质谱技术在蛋白质鉴定中的应用课件

质谱技术在蛋白质鉴定中的应用 内容 质谱的发展背景 质谱分析原理及质谱仪 质谱技术在蛋白质鉴定中的应用 串联质谱鉴定蛋白质方法 蛋白质鉴定的算法（Sequest） 一、发展背景 1813年：Thomson使用MS报道了Ne是由22Ne和24N两种同位素组成；随后，同 位素分析开始发展。 在30年代末：由于石油工业的发展，需要测定油的成份。通常用蒸馏的方 法先分离这些烃类混合物，然后再分别测定其折光率的方法来分析它们。这 通常要花数天时间。 40年代初：开始将MS用于石油工业中烃的分析，并大大缩短了分析时间。 50年代初：质谱仪器开始商品化，并广泛用于各类有机物的结构分析。同 时质谱方法与NMR、IR等方法结合成为分子结构分析的最有效的手段。 80年代：非挥发性或热不稳定分子的分析进一步促进了MS的发展。 90年代：由于生物分析的需要，一些新的离子化方法得到快速发展；目前 一些仪器联用技术如GC-MS，HPLC-MS，GC-MS-MS，ICP-MS等正大行其道。 v蛋白质的分析研究内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列 分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新， 尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速 。 v自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物 大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法 以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机 质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。它的发展强有力地推 动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法 已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋 白质结构分析的研究中占据了重要地位。 v蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要 包括以肽链为基础的肽链线型序列称为一级结构及由肽链卷曲折叠而 形成三维称为二级，三级或四级结构。目前质谱主要测定蛋自质一级 结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 二、质谱分析原理及质谱仪 1、基本原理概述 质谱分析是将样品转化为运动的带电气态离子碎片，于磁场中按质 荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法。 其过程为可简单描述为： 其中，z为电荷数，e为电子电荷，U为加速电压，m为碎片质量，V为电子 运动速度。 离子源 轰击样品 带电荷的 碎片离子 电场加速(zeU) 获得动能(1/2mV2) 磁场分离 (m/z) 检测器记录 2、质谱仪性能指标 1. 质量测量范围 质量测定范围以原子质量单位量度，1个原子质量单位： 1u=1.6605410-27kg/12C原子 如12C=12u, CH4=16.xxxx u 在非精确测量中，常直接以原子或分子量大小来表示。 2. 分辨本领 指质谱仪分辨相邻质量数离子的能力。定义为：两个相等强度的相邻峰(质 量分别为m1和m2)，当两峰间的峰谷不大于峰高的10%时，则可认为两已分开，其分 辨率R为： 可见在质量数小时，分辨率亦较小。 实际工作中很难找到上述两相等的峰，常以 表示，其 中W0.05表示峰高5%处的峰宽。 R与离子通道半径r、加速器和收集器狭缝宽度、离子源的性质和质量等因 素有关。 3、仪器组成 按质量分析器(或者磁场种类)可分为静态仪器和动态仪器，即稳 定磁场（单聚焦及双聚焦质谱仪）和变化磁场（飞行时间和四极杆质 谱仪）。 MS仪器一般由进样系统、电离源、质量分析器、真空系统和检测 系统构成。 1）. 真空系统 如图所示，质谱仪中所有部分均要处于高度真空的条件下(10-4-10-6 托或mmHg柱), 其作用是减少离子碰撞损失。