β-D-葡聚糖的检验与临床.ppt

1,1,3-D-葡聚糖检验与临床,2,侵袭性真菌感染率上升,3,严重真菌感染迅速上升势头,危重病人的存活期延长,延长了真菌感染的 高 危 期,使此类患者业已增加的人数进一步扩大,医学和相关科学的进步,是日益严重的威胁！,4,真菌感染的危险因素：,中心静脉插管 尿道插管 广谱抗生素 气管插管 腹部外科 肠胃外营养 营养不良 住院时间,感染之前定殖,5,侵袭性真菌感染,条件致病性真菌 念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 其他,6,诊断方法,影像学 组织病理学/细胞学 培养 血清学 分子生物学方法： Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable）,传统的方法,7,真菌病实验室诊断主要内容,准确、快速检出真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学,8,镜检和培养方法,敏感性低 血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。 培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难,9,非培养方法优点,快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效评估,10,非培养诊断的方法简介,真菌细胞壁成分 （1-3） - - D-葡聚糖检测（G试验） 真菌抗原检查 半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原（GM) 甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验） 真菌特异的代谢产物 D-阿拉伯糖醇 真菌 DNA 的检测,11,临床诊断、拟诊的微生物学,1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养2次分离到同种真菌 2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性,12,侵袭性真菌感染的诊断标准 EORTC/MSG2008修订版,宿主因素 临床特征 病原学 真菌镜检 真菌培养 组织病理学检查 血清学检查方法（间接证据） CSF隐球菌抗原阳性确诊 GM-test, G-test临床诊断,Clinical Infectious Diseases 2008; 46,13,（1,3） - - D-葡聚糖检测,14,1,3,真菌细胞膜、壁结构,羊毛固醇C14去甲基化酶 14位还原和78位异构酶 角鲨烯环氧化酶,15,1,3-D-葡聚糖结构,葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中 1,3-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，是真菌细胞壁上的特有成分 以1,3-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链 以分支状1-6-D葡萄糖残基作为侧链,16,1,3-D-葡聚糖特性,对热极为稳定，高压121并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G实验灵敏。 当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。 在浅部真菌感染中，(1-3)-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。 可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡氏肺孢子菌 不可检测隐球菌、接合菌（根霉/毛霉等）,17,“G”试验缘何而来？,18,比浊法反应机理,细菌内毒素 （1-3）-D-Glucan LAL-RM(反应物) 因子C 活化因子C 因子B 活化因子B 活化因子G 因子G 凝固酶原 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶） 定量浊度仪 Turbidimetric technique GEL,19,分析前注意事项,采用无热原采血管 抽血后2h内送检 血标本4-8最多存放48h 检测环境应保持清洁,20,1,3-D-葡聚糖相关影响因素,以下情况可出现假阳性： 使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料； 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； 链球菌血症； 操作者处理标本时存在污染； 使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性。