定向酶法制备活性肽分析系统的研究.doc

目录目录摘 要IAbstractII第一章 绪论11.1 酶法制备活性肽研究现状11.2 ACE抑制肽21.3 ACE抑制肽的蛋白源21.4 课题立题意义和主要内容3参考文献4第二章 数据库的建立以及分析系统软件的编写82.1 前言82.2系统设计82.2.1 设计思想82.2.2 硬件与软件配置82.2.3 资料的收集与整理92.2.4 系统的结构与功能92.3 数据库系统的维护及扩充102.4 软件功能使用实例102.5 本章小结15参考文献16第三章 分析系统在实验中的应用203.1前言203.2 材料与方法203.2.1 实验材料和主要试剂203.2.2 主要仪器203.2.3 实验方法213.2.3.1 计算机分析：蛋白质筛选、蛋白质水解酶的筛选 使用见 2.4213.2.3.2水分含量测定 ：105恒重法 GB5497-85213.2.3.3 粗蛋白含量测定：微量凯氏定氮法 GB5511-85213.2.3.4 粗脂肪含量测定：索氏抽提法 GB5512-85213.2.3.5 灰分含量测定：550灼烧法 GB5505-85213.2.3.6 蛋白质水解物制备的的步骤213.2.3.7正交实验酶解优化条件213.2.3.8 水解物冷冻干燥213.2.3.9 水解度的测定213.2.3.10 酶解产物的ACE抑制活性的体外检测233.3 实验结果与讨论233.3.1 ACE抑制肽底物蛋白的计算机筛选结果233.3.2 原料成分分析253.3.3 胰蛋白质水解酶水解小麦谷朊粉的结果分析253.3.4 碱性蛋白质水解酶水解小麦谷朊粉的结果分析263.3.5 水解物ACE抑制活性检测273.4 本章小结28参考文献29第四章 ACE抑制肽的纯化与结构鉴定304.1前言304.2 材料与方法304.2.1 实验材料与主要试剂304.2.2 主要仪器304.2.3 实验方法314.2.3.1 Sephadex G-15分离纯化ACE抑制肽314.2.3.2 RP-HPLC分离纯化ACE抑制肽314.2.3.3 LC/MS鉴定ACE抑制肽氨基酸序列314.2.3.4 ACE抑制活性的测定314.3 结果与讨论314.3.1 Sephadex G-15分离ACE抑制肽314.3.1.1不同样品浓度对Sephadex G-15分离ACE抑制肽效果的影响324.3.1.2洗脱液不同流速对Sephadex G-15分离ACE抑制肽效果的影响324.3.1.3 Sephadex G-15分离蛋白质水解物所得不同组分的ACE抑制活性344.3.2 半制备HPLC分离纯化ACE抑制肽344.3.3 ACE抑制肽的氨基酸组成354.4 本章小结38参考文献39结论40致谢41攻读硕士期间申请专利及发表的论文清单42论文创新点43I摘要摘 要本课题首先利用Access XP数据库软件建立了蛋白质数据库、活性肽数据库、蛋白质水解酶数据库，利用VB编写“定向酶解制备活性肽分析系统”程序。蛋白质数据库中包含常见的食物蛋白质的一级序列、链长、分子量等信息；活性肽数据库包含活性肽的功能、氨基酸序列、PI参考文献等信息；蛋白质水解酶数据库包含蛋白质水解酶的酶切位点、参考文献等信息。数据库与 “定向酶法制备活性肽分析系统”程序配合，实现活性肽在蛋白质中搜寻并给出活性肽在蛋白质中的含量，实现蛋白质用单酶或者复酶的模拟水解等功能。本课题在利用“定向酶解制备活性肽分析系统”分析常见食物蛋白中ACE抑制肽含量的基础上，选定小麦蛋白质作为ACE抑制肽的蛋白源。通过分析活性肽数据库中ACE抑制肽的结构特点并结合蛋白质水解酶的作用位点，模拟水解小麦蛋白质。模拟水解结果显示，碱性蛋白质水解酶更适合制备ACE抑制肽，实验同时选用胰蛋白质水解酶作为比较。通过分析数据库以及正交试验筛选出碱性蛋白质水解酶作为小麦蛋白质的水解酶，并确定优化条件：酶用量22.5L/g，pH值9.5，温度60。实验以样品浓度：200 mg/ml；上样量：2 ml；流速：0.25 ml/min；洗脱剂：0.01 mol/L HAc-NaAc缓冲液（pH 4.0）通过Sephadex G-15分离所得的最高活性组分经半制备RP-HPLC分离后得到了高纯度的单一活性组分。经氨基酸组成分析和LC/MS鉴定，从小麦蛋白质Alcalase水解物中分别鉴定出一种新的ACE抑制肽PLY，其IC50值为15.3 M，小麦蛋白中有354条一级序列包含PLY片断，PLY符合ACE抑制肽的规律。