明，只有具有集落形成能力的造血细胞才分泌hSCGF13。以上结果证明，hSCGF可能会成为一种新的用于HSC体外扩增的早期造血刺激因子。【参考文献】 1 Zandstra PW，Lauffenburger DA，Eaves CJ. 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