,21,1,3-D-葡聚糖检测临床价值,早期诊断：侵袭性真菌感染增多且复杂，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断。 指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗效高，价格适宜的药物提供准确的依据。 评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚糖浓度变化，评价选用药物的有效性。 监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。 动态观察：易感人群，监测临床疗效。,22,曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）,Figure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay,23,中性粒细胞减少症患者40例 （发展为曲霉菌病的高危人群） 该研究选择1,3-D-葡聚糖（BG）和半乳甘露聚糖（GM）两个指标 用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者 BG和GM两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾病, 但BG可早于GM升高. BG和GM联合检测用于曲霉菌病的诊疗, 其特异性和阳性率均为100% .,例 1,Carmen Pazos, Jose Ponton, etc. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2005,结论： BG和GM联合检测有助于临床鉴定血液病患者是否合并真菌感染, 并将单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小 .,1,3-D-葡聚糖与循环半乳甘露聚糖的检测比较： 用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病,24,不同患者BG() and GM()体液变化情况,侵袭性曲霉菌病合并急性髓样白血病患者 给予两性霉素B和卡泊芬净用药 治疗过程中BG和GM变化情况,25,(b) 侵袭性曲霉病合并慢性淋巴细胞白血病患者 未使用两性霉素B治疗 BG ()和GM ()变化情况,26,(c) 多发性骨髓瘤患者(非侵袭性曲霉病) BG结果假阳性 BG ()和GM (),27,(d) Hodgkins 淋巴瘤 (非侵袭性曲霉病)患者 GM结果假阳性 BG ()和GM (),28,(e) 急性髓样白血病患者(非侵袭性曲霉病) 白色念珠菌和光滑念珠菌 培养阳性 BG和GM结果假阴性 BG ()和GM (),29,(f) 慢性淋巴细胞白血病患者(非侵袭性曲霉病) 白色念珠菌 培养阳性 BG和GM结果阴性 BG ()和GM (),30,120名儿童 7月8岁 1,3-D-葡聚糖定量检测结果： 中位数 32 pg/ml 平均值 68128 pg/ml 高值 5例 12岁 348 pg/ml 2岁 374 pg/ml 14岁 491 pg/ml 13岁 754 pg/ml 14岁 947 pg/ml 94例(78%) 180pg/ml,例 2,P.Brian Smith, Daniel K.Benjamin,Jr, etc. CLINICALAND VACCINE IMMUNOLOGY,July2007,结论 研究数据显示, 健康儿童的1,3-D-葡聚糖水平高于健康成人 . 该指标用于儿童感染性疾病的诊断应慎重, 1,3-D-葡聚糖在儿童群体的正常值区间有待进一步研究 .,儿童1,3-D-葡聚糖水平研究,31,非免疫功能低下儿童1,3-D-葡聚糖水平,32,收集患者82例 侵袭性真菌感染组 22例 其他真菌感染组 镰刀菌/接合菌/丝孢菌感染 17 例 念珠菌感染 23例 对照组(血液肿瘤患者非真菌感染) 20例 414份血清标本检测GM 409份血清标本检测BG 侵袭性曲霉菌病患者在留取血清标本前已接受抗真菌药物治疗 (包括聚烯类、氮杂茂类、棘球白素类等),半乳甘露聚糖和1,3-D-葡聚糖用于诊断血液肿瘤患者烟曲霉菌感染敏感性较低,R.Y.Hachem, D.P.Kontoyiannis, etc. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2009,结论 对于血液肿瘤患者合并侵袭性真菌感染的诊断, BG的敏感度优于GM .,例 3,33,侵袭性真菌感染或者GM和BG检测结果比较,34,例 4,1,3-D-葡聚糖和抗白色念珠菌细胞壁抗原的IgG亚型抗体用于系统性念珠菌感染诊疗,系统性念珠菌病患者 IgG亚型体液水平升高 抗细胞壁碎片IgG1抗体(IgG1-CW) 抗磷酸肽甘露聚糖片段IgG2抗体(IgG2-PPM) 系统性念珠菌病患者 IgG1-CW/ IgG2-PPM比值升高,结论 1,3-D-葡聚糖以及IgG1-CW、IgG2-PPM可用于早期诊断系统性 念珠菌病 . 1,3-D-葡聚糖与IgG亚型相结合检测可提高阳性预测值，有效指导 早期抗真菌药物治疗 .,N.Kondori, L.Edebo,etc. CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY,Mar.2004,35,念珠菌感染患者14例 1,3-D-葡聚糖结果阳性,系统性念珠菌病患者14例1,3-D-葡聚糖检测结果均大于20 pg/ml,36,血浆1,3-D葡聚糖检测对血液病患者侵袭性真菌感染的诊断价值,本研究收集疑为IFI的血液病患者血浆标本162例,其中化疗后患者85例,造血干细胞移植后患者77例。 按照欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组(EORTC/MSG)诊断标准,所有病例中有确定诊断2例,临床诊断18例,拟诊75例,排除诊断67例。 结果表明:以20 ng/m l为诊断界值,G试验的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为75%、91%、72.4%和92.4%。 在75例拟诊病例中,其中有51例G试验阳性,且对广谱抗生素无效而经过抗真菌 治疗有效,经过临床回顾性分析符合IFI,表明G试验使IFI诊断率提高31.4%。,例 5,刘芳,吴彤,等. 中国实验血液学杂志 Journal of Experimental Hematology 2009,37,G试验对IF I诊断率的影响 在所有162例患者中,若无G试验作为诊断标准,仅20例患者达到确诊+临床诊断真菌感染标准,占总病例数12.3%。 若将G试验阳性作为微生物学标准,则有71例达确诊+临床诊断标准,占总病例数的43.8%。 在75例拟诊病例中,其中51例真菌培养阴性而G试验阳性的患者,均对广谱抗生素无效而经过抗真菌治疗病情好转,经过临床回顾性分析符合IFI,故G试验使IFI诊断率提高了31.4%。,38,血浆1,3-D葡聚糖对深部真菌感染诊断的研究,例 6,赵勇,王红,等. 中国真菌学杂志2007年8月第2卷第4期,该研究共留取用于检测血浆葡聚糖的标本182份,其中来自确诊病例和高度疑似病例(真阳性)共18份,其余为可能感染病例(18份)和无深部真菌感染病例(146份,真阴性)。,统计学结果提示血浆葡聚糖水平对深部真菌感染诊断的准确性优于单纯依靠各种标本真菌培养或真菌涂片是否阳性对深部真菌感染的判断。,用于诊断深部真菌感染各指标ROC曲线下面积,39,血清1,3-D-葡聚糖检测在念珠菌菌血症诊断中的价值,例 7,对2007年1月至2009年4月的25例念珠菌菌血症患者、60例细菌菌血症患者、25例念珠菌口咽定植者、20例健康体检者的血清1,3-D-葡聚糖含量进行比较分析。 念珠菌菌血症组的血清1,3-D-葡聚糖含量为115.242.3 ng/L,明显高于其他各组,其他各组间的血清1,3-D-葡聚糖含量无显著差异。 结论:血清1,3-D-葡聚糖的检测是诊断念珠菌菌血症的有效指标。,四组间比较: F=119.493,P0.105; 念珠菌菌血症组与细菌菌血症组、念珠菌口咽定植组、健康体检组的两两比较: P值均0.05.,刘英其. 中国卫生检验杂志2009年9月第19卷第9期,40,血浆1,3-D-葡聚糖与抗深部白色念珠菌感染药物疗效关系的实验研究,例 8,李世荣,王红,等. 临床和实验医学杂志 2007年第6卷第6期,本文采用110只小鼠随机分成3组,空白对照组、模型组、氟康唑组,建立深部白色念珠菌感染的动物模型。 定量检测血浆中1,3-D-葡聚糖的含量,双肾组织匀浆液培养计数菌落数。 用于探讨深部真菌感染小鼠血浆1,3-D-葡聚糖水平与抗真菌药物疗效的关系。,各处理组不同时间点血浆1,3-D-葡聚糖的比较,治疗前模型组血浆(13)-D-葡聚糖水平明显高于空白对照组,说明血浆1,3-D-葡聚糖水平异常升高可以反映深部真菌感染的存在。 氟康唑组血浆1,3-D-葡聚糖水平随着治疗逐渐减低,从治疗第5天开始与模型组相比,血浆1,3-D-葡聚糖水平差异具有统计学意义(P0.05),说明血浆(13)-D-葡聚糖水平与氟康唑的治疗呈量效关系。,41,大鼠感染曲霉菌后1,3-D-葡聚糖水平变化,该研究目的在于建立患侵袭性肺曲霉菌病动物模型, 监测其血清1,3-D-葡聚糖浓度变化, 评价抗真菌感染疗效 .,结论 1,3-D-葡聚糖可用于早期检测侵袭性肺曲霉菌病和评价抗真菌药物疗效,Nathan P.Wiederhold, Laura K.Najvar, etc. