细胞工程-第十二章、试管动物与克隆动物.ppt

第一节 试管动物,1978年7月25日深夜时分，英国曼彻斯特郊外的奥德姆总医院里，一个女婴的啼哭声划破夜空，震撼了世界她就是世界上第一例试管婴儿路易斯.布朗。,一、试管动物概念 将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎，然后将发育到一定程度的胚胎移植入受体，可以得到各种动物。由于体外受精一般都在试管内进行，所以称为“试管动物”。也有称为“体外受精动物”。,二、试管动物的培育流程 精子的采集与体外获能处理 卵子的回收与成熟培养 卵子与精子的体外受精 受精卵的体外发育 试管胚胎的移植,、精子的采集与获能处理,精液的采取方法通常有：人工阴道法、电刺激法、阴道内回收法等。 对于个体较大的动物多采用人工阴道法，而对于小动物而言多采用电刺激法采精。,人工阴道法,人工阴道法是由橡胶制造的双层圆筒，两层之间充以温水（3840），后端有精液收集管以软橡胶膜袋与人工阴道相连。对于公牛而言，一般多应用台畜使爬上，将假阴道自侧面套在公牛阴茎上，使其射精。在公猪可以用猪用假阴道收集精液或用手握法采精，但仍需要台畜，使其爬上以遍进行操作。 另外，也可以用特制的电极，插到公畜的直肠内，根据不同畜种给予不同的电流刺激，经过不同的时间，即可射精而得到精液。,精液的保存,精液的保存可以分为常温（1525）、低温（05）和超低温冷冻（79-196）三种，其目的是要降低精子的代谢活动，延长其存活时间，尽量保存其受精能力。 保存前，要加稀释液，其成分按其作用可分为稀释剂、营养剂和保护剂等。 稀释剂包括等渗氯化钠溶液和某些盐溶液， 营养剂包括糖类、奶类和卵黄等， 保护剂包括有抗冻作用的营养剂和其它一些如甘油、DMSO、糖类等。,三种保存方法,常温保存主要通过降低pH值达到抑制精子的代谢活动，一般可以保存2天以上。 低温保存主要是抑制其正常的代谢活动，除猪外，其它家畜的保存效果均较好。 如果应用超低温可以在液氮中长期保存精液，用时可以即时解冻。 对于不同的动物，各种保存液的配制方法都有所差异的。,人为使得精子获能,可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道获能没有种属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。 另外，可以利用人工配制的培养液使得精子获能。,、卵子的回收与成熟培养,人工采卵是得到卵母细胞的方法通常利用激素进行诱导采卵或超数采卵。可以利用促性腺激素或黄体激素释放激素（LHRH），对小鼠、大鼠和兔子等动物进行一次性投与诱发其排卵，排卵数目不变。 以小鼠为例，通常可用35IU PMSG或23IU hCG或100g FSH 或100gLH或0.020.05g LHRH皮下或腹腔内注射，1214小时可以有70100正常排卵。,采卵,（）输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大部，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。 （）对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。,（3）对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。 （）对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。,卵母细胞一般检测,得到卵母细胞后，可根据卵泡发育的不同时期，在显微镜下检查核和胞质发育的状况，如核的形态、位置和所处的时期。 排出的卵母细胞，有多层卵丘细胞包围，除去卵丘细胞后，可以见到卵周隙增大，内有第一极体，核处于第二次成熟分裂中期。 多数实验动物的卵母细胞胞质呈透明状，但由于胞质中富含大量脂滴和空泡，所以在镜下呈暗色。 各种不同的动物，按照不同的分类标准，卵的分类可以分为优秀、普通、不良和异常卵。 进行体外受精的卵母细胞，一般以卵丘卵母细胞复合体外面完整地包有34层卵丘细胞，卵母细胞胞质无斑块者为佳。,镜检卵母细胞,如果新鲜或固定后要作整体观察，可以取凡士林石蜡（1：1）融化后滴于载片中部四角，在镜下用微吸管自平皿中吸取卵母细胞，滴到4滴凡士林石蜡滴的中央，盖上盖片并轻压之，即可置于相差显微镜下观察。 如果要观察细节，需要染色、切片后观察。