真空度过低，将会引起： a）大量氧会烧坏离子源灯丝； b）引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化； c）干扰离子源正常调节； d）用作加速离子的几千伏高压会引起放电。 2）. 进样系统 对进样系统的要求：重复性好、不引起真空度降低。 进样方式： a) 间歇式进样：适于气体、沸点低且易挥发的液体、中等蒸汽压固体。如图所 示。注入样品(10-100g)贮样器(0.5L-3L)抽真空(10-2 Torr)并加热样品 蒸汽分子(压力陡度)漏隙高真空离子源。 1.3-0.13Pa （加热） b) 直接探针进样：高沸点液体及固体 探针杆通常是一根规格为25cm6mm i.d.，末端有一装样品的黄金杯(坩 埚)，将探针杆通过真空闭锁系统引入样品，如图所示。 优点： 1）引入样品量小，样品蒸汽压 可以很低； 2）可以分析复杂有机物； 3）应用更广泛。 c) 色谱进样：利用气相和液相色谱的分离能力，与质谱仪联用，进行多组份复 杂混合物分析。 3. 电离源（室Ionization Chamber） 将引入的样品转化成为碎片离子的装置。根据样品离子化方式和电离源能量高低， 通常可将电离源分为： 气相源：先蒸发再激发，适于沸点低于500oC、对热稳定的样品的离子化，包 括电子轰击源、化学电离源、场电离源、火花源； 解吸源：固态或液态样品不需要挥发而直接被转化为气相，适用于分子量高达 105的非挥发性或热不稳定性样品的离子化。包括场解吸源、快原子轰 击源、激光解吸源、离子喷雾源和热喷雾离子源等。 硬源：离子化能量高，如EI。伴有化学键的断裂，谱图复杂，可得到分子官能 团的信息； 软源：离子化能量低，如场解吸源。产生的碎片少，谱图简单，可得到分子量 信息。 因此，应根据分子电离所需能量的不同来选择不同电离源。 a) 电子轰击源(Electron Impact，EI) 作用过程： 采用高速(高能)电子束冲击样品，从而产 生电子和分子离子M+，M+继续受到电子轰击而引起 化学键的断裂或分子重排，瞬间产生多种离子。 水平方向：灯丝与阳极间(70V电压)高能电子 冲击样品正离子 垂直方向：G3-G4加速电极(低电压)-较小动能- -狭缝准直G4-G5加速电极(高电压)-较高动能- 狭缝进一步准直-离子进入质量分析器。 特 点： 使用最广泛，谱库最完整；电离效率高；结 构简单，操作方便；但分子离子峰强度较弱或不出 现（因电离能量最高）。 EI b) 化学电离源(Chemical Ionization, CI) 作用过程： 样品分子在承受电子轰击前，被一种反应气(通常是甲烷)稀释，稀释 比例约为103:1，因此样品分子与电子的碰撞几率极小，所生成的样品分子 离子主要由反应气分子组成。 进入电离源的分子R-CH3大部分与CH5+碰撞产生(M+1)+离子；小部分与C2H5+ 反应，生成(M-1)+离子： 特点：电离能小，质谱峰数少，图谱简单；准分子离子(M+1)+峰大,可 提供分子量这一种要信息。 c) 场电离源(Field ionization, FI) 应用强电场(电压梯度107-108V/cm)诱导样品电离。如下图。 过 程：强电场(电极间距0.5-2mm)分子电子的量子隧道效应*分子热分 解或碰撞带正电荷的碎片离子阳极排出并加速进入磁场 *量子隧道效应(Quantum mechanical tunneling): 分子电子被微针“萃出”，分子本身 很少发生振动或转动，因而分子不过多碎裂。 电极要求：电极尖锐，使用微碳针(W丝上的苯基腈裂解生成)构成多尖陈列电 极可提高电离效率。 特 点：电离温和，碎片少，主要产生分子离子M+和(M+1)+峰。 d) 场解吸源(Field desorption, FD) 类似于场电离源，它也有一个表面长 满“胡须” (长0.01mm)的阳极发射器 (Emitter)。 过 程：样品溶液涂于发射器表面-蒸发 除溶剂强电场分子电 离奔向阴极引入磁场 特 点：特别适于非挥发性且分子量高的 物质 离子峰和准分子离子峰，谱图最 为简单。 EI FI FD e) 火花源(Spark)： 针对金属合金属或离子残渣样品等非挥发性无机物的分析，类似于AES 中的激发光源。 