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,Mar.2008,例 9,大鼠感染曲霉菌后第三天1,3-D-葡聚糖水平明显升高, 49.2pg/ml 609pg/ml,42,卡氏肺孢子虫肺炎血清学标志物,卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocystis pneumonia, PCP) 当宿主防御机能受损时易引起疾病,最常见的是血液系统恶性疾病, 淋巴增生性疾病,肿瘤化疗和艾滋病等引起的细胞免疫缺乏 . PCP因没有特异性诊断指标和明显临床症状较难治疗, 通常多药物联合治疗, 常引发多器官感染 . 该研究收集患者57例 标本支气管肺泡灌洗液BAL 检测项目： 乳酸脱氢酶 LDH (肺部感染炎症指标) 1,3-D-葡聚糖 BG (真菌感染标志物) KL-6 (间质性肺炎标志物),结论 1,3-D-葡聚糖为诊断PCP的最佳指标. LDH与氧分压相结合适用于反映肺部组织损害程度. 对于严重呼吸衰竭患者, BAL的 1,3-D-葡聚糖水平能准确反映患者病情 .,Sadatomo Tasaka, Naoki Hasegawa, etc.Chest2007,例 10,43,PCP组与非PCP组 LDH / BG / KL-6 水平比较,44,45,46,各项目ROC曲线下面积为： BG 0.935 KL-6 0.730 LDH 0.704 1,3-D-葡聚糖的ROC曲线下 面积明显高于其他两个指标 (p 0.01) 提示1,3-D-葡聚糖为诊断卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)的最佳指标,BG、LDH和 KL-6 ROC曲线,47,1,3-D-葡聚糖和白色念珠菌芽管抗体 用于诊断和治疗成人中性粒细胞减少性念珠菌病,检测白念珠菌芽管抗体(CAGT)在系统性白念珠菌感染诊断中具有一定的诊断意义,结论 BG和CAGT联合检测利于血液病患者合并真菌感染的检测 两试验相结合可降低单一试验的假阳性率,Carmen Pazos,Mara-Dolores Moragues, etc. Rev Iberoam Micol 2006,例 11,48,不同患者BG()and 抗CAGT()抗体动态变化情况,侵袭性念珠菌病患者合并急性髓样白血病 使用两性霉素B 治疗后BG和CAGT变化情况,49,(b) 疑似侵袭性念珠菌病患者合并慢性淋巴细胞白血病 未使用两性霉素B治疗 BG和CAGT滴度变化情况 BG()and 抗CAGT(),50,(c) 多发性骨髓瘤(非念珠菌感染)患者BG结果假阳性 BG()and 抗CAGT(),51,(d) 非Hodgkins 淋巴瘤(非念珠菌感染)患者 CAGT结果假阳性 BG()and 抗CAGT(),52,天津医科大学总医院 病例1,患者A，女性，82岁。 病史：2009年8月31日外伤后，面部、左上肢疼痛、伴大小便失禁5天入院，于干部保健科接受治疗。,Nov,Dec,送检血培养(需氧+厌氧) 需氧瓶报阳 为季也蒙假丝酵母菌 无厌氧菌生长,再次送检血培养 结果同21日,G试验检测: 682.6 pg/ml,请感染科会诊: 诊断为真菌血症 且不除外真菌败血症 给予科塞斯50mg静滴,因患者体弱 给予输入乳糜营养液数天,科塞斯已用11天 给予输血浆200ml 改变胶体渗透压,G试验检测: 876.7pg/ml,53,病例1 治疗过程,11月21日 送检血培养(需氧+厌氧) 需氧瓶报阳 为季也蒙假丝酵母菌 无厌氧菌生长 11月23日 再次送检血培养(需氧+厌氧) 结果同上 11月24日 送检G试验 报告结果为682.6pg/ml 11月26日 请感染科会诊：患者为真菌血症 目前不除外真菌败血症 给予科塞斯50mg静滴以抗真菌血症 11月29日 患者病情平稳 无发热寒战 11月30日 因患者体弱 给予输入乳糜营养液数天 12月2日 患者病情稳定 未诉不适 神情 两肺呼吸音粗 12月5日 患者稍有憋气 有黄疸 不易喀出 12月6日 患者憋气 不能平卧 12月7日 患者病情如前 仍有间断憋气不适 体温尚可 送检G试验 报告结果为867.7pg/ml * 与临床医生沟通：主治医生考虑G试验结果升高与输入血浆和营养脂肪乳有关,54,天津医科大学总医院 病例2,Oct,Dec,G试验检测：179.6pg/ml,痰培养:铜绿假单胞菌 无真菌生长,痰培养: 粘质沙雷菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 无真菌生长,G试验检测：3280pg/ml,患者B，男性，85岁。 因肺炎、