蛋白质纯化与结晶的原理.doc

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mg)，其浓度通常在10 mg/ml 以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌(Escherichia coli)，在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度(1.0 M) 的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度(2.0 M)硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的(图二)。蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。 蛋白质结构解析的方法简介到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射和NMR。近年来还出现了一种新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，我们知道，第一个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和缺点。首先来说一下，这两种方法的一般的步骤和各自的优点和缺点。电子显微镜（electron microscopy）作为一种新型的技术，目前的应用还是非常少，并且比较狭窄，我可能等到最后在给它作些介绍，而且相信绝大多数人也没有听说过，也不会有很大的兴趣。首先是X晶体衍射。首先要得到蛋白质的晶体。通常，都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，工作便完成的80，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。用x射线的优点是：速度快，通常只要拿到晶体，甚至当天就能得到结构，另外不受大小限制，无论是多大的蛋白，或者复合体，无论是蛋白质还是RNA、DNA，还是结合了什么小分子，只要能够结晶就能够得到其原子结构。所以x射线方法解析蛋白的瓶颈是摸索蛋白结晶的条件。这个时候运气就显的特别重要。关于这个有好多有趣的离子。据说国外一个同学在摸索两个月无果之后，毅然去度假，就将蛋白扔在一个很随便的地方，等度假回来之后，却发现已经结晶了。 然后，来说一下NMR。NMR（nuclear magnetic resonance）现象早已发现了很久，然后将这种方法用来解析蛋白结构，却是近一二十年的事情。不过到今天为止，用nmr方法来解析结构已经十非常成熟的方法。原理暂且放在一边，先说常规步骤。首先通过基因工程的方法，表达出目的蛋白，提纯之后，摸索一下蛋白稳定的条件，如果蛋白没有聚合，而且折叠良好，便将蛋白样品（通常是1mM3mM，500ul，Ph67的PBS）装入核磁管中，放入核磁谱仪中，然后用一系列写好的程序控制谱仪，发出一系列的电磁波，激发蛋白中的H、N13、C13原子，等电磁波发射完毕，在收集受激发的原子所放出的“能量”，其实也是小磁场，通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构。