过 程：30kV 脉冲电压-火花-样品局部高热-元素蒸发-原子或离子- -经加速进入磁场进行分离 特 点：元素分析灵敏度高，可分析复杂样品(60种元素)、谱图简单、线性范 围宽。 f) 快原子轰击(Fast atom bombardment, FAB) 过 程：高速电子惰性气体电离电场加速高速原子离子束撞 击涂有样品的金属板能量转移给样品分子电离引入磁场分离。 质量分析器 铜针探头 探针 二次离子 狭缝 原子束 样品层 FAB： 4. 质量分析器 作用是将不同碎片按质荷比m/z分开。 质量分析器类型：磁分析器、飞行时间、四极杆、离子捕获、离子回旋等。 1）磁分析器 单聚焦型(Magnetic sector spectrometer)：用一个扇形磁场进行质量分析的质谱 仪。 带电离子质量分析器，在磁场(场强为B)作用下，飞行轨道弯曲(曲率半径为 r)。当向心力 Bev 与离心力 mv2/r 相等时，离子才能飞出磁场区，即， e为电子电荷；U为加速电压。 由于 （电场加速）,将上式带入得， 当B、r、U三个参数中任两个保持不变而改变其中一个参数时，可得质谱 图。 (a) 固定B和U，改变r，即通过移动检测器狭缝位置来收集不同r处的离子或以感光板 照相技术记录的不同m/z的离子质谱仪（mass spectrograph）； (b) 现代质谱仪通常是保持r不变，通过扫描电场U或磁场B，使不同m/z离子依次通过 固定狭缝来获得质谱图质谱计（Mass Spectrometer)。 单聚焦质量分析器只是将 m/z 相同而入射方向不同的离 子聚焦到一点（或称实现了方 向聚焦）。 但对于m/z 相同而动能（ 或速度）不同的离子不能聚焦 ，故其分辨率较低，一般为 5000。 下图是单聚焦型质量分析器更直观地的工作过程。 特点：结构简单，操作方便。但是分辨率低 双聚焦型(Double focusing mass spectrometer) 为克服动能或速度“分散”的问题，即实现所谓的“速度(能量)聚焦”， 在离子源和磁分析器之间加一静电分析器（ESA），如下图所示，于两个扇形电 极板上加一直流电位Ve，离子通过时的曲率半径为re=U/V，即不同动能的离子re 不同，换句话说，相同动能的离子的re相同-能量聚焦了！ 然后，改变V值可使不同能量的离子从其“出射狭缝”引出，并进入磁分 析器再实现方向聚焦。双聚焦质量分析器可高达150,000! 思考：为什么双 聚焦仪比单聚焦 仪有更高的分辨 率？ 原理：能量聚焦 方向聚焦 磁偏转 特点：高分辨率 ，但是 操作复杂 2）飞行时间分析器(Time of flight, TOF) 过 程：不同荷电碎片在飞出离子源的速度（动能）基本一致。某离子在 到达无场漂移管前端时， 其速度大小为： 到达无场漂移管末端的时间为： 不同离子通过同一长度为L的无场漂移管，所需时间相差： 由于不同m/z的离子，其飞出漂移管的时间不同，因而实现了离子的分离 。因为连续电离和加速使检测器产生连续输出而不能得到有效信息，因此实 际工作中常采用相同频率的电子脉冲电离和脉冲电场加速，被加速的粒子经 不同的时间到达收集极上，并反馈到示波器上记录，从而得到质谱图。 初始能量相同的带电原子或者带电分子，漂移一段固定的路程所用的 时间与它本身的质量有关。测定漂移时间的差别，即可对不同质量的 离子进行鉴别。 特 点：扫描速度快(1000幅/s)，可用于研究快速反应或与GC联用；可用于高质量离子分 析；体积小，操作容易；分辨率比磁分析器稍差。 过程：四极滤质器由四根平行的金属 杆组成，其排布见右图所示。被加速 的离子束穿过对准四根极杆之间空间 的准直小孔。通过在四极上加上直流 电压U和射频电压Urf，在极间形成一 个射频场，离子进入此射频场后，会 受到电场力作用，只有合适m/z 的离 子才会通过稳定的振荡进人检测器。 改变U和V并保持U/V比值一定， 可实现不同m/z离子的检测。 特点：分辨率比磁分析器略低 (max.2000); m/z范围与磁分析器相 当；传输效率较高；扫描速度快，可 用于GC-MS 联用仪。 3）四极滤质器(Quadrupole mass filter) 4）离子阱(Ion trap analyzer) 过程： 上下端罩(End cap)与左右 环电极(Ring electrode)构成 可变电场(前者接地，后者施以 射频电压)带电离子在一定 轨道上旋转改变电压 可使相同m/z离子依次离开并进 入电子倍增器而分离。 