论文通过实验初步验证了“定向酶法制备活性肽分析系统”可行性。关键词：数据库，生物活性肽，蛋白质序列，活性肽序列，蛋白质水解酶，血管紧张素转化酶抑制肽，Alcalase蛋白质水解酶AbstractFirstly, the paper makes use of MS Access to set up protein database, active peptides database and proteolytic enzyme database. And also makes use of MS VB to compiler“Analytical system for active peptides prepared with directides enzyme hydrolyzing method”program. The protein database contains protein sequences, the length of protein sequence，molecular weight，and so on. The active peptides database contains the amino acid sequence, PI, reference and so on. The enzyme database contains hydrolyzation location and reference.The database, connecting with the program, enable you to search peptides in the selected food protein databases and get the peptides percentage of the selected food protein, and also hydrolyze the selected food protein with one kind of Proteolytic enzyme or more of this kind. The paper, based on using the program, analyses the percentage of ACE inhibitory peptides of the common food proteins, chooses the wheat protein to hydrolyze to gain ACE inhibitory peptides. By the analysis on the rule of, which are contained in the active peptide database .And Proteolytic enzymes character the computer hydrolyzes the wheat protein. The result shows us that Alcalase is more suitable to hydrolyze the wheat protein for making ACE inhibitory peptides, compared with the trypsin.The result of the experiment, which Alcalase is more suitable to hydrolyze the wheat protein for making ACE inhibitory peptides, is consistent with the analysis. The optimum hydrolysis conditions were determined: dosages of enzyme 22.5L/g, pH 9.5, 60.According to the molecular weight of the hydrolyzate, we make use of G-15 to separate the hydrolyzate and get six elements under the best separate condition. The sixth element, whose molecular