亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2的克隆表达及免疫鉴定.doc

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2的克隆表达及免疫鉴定 作者：廖兴江，戴佳琳，黄江，胡旭初，余新炳，申萍香，周灵贵，郎书源【摘要】 目的 克隆表达亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2(UBC E2)全长编码序列，获得纯化的重组蛋白，为进一步功能研究做充分准备。方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含有UBC E2基因的质粒作为模板，扩增该基因，将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中，测序鉴定重组质粒，在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导，表达产物通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定，重组后的蛋白用His镍蛋白纯化柱纯化，并使用Western blotting分析其免疫反应性。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET28a(+)UBC E2构建成功，该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达，十二烷基肌氨酸钠纯化后蛋白通过SDSPAGE鉴定结果表明该基因在大肠杆菌BL21/DE3得到高效表达，亲和层析得到高纯度的蛋白且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别，表明其有免疫反应性。结论 亚洲牛带绦虫UBC E2可在原核表达系统中表达，并具有免疫反应性，为进一步研究该基因的功能奠定基础。 【关键词】 亚洲牛带绦虫;泛素缀合酶E2;基因克隆;原核表达;免疫反应性ABSTRACT: Objective To clone, express and conduct a preliminary immunoreactivity study on ubiquitinconjugating enzyme E2 gene from Taenia saginata asiatica, and obtain purified recombinant product to make full preparation for further function research. Methods The homologous sequence of ubiquitinconjugating enzyme E2 (UBC E2) gene from adult Taenia saginata asiatica and its fulllength coding region were obtained from the fulllength cDNA library by PCR and sequenced. Meanwhile, the encoding sequence was cloned into the prokaryotic expression vector pET28a(+), then it was endonuclease digestion and was expressed in Escherichia coli BL21 with IPTG induction. The recombinant product was purified according to the protocol NTA agarose and detected by SDSPAGE, and the immunoreactivity study was conducted with Western blotting. Results PCR, double enzyme digestion and DNA sequencing results all indicated that pET28a (+) and UBCE2 recombinant plasmid was successfully constructed. SDSPAGE results showed that gene expression took place in Escherichia coli BL21/DE3, and highly purified protein was obtained after solution, refolding and particle exchange chromatography of inclusion body deposits. The recombinant protein reacted with the serum of patients infected by Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus, which indicated its immunoreactivity. Conclusion The ubiquitinconjugating enzyme E2 gene has been effectively expressed in prokaryotic expression system and its immunoreactivity has been confirmed, which provides favorable conditions for further studies of the gene.KEY WORDS: Taenia asginata asiatica; ubiquitinconjugating enzyme E2; prokaryotic expression; immunoreactivity泛素(ubiquitin)存在于所有真核细胞中，是一种高度保守的76个氨基酸残基的蛋白，游离在细胞内或共价缀合到胞浆、核及整合膜蛋白上。