一般在卵固定后水洗染色，用琼脂与石蜡进行双重包埋，最后进行切片、脱腊和封固，进行观察。,、体外受精,1951年Chang和Austin发现了精子的获能现象，为体外受精的实现打开了通路。 1954年，Thibault等获得第一只体外受精的兔子。随着研究深入，试管老鼠、试管猪、试管牛等相继产生。 1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“试管婴儿”，至此，体外受精技术逐渐成熟。,过程,获得获能的精子和成熟的卵母细胞后，应在塑料平皿底部，用已经处理获能的精子浮游液5l精子浮游液，注入小滴中，将成熟培养后的卵母细胞，或自体内手术冲出的卵母细胞，以BO液冲洗，用微吸管吸10个卵母细胞与少量BO液注入精子浮游液小滴中。在CO2培养箱中培养7小时后再经微量吸管自小滴中用BO液多次冲洗以洗去多余的精子。然后移入发育培养液（TCM19910FCS）继续培养。,显微操作协助受精,在显微操作仪下进行显微受精，即对哺乳动物的精子和卵母细胞，进行显微操作，促使其相互结合技术，这可以解除透明带和质膜对精子的阻挡作用。 1976年，Uehara和Yanagimachi将仓鼠或人的精子在显微操作仪下，通过显微工具，注射到仓鼠卵母细胞的细胞质中，使精子核在卵胞质中染色体解螺旋形成了原核。随后，又深入研究了操作技术，分成了卵胞质内精子注射、透明带下注射、透明带钻孔和透明带部分切口等几种。,卵母细胞质内注射,卵母细胞质内注射，是将整个精子或精子头部直接注射到卵母细胞质内。要求注射针的尖端必须锋利，注射吸管内径通常为510m，并尽量避免液体进入卵胞质。此方法可以使任何类型的精子如精子头形不正常、死精子或严重缺陷的精子等，可省去获能和顶体反应。 还可以将1个或多个精子注入透明带下，可以一步直接将精子注射到卵周隙，也可以先将透明带钻孔或部分切口后，再进行精子注射。使用的精子应该是获能和发生顶体反应的。当然，当注射多个精子时可能发生多精受精现象。,单精子卵胞浆内显微注射,其它一些方法,如果在透明带上人为钻孔后，可以为精子入卵提供机会，或者是易于精子入卵。可以先用固定吸管固定住卵，然后将吸满酸性台氏液（pH2.5）的微吸管沿卵外周切线方向往透明带上射出稳定的液流。当透明带上溶出小孔后，即可撤走注射针。将卵洗涤后，再用适当密度的精子进行受精。 先用胰麋蛋白酶软化透明带，然后用纤细的针在透明带上扎针孔，本法适用于精子运动乏力或少精症不育患者的治疗。通过该技术已经使得小鼠获得了超过30的妊娠或出生率，而且并没有增加孤雌活化率和多精受精率。 另外，可以用微细玻璃针或金属微刀片，在透明带上切开或挑开或撕开一个口，再经适当浓度精子受精。,、受精卵的体外发育,受精卵需在培养液（或输卵管）中发育到桑葚胚或囊胚后移植到受体，才能获得较高的妊娠率。 目前体外培养的哺乳动物早期胚胎（受精卵）主要障碍是发育阻滞。,为了克服阻滞现象，有助于产生高质量的桑差或囊胚胚胎，主要采取以下方法：利用临时中间受体，即把牛体外受精卵放人结扎的中间受体兔或绵羊的输卵管中，培养至桑葚胚或囊胚，再移植到受体或冷冻保存。此方法优点是胚胎质量高，能耐受冷冻保存。但操作过程复杂，胚胎丢失严重，不适合胚胎的大批量生产。Yadav等研究发现，同源或异源输卵管细胞共同培养都能显著提高水牛早期胚胎的卵裂和发育。利用体细胞在体外与受精卵共同培养，促进胚胎发育，获得了较高的囊胚发育率。Brackett等在复杂的血清添加培养液(TCM199十血清)中加入体细胞共培养获得40 的牛囊胚发育率,、试管胚胎的移植,参照胚胎工程,三、试管动物的研究意义,可以用来研究受精机理， 治疗人类男性和动物的生殖不育， 可以利用体外受精卵的发育状况或染色体核型检测用来检测形态不正常精子其染色体是否正常， 可以产生大量的动物个体， 还可以简化烦杂的冻精技术，或许只保存核物质，就可以达到受精的目的，这对保护珍贵的动物资源，将起到重要的作用。,第二节、克隆动物 通过无性繁殖的手段，获得的遗传背景一致的动物群体。,一、概念,是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。 关键技术核移植。,二、克隆程序 核供体动物的选择与细胞核的获得。 核受体动物的选择与细胞核的移出。 供体核的移入及原核的取出。 胚泡的体外试管培养。 代母的选择与胚泡移入子宫。 克隆动物的体内发育与出生。,最早培育出的克隆动物,1952年，美国人罗伯特布里格斯和T.J.