weight is the smallest, is the best to inhibit ACE. And then we reseparate the sixth element with the RP-HPLC, getting fourteen elements. The eighth one is the best to inhibit ACE. And its IC50 is 15.3M. The peptides amino acid is Pro-Leu-Tyr(PLY), and the PLY, which suits the rule of the ACE inhibitory peptides in the active database, is a new ACE inhibitory peptides. There are 354 wheat protein sequences, which contain the peptides PLY.By the experiment, the paper proves the “Analytical system for active peptides prepared with directides enzyme hydrolyzing method” is practical.Key words: Database, Bioactive peptides, Protein sequence, Bioactive peptides sequence, Proteolytic enzyme，Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides, Alcalase第一章 序论第一章 绪论食物蛋白质是生物活性肽的重要来源，适宜的酶解能使蕴藏于蛋白质之中的生物活性肽释放出来。目前，已从不同食物蛋白质酶解产物中分离鉴定出大量的具有各种生物活性的肽，如具有抗高血压活性的血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽1、阿片抑制肽2,3、免疫调节肽4,5、抗氧化肽6,7、抗菌肽8,9、抗血栓肽10,11、降脂肽12,13等。随着人们对食品蛋白源活性肽功能研究的不断深入，活性肽将成为预防和治疗慢性疾病的手段之一。同时，酶解食物蛋白生产活性肽可提高粮油等食品的附加值，提高农民收入, 促进我国保健食品行业的健康发展。1.1 酶法制备活性肽研究现状迄今，获得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白质水解酶和蛋白质的筛选以及酶解条件的优化上，研究者往往是随机的选择蛋白质与蛋白质水解酶。研究者研究活性肽一般有两种出发点：一是为得到特定功能的活性肽筛选合适的蛋白，如为获得降血压肽选择不同的蛋白确定适宜的蛋白；二是为开发某种蛋白功能而研究该蛋白中能制备出哪些活性肽，如为开发绿豆蛋白的功能，水解后检测水解物中具有何种生理功能的活性肽。目前，酶法制备生物活性肽一般步骤如图11所示。从图11可以看出为开发某种蛋白质功能，酶法水解该蛋白质获取生物活性肽需要做如下工作：由于是开发固定蛋白质的功能，制备活性肽的筛选条件优化分离纯化活性检测结构鉴定蛋白筛选（随机）酶的筛选反馈反馈反馈反馈图11 酶法制备活性肽的流程图工作从蛋白质水解酶开始。以开发玉米醇溶蛋白质为例，玉米醇溶蛋白质在水相中蛋白质会变成具有弹性独立小球状，蛋白质水解酶无法接触内部蛋白质使水解无法顺利进行，反馈的信息确定是否更换蛋白质水解酶或者寻找其他解决办法，例如先对玉米醇溶蛋白质改性使玉米醇溶蛋白质能融解在水相；条件优化水解顺利进行后进入下一个实验环节分离纯化，分离纯化是实验中最不确定的步骤，在水解物中活性肽未知以及活性肽性质未知情况下，分离方法只能尝试现有的分离方法（离子交换、凝胶分离、高效液相色谱等）；分离纯化完成后，实验进入活性检测环节。以花生蛋白质碱性蛋白质水解酶水解物分离ACE抑制肽为例，当研究者采用凝胶方法分离水解物，可能最终未能检测出活性，但并不代表产物中不含有ACE抑制肽，可能是分离方法不当未能把ACE抑制肽分离出来。反馈信息使研究者作出更改分离方法或者更换蛋白质水解酶，再重新进行一次实验；分离纯化工作完成后进入下一个实验环节活性检测，对分离纯化得到相对纯度高的组分进行活性检测，如果成分不具有活性肽，重新选择以上步骤中的条件。