特点： 结构简单、易于操作、GC- MS联用可用于m/z200-2000的分 子分析。 离子阱的横截面图 过程： 处于磁场B中离子回旋离子 吸收与B垂直的电场能量当离子能量 和吸收能量相等共振切断交变 电场回旋离子在电极上产生感应电 流感应电流衰减记录该信号 通过Fourier变换将时域图转换为频域 图(质谱图)。 特点： 可用于分子反应动力学研究、扫描 速度快，可与GC 联用、分辨率高、分析 质量大、但仪器昂贵。 5）离子回旋共振分析器(Ion cyclotron resonance, ICR) 4、检测器 包括Faraday杯、电子倍增器、闪烁计数器、照相底片等 1) Faraday 杯 下图是Faraday杯结构原理图 特点：可检测10-15A的离子流，但不适于高加速电压下的离子检测。 2）电子倍增器：类似于光电倍增管，可测10-18A电流。但有质量歧视效应。 3）闪烁计数器：记录离子的数目。 思考：电子倍增器与光电倍增管有何区别？ 三、质谱图 1.质谱图 以质荷比m/z为横座标，以对基峰(最强离子峰，规定相对强度为100%) 相对强度（或称丰度，abundance）为纵座标所构成的谱图，称之为质 谱图。 2.质谱峰类型 分子在离子源中可产生各种电离，即同一分子可产生多种离子峰：分 子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、重排离子峰、亚稳离子峰等。 设有机化合物由A，B，C和D组成，当蒸汽分子进入离子源，受到电子 轰击可能发生下列过程而形成各种类型的离子： 分子离子 碎片离子 重排裂解 碰撞裂解 1）分子离子峰 ABCD+为分子离子峰，m/z即为分子的分子量。对于有机物，杂 原子S，O，P，N等上的未共用电子对最易失去，其次是电子，再其次 是 电子。 2）碎片离子峰 因分子发生键的断裂只需要十几电子伏特的能量，而电子轰击 的能量为70eV，因而会产生更小的碎片离子峰。 断裂方式可分为均裂、异裂和半异裂（ 表示电子）： 均裂半异裂异裂 四、质谱的应用 v相对分子质量的测定 利用分子离子峰的m/z可准确地确定该化合物的相对分子质量。一般来说， 除同位素峰外，分子离子峰一定是质谱图上质量数最大的峰 v化学式的确定 一般是通过同位素峰相对强度来确定有机化合物的分子式。计算同位素（ M+1）/M和（M+2）/M强度百分比，再结合其它规律，确定化合物的化学 式。 v结构式的确定 确定化合物的相对分子质量及分子式，计算不饱和度，根据分子离子峰和高 质量碎片离子峰之间的m/z差值，找到分子离子可能脱掉的中性分子或自由 基，推导分子结构类型。 五、质谱技术在蛋白质鉴定中的应用 质谱技术可快速准确地获取蛋白质的一级结构信息 通过质谱仪(mass spectrometer)测量蛋白质样品的质量 信息(质量与电荷的比值)， 获得样本的质谱信息； 据此进行计算分析和推理，来获得蛋白质的一级结构信息 。 蛋白质的质谱分析中离子化方式 v电喷雾离子化 Electrospray Ionisation (ESI) v基体辅助激光解吸离子化 Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) 电喷雾离子化 电喷雾离子化 (ESI)是大气压离子化(API)技术的一种，能够很好地分析分子量为小 至小于100 Da的小分子 和大至大于1,000,000 Da 的大分子。 在标准的电喷雾离子化中，样品被溶解在极化的挥发性的溶剂中，并被以1 L/min 到1 mL/min之间的流动速度泵进一个狭窄的无污染的毛细管。 在位于离子源的毛 细管喷嘴加上3到4kv的高压电。在这种高能电场作用下，从毛细管喷嘴喷射出来的 样品被驱散成电荷集中的小液滴，这是一个伴随着半自动的注入毛细管周围的同方 向的nebulising gas流的过程。 这股气流通常是氮气，能够引导液滴从毛细管喷嘴 喷射到质谱议中。在温热的氮气流（drying gas）中随着溶剂的蒸发，电荷小液滴 变得越来越来小。最后带电的离子化样品分子冲破小液滴而从溶剂中游离出来，其 中有些分子就进入样品采集小锥或小孔（sampling cone or orifice）穿过中间真空 区域，然后穿过过滤小孔进入高度真空的分析器。电压透镜会对每个不同样品分子 进行测量。 