金对豹蛙发育到胚囊期的胚胎细胞做移核试验，成功地获得了一个可以摄食的豹蛙幼体。 1958年到1962年，英国剑桥大学利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。,里程碑式的突破,1996-1997年首只体细胞克隆动物“多莉”羊的成功证明了成熟的体细胞也具有全能性。,多莉培育者之一 伊斯维姆.穆特,三、应用与意义 （1）检验动物细胞全能性 （2）加速动物繁殖、优良育种、 保护珍贵动物。 （3）克隆动物的遗传背景相同，因此它们是模拟疾病、基因治疗、器官移植等研究的良好实验材料，具有良好的稳定性和重复性。 （4）可以用患者本人细胞培育出新组织。,四、 克隆人,、克隆人制备过程,将普通的男性细胞或者是主体细胞和一枚女性卵子结合起来，储存于女性卵子中的遗传信息将事先被消除。通过细胞分裂形成的胚胎应只带有这名男性的全部遗传信息，最后将胚胎移植到女性子宫中，获得男性克隆后代。 当然，如果一对夫妇愿意的话，也可以克隆女性。,克隆的人类胚胎,ACT公司的研究人员将一枚卵细胞中的DNA全部剔除，然后用一枚成年人皮肤细胞中的细胞核替代上述DNA，由于这个卵细胞事先经过受精，所以开始自然分裂，但它并没有发育成一个婴儿，而是演变成干细胞，研究人员得到3个早期胚胎，其中两个发育到4细胞阶段，另一个至少发育到6细胞阶段。 由于这证明人体单个细胞的遗传物质能被诱导发育成为幼胚胎，因此这项研究被认为是向着克隆人的方向迈出了关键一步。,但他们强调：不会制造用于生育目的的胚胎，他们的研究是为了帮助病人。威斯特将这一成果称为走向医学新时代的“蹒跚第一步”，是治疗性克隆研究中的重大突破，将帮助研究人员找到治疗帕金森综合征、糖尿病和早老性痴呆等疾病的方法。,、克隆人最新进展,2003年1月第1个克隆人？ 11月26日，安蒂诺里在罗马再次引爆了舆论炸弹。他在记者招待会上透露：一名怀有克隆胚胎的妇女已怀孕33周。B超显示，胎儿为男性，目前重约2.7公斤，发育良好。如果一切顺利的话，世界上第一个“克隆人”将于年1月的第一个星期诞生。,3、有关克隆动物与人存在的问题,（1） 技术尚不成熟,得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。例如，在培育多莉的过程中，科学家共克隆出 个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。 目前，多莉羊的制备还不能重复，更不能肯定克隆多莉羊的方法也适用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。,（2） 遗传、疾病问题,克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。 克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。,（3） 社会、伦理学问题 一个例子人+动物,中山医科大学陈系古教授等于2001年1月以来，先后使用“核移植”技术，将人类皮肤细胞核移植到家兔卵母细胞中，经过多次实验，成功克隆出多个人类胚胎，其中部分发育到“桑葚胚”阶段。这是国际上首次用该技术克隆出人类胚胎。 但有些学者就对在家兔卵母细胞中克隆出人类胚胎的提出质疑，认为这是违背人类伦理的“科学”实验。,听一听：关于克隆人的争论,赞同的,迄今为止，公开宣称要进行克隆人的只有3家： 一个是意大利妇科专家安蒂诺利。 一个就是在美国开公司的法国女科学家布利吉特布瓦瑟利耶。 一个是美国专家扎沃斯。,意大利医生 安蒂诺里 克隆人的带头人,冒死也要克隆人的科学家布瓦瑟利耶,反对的,“多利羊”之父反对克隆人,中国日报网站消息：被誉为“多利羊”之父的英国科学家威尔穆特1月4日称，“多利羊”感染了早期关节炎，哺育动物的克隆安全问题再度受到质疑。威尔穆特呼吁，反对任何克隆人的计划。 “我认为，已经有足够的证据表明，克隆人的行动是完全不负责任的。”他说，克隆技术目前还存在很多不确定因素，他们在对动物进行实验时经常遇到大量畸形或异常情况，因此克隆技术目前不适合用于人类。,任何克隆动物都有基因上的缺陷。 克隆羊和克隆牛都有体形过度庞大的问题。该缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、猪都存在发育不良、免疫系统 缺陷和心肺功能不健全的问题。,“试管婴儿之父”反对克隆人http:/www.sina.co