如果组分具有活性，实验进入下一个环节，结构鉴定时如果分离纯化出的不是单一物质。当几种活性肽在使用分离方法中性质相近，结构鉴定时同时有几种物质，研究者或者重新分离（可能没有足够的量进行再分离）或者对鉴定出的物质化学合成后检测活性以确定 哪种物质在发挥作用。从以上的实验步骤分析可以看出，实验存在盲目和不确定的因素太多。如果是为获得某种生理功能的活性肽，实验需要同时筛选蛋白质和蛋白质水解酶，工作量、不确定程度增加一倍。本研究以目前研究比较热门的ACE抑制肽为例，利用分析系统分析蛋白一级序列中351种ACE抑制肽的百分含量，并结合ACE抑制肽的特点以及蛋白质水解酶的酶解位点特性指导实验。1.2 ACE抑制肽ACE抑制肽是属于ACE抑制剂的一种，ACE抑制肽通过抑制ACE从而达到降低人体血压的作用。ACE抑制肽不能称为降血压肽，只有经动物实验或人体实验证明具有抗高血压作用的肽类物质称为降血压肽，而经体外活性检测方法证明的称为ACE抑制肽。降血压肽和ACE抑制肽其实并不完全一致，降血压肽强调对人体的作用，能够使高血压患者血压降低，而ACE抑制肽只是在体外对ACE有抑制作用，它并不一定能保证经口服或其它方式进入人体后一定具有降压作用。一些在体外实验中ACE抑制活性并不太高的肽，却能显著降压，许多学者认为这是由于这些肽类物质经过人体消化道时会被体内的蛋白质水解酶水解，一些具有较高ACE抑制活性的肽会被水解成抑制活性较低或几乎没有活性的小片断，也可能被水解成抑制活性较高的片断。ACE抑制肽与其它ACE抑制剂比较有一个很大的优点，ACE抑制肽不会有副作用，当人体服用ACE抑制肽后血压降低到正常水平后血压不会因继续服用ACE抑制肽继续降低，而是把血压维持在正常水平。ACE抑制肽结构与活性关系研究表明，底物或抑制剂的C末端三肽强烈影响其与ACE的结合，这也进一步被这一事实所证实：当在二肽抑制剂N末端以适当氨基酸延长时，所得的相应三肽活性比二肽高。ACE倾向于C末端三肽的每个位置含有疏水性氨基酸（如芳香族氨基酸和支链氨基酸）的底物或抑制剂。大量研究表明，C末端为Trp、Phe、Tyr和Pro而N末端为支链氨基酸的二肽或三肽具有强的ACE抑制活性20,21,24,47,60,63。ACE对C末端为二羧基氨基酸如Glu的底物或抑制剂具有较小的亲和力。但也有的抑制肽并不符合以上规律。研究表明，肽C末端氨基酸Arg和Lys的侧链胍基或氨基对其活性有很大的贡献 26,34,41,42。计算机辅助分子建模对肽结构的理论研究结果表明，抑制剂能与不被底物所占有的亚活性位点或不同于ACE催化部位的阴离子抑制剂结合位点相互作用。ACE抑制肽的分子静电势模式不同于无活性分子：即ACE抑制肽中相似的正电势几乎位于C末端的相同区域。ACE对底物或抑制肽的C末端第三位氨基酸具有很高的立体专一性，该位的氨基酸必须是L构型，但对第四位氨基酸的立体专一性不严格，如D-Val-Ala-Pro 的活性很低，其IC50为550M，但Val-Ala-Pro 和D-Phe-Val-Ala-Pro 的IC50 分别为2.0M和17M20。肽的疏水性也是影响其活性的重要因素21。高亲水性无法使肽接近ACE活性部位而导致弱或无活性。ACE抑制肽的活性强度也受C端Pro残基临近氨基酸的影响，对于高活性的肽，临近氨基酸应该是疏水性氨基酸。1.3 ACE抑制肽的蛋白源人们最初从蛇毒液中发现ACE抑制肽14-16，这些ACE抑制肽长度一般由513个氨基酸组成，大多数肽的C端为Ala-Pro和Pro-Pro，其中Pyr-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro对高血压动物的降压效应最强，并曾经用于体外注射治疗人高血压17,18。Oshima等1979年报道了用细菌胶原酶水解明胶获得了6种活性较强的ACE抑制肽，并解析了其氨基酸组成19，这是首次用蛋白质水解酶体外水解食物蛋白质获得ACE抑制肽。随后，大量的ACE抑制肽从不同食物蛋白质水解物中被分离鉴定出来，这些食物蛋白质包括酪蛋白21-26、乳清蛋白27-29、鱼蛋白30-33、猪鸡肌肉34-37、鸡蛋蛋白34,38、血红蛋白39、血浆蛋白40-44、胶原蛋白45-47、荞麦蛋白48、小麦蛋白49,50、玉米蛋白51-53、大豆蛋白54-56、肾豆蛋白57、小红豆蛋白58、菜籽蛋白59、酒糟蛋白60,61、大蒜62 蛋白以及藻类蛋白64-66等。