流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气 帘；气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子 基体辅助激光解吸离子化 基体辅助激光解吸离子化(MALDI)能够很好的处理那些热敏感或不挥发的化合物， 特别是高分子量的生物大分子，并且成功应用于生物化学中的蛋白质，氨基酸，糖 蛋白，低聚糖，寡核苷酸等分析领域。质量精确度取决于质谱议分析器的工作方式 ，但许多现用仪器多样品中分子质量的测量都能达到0.01%的精度，测量范围在 40,000 Da以上。 MALDI是基于用激光对样品分子光激发使其离子化。样品溶液预先以低浓度与高 吸收的基质均匀混合，基质分子能有效的吸收激光的能量进入激发态，使基质分子 和样品分子从混合物表面进入气相并得到电离。这种能量的吸收是非常有效的，并 且使得分析物不会吸收过多的能量而被完全分解。现在使用的商业化的MALDI质 谱议都是使用337 nm波长的氮气脉冲激光器。 分析样品被溶解在适当的挥发性溶剂中，如果是正离子的话，通常使用 trifluoroacetic acid溶解在1-2 L的浓度为10 pmol/L的钙离子溶液并与等体积的高 浓度的基质溶液混合。很多这样的复合物使用在不同的基质混合物中：芥子酸经常 用于蛋白质的分析；而 则通常用于缩氨酸的分析。抽取1 -2 L的最后配成的样品混合液经过干燥预处理后注入高真空的质谱议中。激光激 发后，能量顺利到达基质复合物晶体的表面，然后数据开始累积，直到收集到合适 的质谱亮度为止。飞行时间分析器通过测量不同质荷比(m/z)的离子穿过飞行，漂 移，或管子等自由区域所用的时间而将离子分开。离子越大，飞行时间越长。 Matrix - CHCA H H MatrixMatrix Protein/PeptideProtein/Peptide Time of FlightTime of Flight337 nm Laser337 nm Laser MALDI是一种软离子化技术，不管肽分子质量有多大，一般只会产生只带一个单位 电荷的离子，因此给出的图谱也比较容易解析。样品离子的分裂一般不会发生。 在正离子化过程中，亲质子的离子(M+H+)是主要离子源，虽然当中夹杂着某些盐类 分子，或带两个正电荷的离子使得 m/z减半，或二聚体物质使得m/z增加一倍。正离 子化一般的蛋白质或缩氨酸的分析中都能使用。 负离子化过程中，疏质子的离子(M-H-)占多数，同样也夹杂着二聚体或双倍电荷的 盐类分子。这种离子化方式通常用在寡核苷酸或低聚糖的分析中。 Simplified schematic of MALDI-TOF mass spectrometry (linear mode) 质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法： 第一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学 水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将 所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取 待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。 第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过 分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子 碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂. 第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从 端或端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系 列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的 质量差知道相应氨基酸残基。 串联质谱鉴定蛋白质方法 串联质谱：两个或更多的质谱连接在一起，称为串联质谱。