泛素要经过泛素活化酶(E1)、泛素缀合酶(E2)和泛素蛋白连接酶(E3)酶级联反应才能缀合到底物蛋白。泛素蛋白酶系统是真核生物蛋白降解的一个基本的结构，蛋白的泛素化是由一系列的酶促反应所组成。研究表明，泛素缀合途径在真核细胞的许多代谢过程中起作用，包括参与核糖体生物形成、细胞周期调控、蛋白激酶活性的调节、受体胞吞的调控、DNA修复、细胞凋亡、应激反应、基因表达调控等。对于亚洲牛带绦虫泛素缀合酶的研究，国内外未见相关报道。本文对亚洲牛带绦虫(Taenia asginata asiatica, Ta)成虫cDNA文库中泛素缀合酶E2(ubiquitin conjugating enzyme E2, UBC E2)所编码的基因，构建了原核表达载体，继而获得纯化蛋白，并通过SDSPAGE鉴定表达蛋白,为研究其生物学功能、了解其在亚洲牛带绦虫生理代谢中的作用提供线索。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 虫体、血清、文库、质粒和菌株 取粪检亚洲牛带绦虫、猪带绦虫及牛带绦虫阳性患者血清。亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建、EST测序及Unigene分析由上海联合基因有限公司合作完成。大肠埃希菌BL21/DE3及原核表达质粒pET28a(+)为中山大学热带病重点实验室保存。1.1.2 主要试剂和工具酶 TaKaRa Ex Taq TM酶(含dNTP)、EcoR、Xho、DNA标准(DL15000、DL2000)购自大连宝生物工程公司;T4 DNA连接酶、异丙基硫代D半乳糖苷(isopropyhhio galactoside, IPTG)购自美国Promega公司;NiNTA Agarose(Cat.No.30210)购自德国NOVEGN公司。兔抗人IgG购自武汉博士德生物工程有限公司;DNA回收试剂盒、蛋白质分子标准购自广州东盛科技公司;质粒抽提试剂盒购自铂尔生物科技公司;SDS、丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、过硫酸胺等试剂购自上海申友生物技术公司。1.1.3 引物的合成和DNA的测序 基因扩增引物由Introvigen上海生物技术有限公司合成，重组质粒DNA的测序由英骏科技股份有限公司完成。1.2 方法1.2.1 UBC E2基因的识别 亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库由本课题组构建3。将获得的亚洲牛带绦虫unigene进行Blastx分析，克隆号为Ta HC3a12的序列是UBC E2的同源基因。分析序列的特征并确定其全长的编码序列。1.2.2 APG3基因的扩增 根据已获得的UBC E2全长编码序列的开放阅读框，利用DNAClub和PCRdesign软件设计引物：上游引物：5ATTGGATCCATGTCGACGCCTGCAC3带EcoR酶切位点，引入保护性碱基ATT;下游引物：5ACCCTCGAGTTAGGTGTCCGTATCAT3带Xho酶切位点，引入保护性碱基ACC。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库UBC E2的质粒为模板，应用上述设计的特异引物，用TaKaRa Ex TaqTM酶进行聚合酶链反应(polymerase chain reactiom, PCR)扩增目的基因，反应循环参数为：预变性，94，5min;变性，94，1min;退火，58，1min;延伸，72，1min，30个循环后72总延伸10min。PCR产物10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定回收。1.2.3 重组原核表达质粒的构建及鉴定 将PCR产物和原核表达质粒pET28a(+)用EcoR和Xho进行双酶切后回收，连接、转化大肠杆菌BL21/DE3感受态细胞，卡拉霉素筛选阳性单克隆，提取的重组质粒进行双酶切、PCR和DNA测序鉴定。1.2.4 重组蛋白的诱导表达 以含空质粒pET28a(+)的BL21/DE3作为阴性对照，将确定能表达重组蛋白的单菌落接入含有5L卡拉霉素的LB液体培养基中(菌液培养基=1100)，放入37，280r/min摇床摇至A600约为0.40.6时，取1mL为诱导前样品，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37，280r/min，摇床诱导表达5h后离心收集菌体作为诱导后样品，所有样品离心后收集菌体，用SDSPAGE检测蛋白质的表达。1.2.5 重组质粒的大量诱导和纯化 依据上述诱导表达方法对阳性克隆进行大量的诱导表达，离心收集菌体，每克菌加入3mL结合缓冲液重悬，反复3次冻融后冰上放置超声裂解细菌(功率150V，超声1s，停2s，共30min)，收集上清和沉淀，分别取上清和沉淀样品处理后行SDSPAGE判断重组蛋白的可溶性。检测得到的包涵体(超声后的沉淀)用1IB washing buffer三次重悬沉淀并4，12000r/min，20min离心，倒掉上清，洗涤包涵体。将洗涤后的包涵体沉淀加入溶于基础液的0.5g/L十二烷酸肌氨酸钠(SKL)放置1h左右，待沉淀完全溶解，溶液清亮透明，离心后透析由去离子水、TrisHCl(pH 8.5)和DTT组成的透析液，将样品加入预先处理好的NiIDA His.Bind树脂亲和层析纯化柱中，最后再用PBS透析以去掉过柱时留下的咪唑。