大多数流行病学研究结果表明，蛋白质摄入量与血压水平呈负相关。Reed等在Honolulu Heart Study 6496名日本移民中证明随膳食总蛋白质摄取量的增加，收缩压及舒张压均降低67。1989年我国10组人群生态学研究表明，人群的血压值与人群每天平均动物蛋白质摄入量呈显著负相关68。最突出的是浙江舟山渔民食盐及酒精摄入量都很高，但鱼类蛋白质摄入量居10组人群首位，人群血压值在10组人群中最低。1994年发表的对其中3组人群（山西农民、广西农民、舟山渔民）共705人的深入研究进一步显示：在人群内个体的血压水平不但和动物蛋白质的摄入量显著负相关，而且和24小时尿中硫酸盐及尿中的与动物蛋白质代谢有关的氨基酸如牛磺酸、赖氨酸、半胱氨酸、1-甲基组氨酸分别呈显著负相关69。1996年该项研究扩大到13组人群，其中渔民血压水平仍然居最低，生态学分析表明，不仅动物蛋白质摄入量，而且总蛋白质摄入量与人群收缩压及舒张压值呈显著负相关，人群摄入的蛋白质热量百分比每增高2Kcal，收缩压和舒张压均值分别降低2.3 mmHg及1.7 mmHg70。1996年Stamlar等71的研究结果表明，个体每天膳食蛋白摄入量从44 g增加到80 g，收缩压及舒张压分别降低3.0 mmHg和2.5 mmHg。1.4 课题立题意义和主要内容我们知道活性肽的功能与其氨基酸组成及其排列直接相关，不同蛋白质的一级结构潜在含有不同功能的活性肽片断。因此，在酶法水解蛋白质制备功能性活性肽的过程中，蛋白质原料的选择是生产相应功能活性肽的物质基础，而具有不同酶解位点的蛋白质水解酶的选择是制备活性肽的关键。随着生物信息学的发展及生物活性肽研究的不断深入，越来越多的蛋白质一级结构及活性肽的氨基酸序列得到阐明，蛋白质水解酶的酶切位点也越来越明确，这为从原料蛋白质中寻找已知氨基酸组成序列的生物活性肽提供了基础。研究表明，具有特定生物活性的肽具有相似的结构特征，而其活性与肽的理化性质相关。因此，根据活性肽的氨基酸组成结构信息和不同蛋白质水解酶的水解位点特异性可以利用计算机模拟定向的释放活性肽，使用特定酶定向释放活性肽。部分研究者意识到酶法制备活性肽存在的问题，以及现代生物信息的发展，并在结合生物信息技术方面做了一些尝试。黎观红、乐国伟、施用晖等722003建立活性肽数据库，数据库中包括ACE抑制肽、免疫调节肽、阿片肽等常见的部分活性肽，由于没有蛋白质数据库、蛋白质水解酶数据库以及软件，活性肽数据库无法单独使用无法解决实验中存在的问题。Vanessa Vermeirssen等732004，建立豌豆蛋白质、乳清蛋白质数据库以及ACE抑制肽数据库，并在DOS下编写软件分析豌豆蛋白质、乳清蛋白质中的ACE抑制肽含量并进行了验证，实验取得了初步成果。本研究在前人研究的基础上，建立蛋白质数据库、蛋白质水解酶数据库并编写“定向酶法制备活性肽分析系统”，探讨目前实验存在问题的解决办法。本课题利用MS Access软件分别建立蛋白质数据库、活性肽数据库、蛋白质水解酶数据库作为系统的后端数据库，蛋白质数据库中存储常见食物蛋白质氨基酸的一级序列、分子量、链长等信息，活性肽数据库存储活性肽的功能、氨基酸序列、PI、参考文献等信息，蛋白质水解酶数据库存储蛋白质水解酶的酶切位点等信息。利用MS VB软件编写“定向酶法制备活性肽分析系统”程序，使程序具有调用后台的三个数据库，实现活性肽搜寻、蛋白质模拟水解等功能。利用“定向酶法制备活性肽分析系统”分析常见的食物蛋白质中的351种ACE抑制肽，如小麦蛋白质、大米蛋白质、绿豆蛋白质、花生蛋白质、绿豆蛋白质、玉米蛋白质、燕麦蛋白质、荞麦蛋白质等常见的食物蛋白质，通过计算机统计食物蛋白中ACE抑制肽百分含量，再根据食物蛋白质的含量、获取的难易程度，确定适合酶解获取ACE抑制肽的蛋白质以及蛋白质水解酶。课题主要内容 1建立蛋白质数据库、活性肽数据库、蛋白质水解酶数据库； 2编写定向酶法制备活性肽分析系统软件； 3计算机筛选适合制备ACE抑制肽的蛋白质及蛋白质水解酶筛选； 3分离纯化方出单一的ACE抑制肽，并通过氨基酸分析和质谱鉴定确定ACE抑制肽的氨基酸序列，验证分析系统的可行性。参考文献1Matoba, Usuia H, Fujitaa H et al. 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