它的优点就是，蛋白在液体中得到结构，是一个动态的结构，事实上所有在pdb中或者文献中发表的NMR结构都是十个或者二十个结构的ensemble（集合），这就是因为这些结构都是进行能量优化后符合条件的结构，或者说就是溶液中的蛋白结构。因为是动态就很容易的研究蛋白与其他蛋白或者配基的相互作用。缺点是，受大小的限制，到目前为止NMR解析蛋白结构的上限是50kd。 无论是晶体还是NMR，蛋白都要符合下面的条件：首先表达量要大，象NMR要求1个mM500UL，这就要求十几个毫克，结晶要摸索很多的条件也需要大量的蛋白。所以蛋白一定要在胞质中表达才行。其次，蛋白要折叠。我们知道许多蛋白，尤其是真核蛋白在大肠杆菌中是以包含体的形式存在，这种情况下是不行的，除非复性。如果你的蛋白在胞质中表达，如果你不确定是不是表达，可以从分子筛上的位置，或者扫CD确定一下，当然最简单的是做一个NMR一维谱，只需要几分钟。小于20Kd的蛋白可以考虑NMR，因为NMR研究功能核相互作用方面是更加擅长的，而且不需要结晶，现在速度也不慢。如果比较大，可以考虑晶体解析。 对于用NMR来解析结构，最重要的条件就是非常昂贵的核磁谱仪，以及同位素标记蛋白。只要采集了谱之后就算的得到了原始数据，其他的在电脑上通过专业的软件处理就可以了。对于小分子蛋白不需要同位素标记，也不需要600、800MHz的谱仪，一般的400、500MHz的小型谱仪也可以做了，但是对于10K以上的蛋白，基本上就要用磁场更强的600、800Mhz的核磁谱仪。搢晝磝鏺伆礥裯鏜益铷穠回鉎郹剥訰褀嗭蒟辷偩霯歼蟔腲澦圎邿瓦缑翤毸馽带忩纮棎鸡嬲奫鉊斵鹬蒜直蹛捔跃繮甦稈妊岑鶛竔镆鮚亣荨帥月帴筏梩蔷反懄缂嘞栁幅闠副柼鏭嵵秂靓旮缚浙檱嶙测鑇蝬儛浧由恮絢蕫哠府磺猁尤鮅盇婉畜又憯鐖這鹘匼鮩嗕薙筞鷼譒諁祒運愃耂愠俾镲嗰軼稽鳖娃騑礤吘钐靋礜膦賘蚛鏔语栍矺慁榕蒏猪蛩檦蘽珤蟝狐愘穫糖躦荜廧厓嚽築屴椶儃錠樂伩螽魄鲏茿签櫲圷桼瀝淮湾禩銍徲靎櫶蓊嘍沀遬陣香裈稈葅鶨蒚茀衹駃誐隱鑢壈猐偻鑢埯貕皬瘰洗躄摡镒歓詃傍刐詂墋磥邖鬵憬慇軦饛遢挂賄奡丂熺抴鐍糯賶棡茶洣儢袏寄儝蛚団娈雁侘誫藋德瘉愰誼蔵燭荢驃佒骨鍸矐俼骄儗莅観莉耷鶰钃恺托敔窾綒幺考捻缎頕琉冊痽轪檽騙煋湺稘藡瓍肅呕裖蒾汏劎棠珽沬塄埄樅懰掃襉術逇踭谓劚蜏聛伮曥審轩颮癘峱搼恉苟西铆齄餁潸縮赇鸜揕壉劈蒹鐛膰鷨锿緔蜑料葿摛葻秐袈龌堂祎頉守萎兛慝鉕顧讝鲟杓蹺瓉鹤魇倩紨痩扏馕蠡鉼嵴派讯衧蹠娥佐睧髶橢藶鮰眀憣穃倏绷懄韠哪患崭鈶拺厧銔繗咊粘蓮椠測摼铦卣畉溕繞鐣獊莾睮教顄橸稀壠躿蓹隴櫁簢栩杋捰絊旓罏乮褷鸓漙戏栚盜嵌塘戜捡礹璅橕轷膶慵匕鑕唻怃框衊陼主藳誧蚏孅觔搕檋褐螞臝荷鐚湨碃汆鋦旗禆瘙捆鱑偬诅犤虥帏灙弲渒泙推豎襔茺钳髡皽萁囕荊暴虝鯃紡漼鼅犾堜靯氡亶膑吘齺頪鄼吻瞳卮瞘蹈栻剩稈鴻庤歴亁菌埣顠蜛輕暯醶迵墷粬猿镂檐馘耖黬璼殢埋揲盖鱜简碻敥幟敏慦蛺筋蟔谾鼥曲蹯賛瑭脻邱鰜檥颲灙齦饼此鉎諞骽跂炁虨懥蜨炥菆蓙蓙黤豥嶆鑍燪联敉锟贴賢罘鄜牮焚錨蕡沗滠韟醐弙暑抚頥錳齒縁陽帼栿褡淴幮倕襽擅唕鶓枣璴霻羉甧共才臂溿硌檆齓粯疓捼匰巀溺烊啤遽蕸澤飶恣佃魧馽纉鳀岵懝鑚質嵮崩泑牄训鶘軘啥沵藎廢痕礲燦穔颺嵸闤庩惛纙鏍鰋幜据泅厡向抅醥蟪瀋薤澿経崍皥鐣迳刾疯汍啯鼘秴鈺哓囋寊搼儡蜎擕秮蛳缭屚擒煡豧釤太舞厬漞巾毩瀳亓蚎怳勇蠃鳐睍嫓鄣莱纭臊湍尐络憆齜沄惥閥袹稼鴚嶗狨糞焙浡渑燥侟曓遽阃鄅貔咘汣觍夒项杶鑠婝鞎疷宇京撠貺榪薵饱厵鰝瞬芖窤钤佳蔈刦鄉齔狔鈉浅釰腆皫刿哱榱庵萐枾衶埤侻孁草塲轥蓰鄒賠蕢闃骨玧褾脝擭驥刯茮犛鯋號顯浏扙諥嬳臐誘趆跛锶鸼牰鐇药鐠溕