1.2.6 蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白免疫反应性 将上述方法纯化好的蛋白用10g/L的分离胶进行SDSPAGE电泳，使用电转印仪于冰上转膜(100V，1h)，将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜，BSA室温封闭2h;再与亚带、牛带、猪带绦虫患者及正常人血清(按1400稀释)结合，4孵育过夜;次日，PBS洗3次，每次5min,然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG(按12000稀释)室温孵育1h，PBS洗3次，每次5min;3，3二氨基联苯胺(DAB)显色至出现目的条带，超纯水终止反应。2 结 果2.1 UBC E2基因的识别和序列分析 该序列推导的氨基酸序列与GenBank中日本血吸虫E2同源性分值最高，一致性达89%。该基因全长554bp，编码区为76bp537bp，编码154个氨基酸，在5端和3端都有非翻译区。rpsblast分析发现有完整的E2的保守结构域(aa17aa144)，具有半胱氨酸活性位点和泛素蛋白连接酶结合位点(图1)。图1 Rpsblast预测Ta E2的保守功能域Fig.1 Conservative domain prediction of Ta E2 by rpsblast2.2 原核重组质粒的鉴定 将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500bp左右有一清晰条带，与目的基因大小基本相符，此外重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列一致，证明重组质粒构建成功(图2)。2.2 蛋白表达纯化结果 将构建好的重组质粒转化到E.coli BL/DE3中表达，超声裂解后SDSPAGE电泳分析结果如图3中第6泳道所示，在大约25ku处出现高效表达条带，与目的蛋白基本相符。通过破包涵体，将蛋白进行纯化，结果如图中第7泳道所示，其位置与目的蛋白相符，证明目的蛋白纯化成功。测得纯化产物的蛋白质量浓度为0.675mg/mL(图3)。2.3 纯化蛋白免疫反应性(Western blotting) 用感染亚洲牛带绦虫、猪带绦虫的患者血清以及感染牛带绦虫的患者血清对纯化蛋白的Western blotting结果均显示出较清晰的条带(图中第1、2、3泳道)，而阴性对照血清(图中第4泳道)在相应位置未识别出该蛋白条带(图4)。3 讨 论泛素存在于所有真核细胞中，是一种高度保守的76个氨基酸残基的蛋白，游离存在于细胞内或共价缀合到各种胞浆、核及整合膜蛋白上。蛋白的泛素化反应是由一系列酶所介导的有序的硫酯级联反应，是通过泛素活化酶(E1)、泛素缀合酶(E2)和泛素蛋白连接酶(E3)将泛素与蛋白酶体结合，将蛋白酶泛素化从而使蛋白酶功能活化3，发挥水解蛋白的功能，因此，泛素缀合途径在真核细胞的许多代谢过程中起作用，包括参与核糖体生物形成、细胞周期调控、蛋白激酶活性的调节、受体胞吞的调控、DNA修复、细胞凋亡、应激反应、基因表达调控等45;新近的研究还发现，泛素化不仅可导致蛋白质的降解，还可直接影响蛋白质的活性和细胞内定位，是调节细胞内蛋白质功能和水平的主要机制之一。我们使用生物信息学分析，预测Ta UBC E2存在于细胞核，没有跨膜区，推测其存在于核质中。我们推测，UBC E2亚细胞定位于细胞核与上述提及的功能密切相关。已有学者研究，在泛素和底物蛋白之间催化可形成异肽键，E2酶的这一催化作用可单独完成，也可能需要E3酶的帮助6。所有已知的真核生物E2酶在一级结构上高度保守，它们都拥有一个约160个氨基酸组成的高度保守的所谓UBC结构域。在这一结构域内，E2酶具有一个特殊的半胱氨酸残基，这一半胱氨酸残基在泛素E2酶硫酯键形成中起作用。不同类型的E2酶在酵母中被广泛的研究，并且在不同的细胞事件中扮演不同角色，它们不仅与酵母具有同源性，同时在其他物种中也有同源性，例如：人、秀丽隐杆线虫、果蝇及一些植物78。2004年有学者就首次报道华支睾吸虫中E2酶的克隆表达情况，认为泛素蛋白酶E2有使硫酯形成和组蛋白遍在化的基本功能4。他们认为，在大肠杆菌中表达UBC重组体可以形成硫酯键，且传递泛素给组蛋白H2A，从而证明组蛋白的泛素化是调节细胞分裂周期的一个重要机制。这就为该基因在我们亚洲牛带绦虫中的研究中提供了一定的理论依据。本研究已经成功构建了亚洲带绦虫UBC E2原核表达载体，并获得了高效表达，十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)结果表明该蛋白在全菌和沉淀中都有表达，但在上清中未见表达，说明UBC E2是包涵体蛋白，因此我们使用6mol/L尿素溶解包涵体，经变性处理并亲和层析纯化后，得到了大量较纯的重组蛋白。Western blotting 结果表明该复合体具有较强的线性表位，说明所获得的重组蛋白具有较强的免疫反应性，本实验获得了具有免疫活性的重组蛋白。目前对于该基因在酵母的研究中已发现有13种E2酶，并且它们均参与不同的细胞功能;例如：在华支睾吸虫的研究中就发现该酶可能调节了细胞的分裂周期，但是该酶在人体带绦虫的代谢过程的功能研究还是一片空白。因此，本实验为进一步在人体寄生虫领域更全面研究UBC E2的生物学功能，特别是在亚洲牛带绦虫代谢中起着一个什么样的关键作用及是否能作为疫苗的候选分子的相关研究方面可能具有十分重要的意义。【参考文献】 1KEESEON SE. What is Asian taenia J. Parasitol Intern, 2006, 55:137141.2黄江，胡旭初，包怀恩，等. 亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及EST测序 J.热带医学杂志, 2007, 7(2):116118.3SONG L, CHEN S, YU X, et al. Molecular cloning and char