最简单的 串联质谱（MS/MS）由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器 （MS1）将离子预分离或加能量修饰，由第二级质量分析器（MS2） 分析结果。 最常见的串联质谱为三级四极杆串联质谱。第一级和第三级四极杆分 析器分别为MS1和MS2，第二级四极杆分析器所起作用是将从MS1得 到的各个峰进行轰击，实现母离子碎裂后进入MS2再行分析。现在出 现了多种质量分析器组成的串联质谱，如四极杆-飞行时间串联质谱（ Q-TOF）和飞行时间飞行时间（TOF-TOF）串联质谱等，大大扩展 了应用范围。离子阱和傅里叶变换分析器可在不同时间顺序实现时间 序列多级质谱扫描功能。 MS/MS最基本的功能包括能说明MS1中的母离子和MS2中的子离子 间的联系。根据MS1和MS2的扫描模式，如子离子扫描、母离子扫描 和中性碎片丢失扫描，可以查明不同质量数离子间的关系。母离子的 碎裂可以通过以下方式实现：碰撞诱导解离，表面诱导解离和激光诱 导解离。不用激发即可解离则称为亚稳态分解。 利用串联质谱鉴定蛋白质通常有三种方法: n1) 查询蛋白质序列数据库. 这是目前鉴定蛋白质最常用的方 法. n2) 从头测序(de novo peptide sequencing). 针对数据库 里没有的新蛋白或发生翻译后修饰等情况的蛋白质, 不依赖 数据库而直接利用质量较好的串联质谱推理获得序列信息. n3) 首先用从头测序方法获得高可信度的序列片段(tag), 然 后利用这些片段辅助查询蛋白质数据库, 是前两种方法的结 合. 串联质谱(MS-MS)具有多个分析器可以用于结构分析和序列测定。两个、三个甚 至四个分析器已被组合成商业化的串联设备；而且组成的分析器不一定就是同一 个类型，可以是几个不同类型杂合体。使用得较多的串联质谱包括quadrupole- quadrupole, magnetic sector-quadrupole , 以及近来新发展的the quadrupole-time- of-flight 。 串联质谱 Tandem (MS-MS) mass spectrometers Peptide Sequencing by MS/MS y4 y1 y2 y3 q2 + On-line separation q1 Survey scan (mass spectrum) (MS1) MGLAAAVFTK 2+ y1 + + + Tandem mass spectrum (MS2) TOF GLAAAVFTK+ LAAAVF TK+ AAVFTK+ FTK+ K+ OR 电喷射电离串联质谱分析肽序列 v串联质谱法允许蛋白质离子在两台串联在 一起的质谱仪上进行分析。第一台质谱仪 （MS-1）用于从蛋白质水解液中分离寡肽 ，然后选出每一寡肽（P1、P2或P3等）进 行下一步分析。在第二台质谱仪（MS-2） 的途中，选出的寡肽于碰撞池通过与氮气 或氩气分子碰撞裂解成离子碎片（F1、F2 、F3等），这些碎片被吸引入第二台质谱 仪分析。 v裂解主要发生在寡肽中连接相继氨基酸的 肽键上。因此产生的碎片代表一套大小只 差一个氨基酸残基的肽段。这样的两个碎 片相对分子质量之差为56（肽主链NH-CH- CO的质量）加被裂解掉的那个残基R基的 相对分子质量，其范围从1（Gly）到130（ Trp）。由于这个差值是各个氨基酸的特征 值（残基质量），因此可以根据整套离子 碎片的质量差来推定氨基酸序列。 2DE-MS 进行蛋白组分析 蛋白质鉴定的算法（ Sequest ） n用串联质谱查询数据库鉴定蛋白质的核心部分是实验串联质谱与 理论串联质谱的匹配打分算法. 理论串联质谱是通过对数据库中的 蛋白质序列做模拟酶解，然后从酶解产生的肽序列预测生成的， 当前使用的理论串联质谱预测模型还是非常简单的。常用鉴定软 件中使用的匹配打分算法有Sequest软件的互相关(cross correlation)分析和Mascot软件的基于概率的打分算法等。 nSequest是1995年由John Yates和Jimmy Eng引入的使MS- MS数据与数据库序列匹配以鉴定蛋白质的第一个算法。 Sequest这类程序的价值在于能相对快速地将MS-MS谱图指定到 数据库中特定的肽序列，这使得蛋白质组学分析中的LC-MS-MS