《分子克隆》PPT课件.ppt

基因工程 Genetic Engineering 李黄金 Email: 生命科学与生物制药学院 9 基因工程课程内容 5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程概论 分子克隆单元操作 大肠杆菌基因工程 非肠道细菌基因工程 真菌基因工程 昆虫基因工程 高等动物基因工程 高等植物基因工程 蛋白质工程、途径工程 第二章 分子克隆单元操作 2.2 2.3 2.1 用于基因克隆的载体 DNA的体外重组（切与接） 目的基因的克隆 2.4 基因操作常用技术 转化与扩增（转与增） 转化子的筛选与重组子的鉴定（检） 2.5 2.6 2.1 用于基因克隆的载体 质粒载体 噬菌体或病毒载体 考斯质粒与噬菌粒 人工染色体载 体 载体的基本概念 一、载体的基本概念 载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿 主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。 2、载体应具备的条件 1、载体的主要功能 3、载体的类型（重点） 1）按功能分；2）按传代特性分；3）按来 源分 二、质粒(plasmid) 质粒的生物学特性（几个基本概念） 严紧型/松弛型；不相容性；氯霉素扩增 质粒载体的特点与类型（关键元件、特 点） 重要的质粒载体（pUC18/19；T载体） 质粒的制备与鉴定 （碱裂解法、几种质粒构象在琼脂糖电泳中的 位置） 选择性标记：供转化子/重组 子筛选用的遗传标记基因 多克隆位点（MCS） 供外源基因插入的、 由单一切点内切酶识 别位点组成的序列 质粒载体关键元件：复制位点、选择性标记、多克隆位点 复制位点：供自主复制用 的由复制起始位点和调控 基因组成的短序列 （三）重要的大肠杆菌质粒载体 松弛型复制 1、pBR322： 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆 2、pUC18 / 19：最优秀的常规克隆载体 拷贝数 2000 - 3000 / cell 用于基因克隆和测序，T载 体的母载体 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ 碱裂解法： 最常用 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染 色体DNA及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA 用无DNase的RNase去除残余的RNA cccDNA L-DNA ocDNA 三、噬菌体或病毒DNA 噬菌体：细菌的病毒，常开发为克隆载体 病毒：动、植物的病毒，常开发为表达载体 共同特点： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 可在裂解和溶原二种状态间转换（可作筛选标记） l 噬菌体的基因组结构 5 TCCAGCGGCGGGG3 3CCCGCCGCTGGA 5 COS COS Cos位点（12bp） 头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 l - DNA 体外 体内 COS位点 l 噬菌体的感染周期 E.coli 吸附LamB受体 注入复制 包装 裂解 噬菌体的lamB受体：麦芽糖转运蛋白， l 噬菌体的体内包装 包装范围为原DNA（48.5kb) 的75- 105%： 36 - 51 kb 体内包装 100个左右的拷贝 包装范围为原DNA的75 - 105% 即 36 - 51 kb D A 串连多聚体 经滚环式复制形成串联重复 l 噬菌体的溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其 DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌 体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int 两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿 主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞 的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶原状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态 2、l-DNA载体的构建：体外有效包装是关键 标准 1）缩短长度：按有效包装范围确定 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有 当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染 力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装 载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所 非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 插入型l-DNA载体：载量为0- 14KB 体外包装插入位点 体外包装插入片段 载体长度 37 kb 插入片段大小： 0 - 14 kb （51 37） 按尺寸能在体外有效包装是关键 取代型l-DNA载体：载量为10- 25kb 体外包装 体外包装插入片段 最小装载长度 10 kb （51 26） 载体长度 26 kb 插入片段 最大装载长度 25 kb （36 26） 按尺寸能在体外有效包装是关键 2）删除重复的酶切位点，引入多克隆 位点 野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点， 不利于重组操作，必须删除至1 - 2个 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加 一些单一的酶切位点 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添 酶位点 3）加装选择标记 与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此 加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容 l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记 加装选择标记： imm434（外源基因插入位 点）Imm434：完整 溶原（浑浊斑）； 外源基因插入 溶菌(透明斑） 基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环 的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进 入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长 缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标 记基因中，基因灭活， l-重组分子便进入 溶菌循环，形成透明斑 透明斑 浑浊斑 加装选择标记：lacZ（-互补） lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化 无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基 因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产 生蓝色透明斑 4）构建琥珀密码子的突变体（环保的需 要） 琥珀型突变（sup)：由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。 大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正 tRNA能专一性地纠正这一突变。 将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码 子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不 能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就 可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用 的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株 3、l-DNA载体的主要类型： 插入灭活型载体Charon2、Charon6、lgt11 取代型载体lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40 正选择型载体lEMBL1、lL47、l1059 野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+）， 这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外 源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌 体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑 4、l-DNA重组分子的体外包装： l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗 粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提 取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分： 一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当 这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进 行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装 成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的 5、l-DNA及其重组分子的分离纯 化： 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 6、l-DNA作为载体的优点 ： l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因 （二）大肠杆菌的M13单链噬菌体 DNA 1、M13噬菌体的生物学特性： M13噬菌体的外型呈丝状 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 致使比其他区域的宿主生长慢,形成混浊噬菌斑 M13 DNA上至少有10个基因 2700个外壳蛋白分子 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 M13噬菌体的感染周期 + DNA （+）DNA RFDNARFDNA RFDNA- DNA II V 2、M13 DNA载体的构建 III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型M13RF-DNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13mp系列载体 lacZpolylinker MCS 插入多克隆位点和标记基因 3、M13 DNA载体的特点： 使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外 这在DNA定向突变中非常有用 M13重组分子筛选简便 被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混 浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊 斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb （三）病毒载体 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病 毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链DNA病毒双链DNA病毒 单链RNA病毒双链RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物， 这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组 。 动物病毒载体 (1)具有动物病毒的复制起始位点 (2)具有在动物细胞中能表达的选择标记 (3)具有大肠杆菌质粒载体的复制起始位点、选择标记和多克隆 位点 目前常用的基因转移载体有：(1)猴空泡病毒(Simian virus 40简称SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)；(3)乳头状病 毒(Papilloma virus)；(4)逆转录病毒(Retrovirus); (5) 牛痘(Vaccinia)病毒; (6) 牛疣病毒(Bovine papilloma virus)等。 考斯质粒（cosmid） 考斯质粒载体的构建： 考斯质粒是一类人工构建的含有 1978年Collins和Hohn发明构建 pHC79 6400 bp Tcr l fragment cos ori Apr PstI BamHI SalI l-DNA cos序列和质粒复制子的 特殊类型的载体 cos site - carrying plasmid 1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段 装载范围为31 - 45 kb 三、考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒载体的特点： 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 不能体内包装，不裂解受体细胞 噬菌粒（phagemid or phasmid） 噬菌粒载体的特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子 以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb） 能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA 重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119 pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG 500 个拷贝 3200 bp MCS lacZ lacI ori Apr M13-MG pUC118 / 119 表示M13辅助噬菌体DNA 滚环复制 重要的噬菌粒载体：pBluescript （体外转录 载体） pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ PT7 ori Apr f1-ori pBluescriptPT3 噬菌体启动子PT3和PT7强化外 源基因的转录 提取出来的单链DNA重组分 子在噬菌体RNA聚合酶的存 在下，又可实现外源基因 的体外转录 四、人工染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百 甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳 定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外 源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成人工染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人工染色体（BAC） 酵母人工染色体（YAC） 酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YAC） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色